Analys av NK-cellers migration och interaktion med målceller

Analys av NK-cellers migration och interaktion med målceller Tobias Everhorn 8912 tev@kth.se Alexander Rivera Ahlin 89121 alra@kth.se SA14X- Kandidatexamensarbete Institutionen för tillämpad fysik, KTH, Kungliga Tekniska Högskolan, 144 Stockholm, Sverige. 13 Maj 213 Handledare: Björn Önfelt Examinator: Mårten Olsson

Sammanfattning Denna rapport kommer att redogöra för NK-cellers (Naturliga mördarceller) beteende vid odopat tillstånd. Det vi kallar dopning är när NK-celler aktiveras genom interleukin-2, detta är en signalerande molekyl i vårt immunsystem som reglerar aktiviteten hos vita blodkroppar vilka utgör en del av immunförsvaret. Med hjälp av ett par mikroskopfilmer har vi kunnat följa varje enskild NK-cells migration(rörelse) och interaktion med våra målceller i ett prov under en 8-timmars period. De målceller vi använder är en sorts tumörceller, HEK 293T(Human embryonic kidney 293T cells. Vi har valt att spåra cellerna manuellt med ett program kallat ImageJ och automatiskt med ett matlabprogram, Baxter algorithm. Anledningen till att vi dessutom valt att spåra automatiskt är för att kunna avgöra hur väl detta program kan spåra celler. Sedermera har vi beräknat alla cellers hastigheter, både medelhastigheter och hastigheter de har i olika tillstånd. Slutligen har vi kunnat jämföra våra odopade NK-celler med en uppsättning av väsentligt mer aktiva(dopade) NK-celler. Det första vi konstaterade är att våra odopade NK-celler endast dödade ett par tumörceller. Vilket fick oss att lägga vårt fokus på analys som inte berör det. Vi fann att det t.ex. existerar klara fördelningar av hastigheten, både för medelhastigheten och hastigheten de har i olika tillstånd. Definitionen av tillstånden är kort sammanfattat i del 2.3.1 med referens för exakt definition. Liknande resultat har vi fått fram gällande interaktionsanalysen. Vidare har vi kommit fram till att automatisk spårning med hjälp av ett speciellt dataprogram inte är optimalt när man har ett litet prov, men att det kan vara användbart vid analys av stora mängder data när manuell spårning är ineffektivt. Däremot anser vi att det kräver ett reproducerbart experiment med hållbar bildkvalité. Det bör även nämnas att Baxter algorithm är ett program som ursprungligen skapades för att spåra stamceller. Jämförelsen mellan de odopade och dopade NK-cellerna gav oss att fördelningarna i hastigheter skilde sig. Majoriteten av de odopade cellernas medelhastigheter låg inom ett mindre intervall, 1.-2.2 µm/min, och de dopade cellernas inom ett större intervall,.6-2.6 µm/min. Det kan bero på skillnaden i antal celler i de olika proven och att det är osäkert hur många av cellerna som reagerat på IL-2.

Innehållsförteckning 1. Inledning 2 2. Metod 3 2.1. Manuell spårning av NK-celler......................... 3 2.2. Automatisk spårning av NK-celler....................... 3 2.3. Analys av odopade NK-celler.......................... 3 2.3.1. Migrationsanalys.............................. 3 2.3.2. Interaktionsanalys............................. 5 2.4 Jämförelse mellan odopade NK-celler och dopade NK-celler......... 5 3. Resultat 5 3.1 Manuell spårning av NK-celler.......................... 5 3.2 Automatisk spårning av NK-celler........................ 1 3.3 Jämförelse mellan odopade NK-celler och dopade NK-celler.......... 12 4. Diskussion och slutsatser 19 4.1. Jämförelse mellan manuell och automatisk spårning.............. 19 4.2. Analys av odopade NK-celler.......................... 19 4.3. Jämförelse mellan odopade och dopade NK-celler............... 2 5. Referenser 21 1

