Framtida möjligheter för blodgruppsgenomisk typning Åsa Hellberg BMA, PhD BMA, PhD Klinisk immunologi och transfusionsmedicin Labmedicin Skåne
Blodgruppssystem Table 1. Blood group systems according to ISBT classification guidelines. Carbohydrate blood group systems are marked in grey. No. System name System Gene Antigens Chromosomal symbol name(s)* location CD number 001 ABO ABO ABO 4 9q34.2 002 MNS MNS GYPA, GYPB, GYPE 46 4q31.21 CD235 003 P1PK P1PK A4GALT 2 22q13.2 CD77 004 Rh RH RHD, RHCE 59 1p36.11 CD240 005 Lutheran LU LU 22 19q13.32 CD239 006 Kell KEL KEL 35 7q34 CD238 007 Lewis LE FUT3 6 19p13.3 008 Duffy FY DARC 6 1q23.2 CD234 009 Kidd JK SLC14A1 3 18q12.3 010 Diego DI SLC4A1 22 17q21.31 CD233 011 Yt YT ACHE 2 7q22.1 012 Xg XG XG, MIC2 2 Xp22.33 CD99 013 Scianna SC ERMAP 7 1p34.2 014 Dombrock DO ART4 4 12p12.3 CD297 015 Colton CO AQP1 7 7p14.3 016 Landsteiner- Wiener LW ICAM4 7 19p13.2 CD242 017 Chido/Rodgers CH/RG C4A, C4B 7/2 6p21.3 018 H H FUT1 1 19q13.33 CD173 019 Kx XK XK 1 Xp21.1 020 Gerbich GE GYPC 12 2q14.3 CD236 021 Cromer CROM CD55 16 1q32.2 CD55 022 Knops KN CR1 9 1q32.22 CD35 023 Indian IN CD44 4 11p13 CD44 024 Ok OK BSG 3 19p13.3 CD147 025 Raph RAPH CD151 1 11p15.5 CD151 026 John Milton Hagen JMH SEMA7A 6 15q24.1 CD108 027 I I GCNT2 1 6p24.2 028 Globoside GLOB B3GALNT1 1 3q25.1 029 Gill GIL AQP3 1 9p13.3 030 Rh-associated glycoprotein RHAG RHAG 3 6p21-qter CD241 300 antigen SNP= Single Nucleotide Polymorphism tex T>A
Indikationer för genomisk typning oberoende analys vid oklara resultat t.ex. vid ABO eller Rh gruppering alternativ till fenotypning om patienten har fått blod (s.k. transfusionsblandbild) eller är positiv med direkt agglutinationsteknik (DAT) Thalassemi / Sickle cell bekräftelse av homozygoti hos: * givare av testerytrocyter, * den blivande pappan för att bedöma risken att fostret kommer att ärva antigenet som mamman är immuniserad mot. bestämning av fosterblodgrupp foster till immuniserad, gravid kvinna foster till RhD neg, gravid kvinna alternativ när blod ej finns
Givartypning Serologi Tidskrävande Kostsamma reagens Icke tillgängliga reagens Typas CcEeK Matchas K neg till fertila kvinnor Vid antikroppar Önskvärt Storskalig automatiserad typning som medger matchning thi mottagare givare till låg kostnad och med kort hands on time Resultat Färre immuniseringar Rätt blod snabbare The right blood to the right person at the right time
Vanliga metoder PCR RFLP 5' SNP T/C 3' PCR ASP Genspecifika primers Realtids PCR allel A oklippt FY YB/FYB FYA YA/FYB FY YB/FYB FYA YA/FYB YA/FYA YA/FYA T Allelic Discrimination allel l B C
Vanliga metoder PCR RFLP PCR ASP Realtids PCRl K1 ASP SNP 5' T/C K2 ASP Allelspecifik l primer M 1 2 3 4 5 6 Internkontroll 3' Allelic Discrimination
Vanliga metoder PCR RFLP PCR ASP Forward R Q primer 5 3 5 5 Reverse primer 3 5 Realtids PCR Allelic Discrimination
Vanliga metoder PCR RFLP PCR ASP P 2 P 2 Realtids PCRl Controls P 1 P 1 P 1 P 2 Allelic Discrimination