1. Inledning Upptäckten av NK-cellen en relativt ny upptäckt. Det var tidigt 197-tal då man började upptäcka naturlig mördaraktivitet i flera olika arter och bekräftade existensen av en cell med högst intressanta egenskaper, att den t.ex. kan oskadliggöra tumörceller. NK-cellen klassas idag som en lymfocyt vilket är en typ av vita blodkroppar. Den är en del av det ospecifika immunförsvaret.[1] Den mest intressanta egenskapen för vår del är att den kan oskadliggöra tumörceller. Det här är ett område där det idag aktivt bedrivs forskning. När man studerar NK-celler brukar man aktivera dem med en signalmolekyl IL-2, Interleukin-2, som reglerar aktiviteten för vita blodkroppar. Detta kallar vi dopning. Ofta sker forskningen på dopade NK-celler därför att deras dödlighet är mycket högre. Vårt fokus har istället legat på hur odopade NK-migrerar och interagerar och vilka slutsatser vi kan dra från det. Det material som tillhandahölls för att undersöka detta var två mikroskåpfilmer över NK-celler och tumörceller av typen HEK 293T, Human embryonic kidney 293T cells. NK-cellerna förbereds inför experimentet genom flourescensmarkering (orange/röd för NKceller och grön för tumörceller) samt sorteras in i ett kiselchip med olika brunnar. Brunnarna är ungefär 3 mikrometer djupa och dess funktion är att hålla cellerna på plats. För att experimentet ska vara realistiskt ser man till att förhållandet överensstämmer med det i människokroppen, vilket innebär en koldioxidhalt på 5 % och en temperatur på 37 grader Celsius. Det primära målet är att granska hur deras egenskaper och effektivitet som mördare är kopplad till deras migration, och att jämföra de resultat vi får med dopade NK-celler. En annan av frågeställningarna var om automatisk spårning är realistiskt och användbart. 2

2. Metod 2.1. Manuell spårning av NK-celler Två stycken mikroskopfilmer tagna i.lsm-format och omvandlade till.avi-format, var materialet som tillhandahölls vid start och som arbetet baserar sig på. Filmerna har 24 respektive 228 bilder där en bild är tagen varje 2 respektive 2,1 min. Varje cells koordinat antecknades vid varje bild under hela sekvensen för att kunna få ut hela dess bana. Dessa koordinater användes för att beräkna bl.a. medelhastigheter. Det program som använts är ett bildhanteringsprogram kallat ImageJ med ett visst plugin, manuell spårning. 2.2. Automatisk spårning av NK-celler Det primära målet för den automatiska spårningen var att undersöka hur väl programmets spårning överenstämde med de manuella spåren. Dels undersöktes hur väl spåren överensstämmer med manuellt framtagna spår och dels hur medelhastigheterna överensstämde med dem beräknade från de manuella spåren. Det program som användes var Baxter Algorithm[2], vilket är ett spårningsprogram från början var avsett för att spåra stamceller. Notera att vi endast tillämpar automatisk spårning på en av våra två filmer. 2.3. Analys av odopade NK-celler Nästan alla resultat och all analys genomfördes med självskrivna matlabprogram som läser in all data från excelfiler, dvs. spår och interaktionsdata, och utför några specifika beräkningar. Då det är stora mängder kod så utelämnas en exakt förklaring på hur varje kod fungerar utan den förklaras istället övergripande. Resultaten som matlabprogrammen genererade presenteras i olika diagram i resultatdelen. Det första som konstateras är att NK-celler nästan aldrig dödade de tumörceller de fick kontakt med. Alla 97 celler som spårades dödade tillsammans endast ett par tumörceller och därför finns inte möjligheten att göra någon egentlig analys rörande dem. Vid beräkning av medelvärden väljer vi ett 95% konfidensintervall och antar att det är normalfördelat. För det använder vi vanligt aritmetiskt medelvärde, formel 1, och beräknar standardavikelsen med formel 2 och beräknar sedan konfidensintervallet med formel 3.[3] (1) x = n i= x i n (2) σ = n i= (x i x) 2 n (3) I = ±Z σ n (Z fås ur tabell för normalfördelningen, 1.96 för 95% konf.intervall)[4] 2.3.1. Migrationsanalys Då en cells migration undersöktes så delades dess bana in i tre olika tillstånd: TMAP(transient migration arrest periods), direkt rörelse och slumpad rörelse. TMAP innebär att cellen stannar eller har lite migration t.ex. om den kretsar runt en tumörcell eller är i kontakt med en. Direkt rörelse är när cellen färdas ett längre avstånd, rakt och snabbt. Slumpad rörelse är allt resterande. För att ta reda på när varje cell var i TMAP, direkt rörelse och slumpad rörelse 3

användes ett matlabprogram, getmovement[5]. Det är skrivet med samma definitioner som används i artikeln[6]. Ett exempel på hur det kan se ut med dessa definitioner av TMAP, direkt rörelse och slumpad rörelse kan man se i figur 1 med färgkodning som följer, TMAP=RÖD, direkt rörelse=grön, slumpad rörelse=blå. y Figur 1. En cells uppritade bana med indelning i TMAP(röd)/direkt rörelse(grön)/slumpad rörelse(blå). Enheterna på koordinataxlarna är mikrometer. Först bestämdes medelhastigheten för varje cell. Genom att beräkna hastigheten mellan varje punkt i en cells bana, beräkna medelvärdet av dem och ange detta som den cellens medelhastighet. Slutligen delades hastigheterna upp i ett histogram. Dessutom beräknades hur många gånger varje cell går in i de olika tillstånden. För att göra detta användes ett egenskrivet program som går igenom varje cells koordinater och kollar när cellen byter tillstånd och noterar varje gång en ny TMAP, direkt rörelse eller slumpad rörelse startar. Därutöver kollades alla hastigheter i TMAP, direkt rörelse och slumpad rörelse. Eftersom data om alla cellers hastigheter mellan alla punkter fanns tillgänglig tog vi ut hastigheterna för de punkter som är i de olika tillstånden. Med hjälp av dessa data beräknades även hur stor andel av tiden varje cell är i de olika tillstånden. Den sista analysen som gjordes i denna del var att kolla hur medelhastigheten för en cell påverkas av hur mycket den är i de olika tillstånden. Vilket implementerades genom att identifiera vilka celler som låg inom vilket intervall, - 1%, 1-2% upp till 9-1%. För att sedan beräkna medelhastigheten av alla celler inom ett intervall och ta medelhastigheten av dem. x 4

2.3.2. Interaktionsanalys Den undersökningen som gjordes var att kolla hur många kontakter varje cell hade och hur länge kontakterna varade. Varje cells bana gicks igenom och det noterades varje gång NKcellen var i kontakt med en tumörcell med ett så kallat konjugat. Vilket vi definierat som en kontakt mellan en NK-cell och en tumörcell som upprätthållits i minst 3 bilder(ca 6 min) där utbyte mellan cellerna kan ske. Därpå skrevs ett program som räknade antal konjugat varje cell hade och hur länge varje kontakt varade. 2.4. Jämförelse mellan odopade NK-celler och dopade NK-celler En annan uppsättning av koordinater från celler som kommer från andra prover tillhandahölls till denna del. Dessa uppsättningar kommer från experiment som genomfördes på samma sätt men med dopade NK-celler och är därför mer aktiva mördare. Koordinaterna matades in i samma program som användes på de odopade cellerna för att få en bra jämförelse. Dessutom används samma metod för beräkning av medelvärden som beskrivs i 2.3. 3. Resultat I denna del presenteras de resultat som har blivit framtagna av våra matlabprogram. Eftersom det essentiella i detta projekt är all data, kommer det bli mycket figurer, diagram och medelvärden som representerar projektets resultat. 3.1. Manuell spårning av NK-celler Det skedde många konjugat trots att NK-cellerna nästan aldrig dödade tumörceller. Därför kunde det undersökas hur många konjugat varje cell hade under experimentet och hur långa kontakterna var. Från fig 2 och 3 fås att en majoritet av NK-cellerna har -7 konjugat med ett medelvärde på 2.5±.4 konjugat/cell och att kontaktlängderna är framförallt -2 min med ett medelvärde på 22.4±3.2 min. Vidare fås ur figur 4 och 5 att varje cell går in i TMAP 1-2 gånger och direkt rörelse -1 gånger. Medelvärdet för antal TMAPs/cell är 1.8±.15 och medelvärdet för direkta rörelser/cell är.76±.14. 25 Antal konjugat per cell 2 Antal celler 15 1 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Antal konjugat Figur 2. En uppdelning som visar hur många celler som har ett visst antal konjugat. 5