Sverige Stockholm: Screen fetalt RHD realtids PCR Lund: ABO, RH, FY, JK, MNS, KEL, FUT1/2, P1PK, GLOB PCR SSP, PCR RFLP, realtids PCR och AD Övriga Norden Köpenhamn: Fetalt RHD/RHc, RH, KEL, ABO, HPA realtids PCR, BAGene Nationell screening införd i: Danmark (flera orter) Holland (Amsterdam) Länder på gång: England (Bristol) Norge Sverige? Århus: ABO, RH, HPA, FY, JK, KEL PCR SSP BAGene, In house TaqMan chemistry, Oslo: RH, DO, HPA realtids PCR
Sverige Stockholm: Screen fetalt RHD realtids PCR Luminex ID Core och ID HPA Lund: ABO, RH, FY, JK, MNS, KEL, FUT1/2, P1PK, GLOB PCR SSP, PCR RFLP, realtids PCR och AD Övriga Norden Köpenhamn: Fetalt RHD/RHc, RH, KEL, ABO, HPA realtids PCR, BAGene Århus: ABO, RH, HPA, FY, JK, KEL PCR SSP BAGene, In house TaqMan chemistry, Open array Odense: Bloodchip ref ID Core och ID HPA Oslo: RH, DO, HPA realtids PCR, snart fetal screening Helsingfors: Luminex ID Core och ID HPA
Microarrays (kallas även mikromatriser eller mikrochips) Expressions (cdna) arrays vanligast Hög eller lågdensitets chips beroende på spotting upplösning etc Kan t.ex. användas för att undersöka hur mycket gener uttrycks i normal och cancervävnad Inte aktuellt för blodgruppering SNP arrays Oligonukleotider som inkluderar den polymorfa nukleotiden av intresse Fångar (blodgrupps ) SNPs Protein arrays Målproteinet sitter på chipset Fångar (blodgrupps ) antikroppar Glykan arrays y Målsackariden sitter på chipset Fångar (blodgrupps ) antikroppar
Vad finns på marknaden? Företag Plattform Antal Analystid CE antigen prov/tim Bloodchip Progenika glas 128* 20/10 x ID CORE+ Progenika beads/luminex 33 48/5 x ID CORE ID HPA 23 12 GenomeLab Beckman Coulter 384 hålsplatta 19 384/36 SNPstream Beadchip BioArray Solutions/Immucor beads 32 96/ 5 x *inkl HPA modifierad från Veldhuisen B, Vox Sang. 2009 Oct;97(3):198-206
Bloodchipv4.0 40 Detekterar ABO, RH, KEL, JK, FY, MNS, DI, DO, CO, HPA Totalt 128 SNPs Fördelar CE märkt för alla antigen Nackdelar Specialutrustning Dyr
Hur fungerar det? Komplementära oligonukleotidprobes tillverkas och sätts fast på ett mikroskåpglas Många replikat av samma oligo Kapacitet >3000 spots Oligonucleotide probes Glas
Hur fungerar det? Multiplex PCR Klyvning Inmärkning Hybridisering Avläsning med en scanner + Ett program analyserar datan och ger genotypsresultat med predikterad fenotyp
ex BloodChip Microarray
Luminex XMAP (Multi Analyte( Profiling) fluidic microarry system Detekterar ABO, RH, KEL, JK, FY, MNS, DI, DO, CO, HPA Totalt: ID Core 23 antigen Fördelar ID Core+ 33 antigen ID HPA 12 antigen CE märkt Plattform för många andra analyser Kapacitet 2x96 prov /dag Nackdelar Mycket hands on tid Filterplattor
Beckman Coulter GenomeLab SNPstream Detekterar RH, MNS, KEL, FY, JK, DI, HPA totalt 19 antigen Fördelar/kapacitet 4600 800 000 SNP/dag Nackdelar Kräver specialutrustning Dyr Används HemaQuebec (20 000 givare typade, Perrault et al Vox Sang 2009)