Antal kontakter 18 16 14 12 1 8 6 4 2 Kontaktlängd -2 2-4 4-6 6-8 8-1 1-1212-1414-1616-18 Kontaktlängd(min) Figur 3. Diagrammet representerar en uppdelning av kontaktlängderna. 7 6 TMAPs/cell 7 6 Direkta rörelser/cell 5 5 Antal celler 4 3 2 1 1 2 3 Antal TMAPs/cell Antal celler 4 3 2 1 1 2 3 4 Antal Direkt rörelses Figur 4 och 5. Antal celler med ett visst antal TMAPs/cell respektive direkta rörelser/cell. Undersökningen av alla cellers hastigheter började med medelhastigheten, figur 6. Från den figuren framgår det att medelhastigheten verkar ligga mellan 1-2 µm/min och väldigt sällan är lägre än 1 µm/min eller högre än 3µm/min. Med ett medelvärde som är1.95±.15 µm/min. Cellernas hastigheter i de olika tillstånden, TMAP/direkt rörelse/slumpad rörelse, visas i figur 7, 8 och 9 där klara fördelningar i respektive tillstånd syns. Hastigheten i TMAP är rätt strikt mellan 1.2 och 1.8 µm/min medan hastigheten i direkt rörelse är väsentligt snabbare och är mellan 3 och 5 µm/min. Hastigheten i slumpad rörelse är särskilt mellan 2.1 och 3.7 µm/min, dvs en hastighet högre än TMAP men lägre än riktad rörelse. För TMAP blir medelhastigheten 1.48±.8 µm/min, för direkt rörelse 3.89±.7 µm/min och för slumpad rörelse 2.9±.37 µm/min. 6

Figur 6. Medelhastigheter(mikrometer/minut) för alla celler uppdelade i olika intervall. Antal celler 4 35 3 25 2 15 1 5 Hastighetsfördelning i TMAP Hastighet(µm/min) Figur 7. En uppdelning av hur många celler som ligger inom ett specifikt hastighetsintervall i TMAP. 2 Hastighetfördelning i Direkt rörelse Antal celler 15 1 5 1.-2. 2.-3. 3.-4. 4.-5. 5.-6. 6.-7. 7.-8. 8.-9. 9.-1. Hastighet(µm/min) Figur 8. En uppdelning av hur många celler som ligger inom ett specifikt hastighetsintervall i direkt rörelse. 7

Antal celler 18 16 14 12 1 8 6 4 2 Hastighetfördelning i slumpad rörelse 1.7-2.1 2.1-2.5 2.5-2.9 2.9-3.3 3.3-3.7 3.7-4.1 4.1-4.5 Hastighet(µm/min) Figur 9. En uppdelning av hur många celler som ligger inom ett specifikt hastighetsintervall i slumpad rörelse. Figur 1, 11 och 12 visar hur stor del av tiden som NK-cellerna är i TMAP, direkt rörelse och slumpad rörelse. Det visade sig att TMAP är det klart vanligaste tillståndet. Celler är oftast 9-1% av tiden i TMAP medan de flesta celler är -1% i direkt rörelse och slumpad rörelse. Ur figur 13 och 14 ser man att medelhastigheten för celler går ner när andelen tid i TMAP ökar, och går upp när andelen tid i direkt rörelse ökar. Antal celler 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 TMAP-fördelning Andel av tiden i TMAP Figur 1. Antal celler som är en viss andel av tiden i TMAP. 8

Antal celler 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Direkt rörelse-fördelning Andel av tiden i Direkt rörelse Figur 11. Antal celler som är en viss andel av tiden i direkt rörelse. 5 Random-fördelning 4 Antal celler 3 2 1 Andel av tiden i slumpad rörelse Figur 12. Antal celler som är en viss andel av tiden i slumpad rörelse. Hastighet(µm/min) 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1,5-1% 1-2% 2-3% 3-4% 4-5% 5-6% 6-7% 7-8% 8-9% Andel av tid i direkt rörelse Figur 13. Medelhastigheten celler har som en funktion av hur stor andel av tiden de är i direkt rörelse. 9

Hastighet(µm/min) 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1,5 Andel av tid i TMAP Figur 14. Medelhastigheten celler har som en funktion av hur stor andel av tiden de är i TMAP. 3.2. Automatisk spårning av NK-celler Resultaten är ett histogram över hastigheten för de celler som Baxter Algorithm spårade, och en bild på spårningen av samma cell som visades i figur 1 fast med koordinater inhämtade av programmet. Medelhastigheten är framförallt mellan 1. och 2. µm/min vilket kan ses i figur 15. Dess medelvärde blir 1.64±.9 µm/min. För att kunna jämföra beräknades uppdelningen och medelvärdet för hastigheten på de celler som var i filmen vi automatiskt spårat. Hastighetsuppdelningen är i figur 16 och medelvärdet är 1.77±.12 µm/min. Med ögat som enda jämförelse kan man konstatera att banan i figur 1 och 17 är näst intill identiska, förutom att det i figur 17 lagts till en del i ena änden. Ett snabbtest i matlab, av hur många unika cellbanor programmet hittade, gav att den hade funnit 91 unika cellspår.,3,25 Medelhastighet(Automatisk spårning) Antal celler,2,15,1,5 Hastighet(µm/min) Figur 15. Medelhastigheten för de celler programmet hittat. 1

,3 Hastighet(1 film endast) Andel av alla celler,25,2,15,1,5 Hastighet(µm/min) Figur 16. Medelhastigheten för celler från en av mikroskåpfilmerna, samma film som automatiskt spårats. y x Figur 17. En cells uppritade väg med koordinater inhämtade från Baxter Algorithm, jämför med den manuella spårningen i figur 1. 11

3.3 Jämförelse mellan odopade och dopade NK-celler Vid jämförelse av dopade och odopade NK-celler fås att odopade har högre medelhastighet och majoriteten av dem är inom ett mindre hastighetsintervall än de dopade, detta kan ses i figur 18. Mer specifikt är medelvärdet för odopade och dopade 1.95±.15 respektive 1.68±.12 µm/min. Undersöker vi medelhastigheterna mer djupgående ses att hastigheterna i TMAP(figur 19), direkt rörelse(figur 2), slumpad rörelse(figur 21) är högre för de odopade i de 3 fallen än för motsvarande dopade celler, och i direkt rörelse ligger även här en majoritet av de odopade cellernas hastigheter inom ett mindre intervall än för de dopade. För de dopade cellerna är medelvärdet för TMAP 1.23±.6 µm/min, för direkt rörelse 2.8±.32 µm/min och för slumpad rörelse 2.55±.24 µm/min. Jämför de med medelvärdena för de odopade från avsnitt 3.1 i tabellen nedan. Tabell 1. Medelvärden för hastigheterna i de 3 tillstånden för odopade och dopade NK-celler TMAP 1.23±.6 µm/min 1.48±.8 µm/min Direkt rörelse 2.8±.32 µm/min 3.89±.7 µm/min Slumpad rörelse 2.55±.24 µm/min 2.9±.37 µm/min,35,3 Medelhastighet Andel av alla celler,25,2,15,1,5 Hastighet(µm/min) Figur 18. Fördelningen av cellernas medelhastigheter, för dopade och odopade celler. Hastigheter i µm/min på x-axeln och andel av alla celler på y-axeln. 12

Andel av alla celler,45,4,35,3,25,2,15,1,5 Hastighetfördelning i TMAP.2-.4.4-.6.6-.8.8-1. 1.-1.2 1.2-1.4 1.4-1.6 1.6-1.8 1.8-2. 2.-2.2 2.2-2.4 2.4-2.6 2.6-2.8 2.8-3. Hastighet(µm/min) Figur 19. Uppdelningen av cellens medelhastigheter i TMAP för odopade och dopade NKceller. Hastigheter i µm/min på x-axeln och andel av alla celler på y-axeln. Andel av alla celler,4,35,3,25,2,15,1,5 Hastighetsfördelning i direkt rörelse -.6.6-1.2 1.2-1.8 1.8-2.4 2.4-3. 3.-3.6 3.6-4.2 4.2-4.8 4.8-5.4 5.4-6. 6.-6.6 6.6-7.2 7.2-7.8 7.8-8.4 8.4-9. 9.-9.6 9.6-1.2 Hastighet(µm/min) Figur 2. Uppdelningen av cellens medelhastigheter i direkt rörelse för odopade och dopade NK-celler. Andel av alla celler,2,15,1,5 Hastighetfördelning i slumpad rörelse.5-.9.9-1.3 1.3-1.7 1.7-2.1 2.1-2.5 2.5-2.9 2.9-3.3 3.3-3.7 3.7-4.1 4.1-4.5 4.5-4.9 4.9-5.3 5.3-5.7 Hastighet(µm/min) Figur 21. Uppdelningen av cellens medelhastigheter i slumpad rörelse för odopade och dopade NK-celler. 13