HEA BeadChip Detekterar CO, DI, DO, FY, JK, LU, MNS, SC, LW, RHD HbS Totalt 24 alleler/32 antigen Fördelar CE märkt ej för RHD/HPA Fungerar med låg konc. av DNA (poster ASH 2010, Lin et al.) Kapacitet 96 prov/5 timmar Nackdelar Kräver specialutrustning Dyr Används USA
BeadChip Bead Functionalization 4,000 ENCODED BEADS 0.3 mm Bead Synthesis & Encoding Pooling Array Assembly BeadChip http://www.immucor.com/bioarray/html/technology_overview.html Wafer
Analys Chip Analysis Bar Chart DNA Analysis\ Δ Chart (for each probe pair) SNP = FY-GATA ( FY -33T>C) AA "AB "BB
Fenotyp ChipName Sample WarnMsg c C e E K k Fya Fyb Jka Jkb M N S s Lua Lub Doa Dob Jo(a) Hy LWa LWb Dia Dib Coa Cob Sc1 Sc2 HgbS Silencing FY ) Fyx[Fy(b+w) Cmmnt HEA04961_11 A1 + - + - + + - + - + + + - + - + + + + + + - - + + - + - - 1 No HEA04961_2 A2 + - + - - + + + + - + + - + - + + + + + + - - + + - + - - No No HEA04961_3 A3 + - + - - + + - + + + - - + - + - + + + + - - + + - + - - 1 No HEA04961_4 A4 + - + - - + - - + + + - - + - + - + + + + - - + + - + - + 2 1 HEA04961_5 A5 + - + - - + - - + + - + + + + + - + + + + - - + + - + - - 2 No HEA04961_6 A6 - + + - - + + - + + - + - + - + + + + + + - - + + - + - ++ 1 No HEA04961_7 A7 - + + - - + + - + + - + - + - + + + + + + - - + + - + - - No No HEA04961_8 A8 - + + - - + - - + - + - - + - + + + + + + - - + + - + - + 2 No
TaqMan OpenArray Genotyping Instrument Platform Detekterar TaqMan SNPGenotyping Assays Custom TaqMan SNP Genotyping Assays Fördelar Kräver liten volym Snabb 256 SNPs i 1500 prov /dag Lågt pris/ analys Kundanpassas Nackdelar Specialutrustning
Andra möjligheter Maldi TOF MS(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry) Kan detektera skillnader på en nukleotid Metoder för HPA och KEL (fetal diagnostik) publicerade Inga kommersiella aktörer? Next generation sekvensering Mycket utvecklingsbart område Måste förenklas
Risker falskt negativa (givare) orsakas av primer eller probes ej binder in pga en mutation kliniska studier (Bloodchip) visar att de är väldigt få falskt positiva (mottagare) kan orsakas av null alleler Problem
Önskvärt Storskalig automatiserad typning som medger matchning mottagare givare till låg kostnad och med kort hands on time Mjukvara som behandlar, överför till labsystem och väljer blod Markör för vem som är benägen att bilda antikroppar Plattformar som kombinerar virusdetektion, antikroppsdetektion, pp och antigen/gen detektion
Referenser Technologies involved in molecular blood group genotyping F. Monteiro et al. ISBT Science Series(2011) 6, 1 6 Blood group genotyping: from patient to high throughput donor screening B. Veldhuisen et al. Vox Sanguinis (2009) 97, 198 206 Noninvasive genotyping fetal Kell blood group (KEL1) using cell free fetal DNA in maternal plasma by MALDI TOF mass spectrometry Y.Li et al. Prenat Diagn 2008; 28: 203 208 Tack!
Discrimination med allele specific elongation MATCH T G C T A G T T C T A A C G A T C A A G A T G Assay Image MISMATCH X A C G A T C G C T A T A C G T A A T G DNA Polymerase emap
Avläsning Decoding Image Automated Snapshot Array Imaging Assay Image