Från uppdelningen av tiden i de olika tillstånden i figur 22 och 23 ses att dopade och odopade överensstämmer väldigt väl med en stor majoritet för 9-1% i TMAP och -1% i direkt rörelse. Från figur 24 och 25 fås det att minskningen i medelhastighet för hela livslängden som funktion av andelen tid i TMAP är i princip lika för odopade och dopade. Dessutom är trenden för medelhastigheten, som en funktion av andelen av tid i direkt rörelse, liknande för dopade och odopade, båda höjs desto mer de är i det tillståndet. Det går att se i figur 26 och 27 att antalet gånger en cell går in i de olika tillstånden skiljer sig åt, de dopade går in fler gånger i TMAP och direkt rörelse. Medelvärdena för det kan ses i tabell 2. Tabell 2. Medelvärden för antal TMAPs/cell och direkta rörelse/cell TMAPs/cell 1.84±.15 1.29±.11 Direkta rörelse/cell.76±.14.42±.14 Ur figur 28 ser man att odopade NK-celler har en större andel TMAPs som är mellan 24-48 minuter medan dopade NK-celler har större andel TMAPs som är korta, -6 min, och väldigt långa 54-72 min. Notera dock att experimenttiden för de dopade cellerna är 72 min och inte 48 minuter som de odopade. Vidare ses det i figur 29 att direkt rörelse för dopade NKceller är väsentligt längre än för de odopade. Respektive medelvärde kan ses i tabell 3. Tabell 3. Medelvärden för längden på TMAP och direkt rörelse för dopade och odopade TMAP-längd 11±12 min 199±14 min Direkt rörelse-längd 42.3±6.5 min 25.±5.4 min,5 TMAP-fördelning Andel av alla celler,4,3,2,1 Andel av tid i TMAP Figur 22. Figuren visar fördelningen av cellernas tid i TMAP. 14

Direkt rörelse-fördelning Andel av alla celler,9,8,7,6,5,4,3,2,1 Andel av tid i direkt rörelse Figur 23. Figuren visar fördelningen av cellernas tid i direkt rörelse. 4,5 4 Medelhastighet(µm/min) 3,5 3 2,5 2 1,5 1,5 Andel av tiden i TMAP Figur 24. Graferna i figuren representerar medelhastigheten celler har med en viss tid i TMAP för dopade och odopade NK-celler. Varje punkt motsvarar medelhastigheten(y-axeln, µm/min) för de cellerna med en viss andel av tiden i TMAP(x-axeln). 15

Medelhastighet(µm/min) 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1,5 Andel av tiden i direkt rörelse Figur 25. Graferna i figuren representerar medelhastigheten celler har med en viss tid i direkt rörelse för dopade och odopade NK-celler. Varje punkt motsvarar medelhastigheten(yaxeln, µm/min) för de cellerna med en viss andel av tiden i TMAP(x-axeln). Direkta rörelser per cell,8,7 Andel av alla celler,6,5,4,3,2,1 1 2 3 4 Antal direkta rörelse Figur 26. En uppdelning av andelen celler(y-axeln) med ett visst antal direkta rörelser(xaxeln) 16

TMAPs per cell Andel av alla celler,7,6,5,4,3,2,1 1 2 3 4 5 Antal TMAPS Figur 27. En uppdelning av andelen celler(y-axeln) med ett visst antal TMAPs(x-axeln),35 TMAP-längd,3 Andel av alla TMAPs,25,2,15,1,5 Tid(min) Figur 28. En uppdelning som visar hur långa TMAPs är. 17

,7 Längd på direkta rörelser Andelen av alla direkta rörelse,6,5,4,3,2,1 Tid(min) Figur 29. En uppdelning som visar hur långa direkta rörelser är. 18

4. Diskussion och slutsatser 4.1. Jämförelse mellan manuell och automatisk spårning Spontant känns det väldigt ineffektivt att manuellt spåra alla celler vid ett sådant här projekt, och tanken på ett program som gör det åt en är väldigt lockande. Sanningen är att i detta fall gav manuell spårning ett bättre resultat snabbare. Det ska dock sägas att mycket av det troligen beror på okunskap, men med den tid som var tillgänglig för projektet fanns det ingen tid att sätta sig in i hur man gör det på ett bra sätt. Dessutom syns det från figur 1 och 17 att när den väl spårar en cell är resultatet bra. Däremot är den inte perfekt, den del som den lagt till kan vara en konsekvens av en krock mellan två NK-celler i kombination med dålig bildkvalité då i filmen. Vår uppfattning är att det kommer krävas reproducerbara experiment i stor skala med hållbar bildkvalité för att det ska vara en effektiv metod. Fast om det finns kunskap inom området och goda programmeringskunskaper bör man kunna skriva ett program som Baxters algorithm för att effektivt spåra celler. En sak att notera gällande resultat från den automatiska spårningen är att felkällorna är många. För det första var programmet inte skrivet för detta experiment. Utöver det så fann vi endast 91 unika cellspår, varav många av dessa 91 cellspår är delar av hela cellspår som den tappar bort men sedan hittar igen och startar ett nytt spår. Det innebär att ett cellspår i den manuella spårningen kan vara uppdelad i t.ex. 2 stycken olika spår i den automatiska. Dessutom är det ett stort antal celler den inte hittar, vi har inte beräknat ett exakt värde på detta. 4.2. Analys av odopade NK-celler Utgångpunkten var från början att spåra celler och undersöka hur deras migration kunde kopplas till hur effektiva mördare de är. Det skulle göras genom att förstå hur deras hastighet och interaktion med tumörcellerna påverkade. Fast det noterades snabbt att våra odopade NKceller bara dödade ett par tumörceller så inriktningen flyttades mot analys inte berör det. Det gick snabbt att konstatera ett par saker, hastigheten i direkt rörelse är mycket högre än den i TMAP vilket känns logiskt med tanke på de olika tillståndens natur. När NK-cellerna är i TMAP sitter de fast vid en tumörcell eller kretsar runt i ett litet område oftast nära en tumörcell medan i direkt rörelse så färdas de längre avstånd som ser ut att vara för att transportera sig från ett område där den inte hittar någon cell till ett nytt område i jakt på en annan cell. Vår data säger att NK-cellerna är i TMAP en väldigt stor del av sin tid och endast en kort tid i direkt rörelse vilket förklarar varför medelhastigheten för TMAP är lik medelhastigheten för hela banan. Det går att spekulera i att det är mer krävande för cellen att vara i direkt rörelse eftersom våra resultat visar att en majoritet av alla NK-celler är i direkt rörelse under 2% av sin tid(figur 23). Dock kan det bero på att NK-celler lätt fastnar nära eller i en tumörcell under en längre period och lämnar lite tid över. 19

4.3 Jämförelse mellan odopade och dopade NK-celler Till att börja med vill vi påpeka att de rätt stora skillnaderna i hastighet kan bero på skillnad i storlek på de båda experimenten. Nämligen att en har spåret 97 NK-celler och en annan har spårat 178 NK-celler. Utöver det så kan skillnader förklaras av att IL-2 lyckats aktivera olika mycket i de olika proven. Dessa tvivel gäller för alla våra jämförelser men det går åtminstone att se en märkbar skillnad i antalet TMAPs och direkt rörelser, från figur 26 och 27, som det går att dra slutsatser ifrån. I en artikel om dopade NK-celler ser man att de dödar betydligt mer[7]. Utifrån det kan man spekulera i att NK-celler har större chans att döda tumörceller om de går in fler gånger i TMAP och direkt rörelse. Det kan i sin tur vara en följd av att dopade NK-celler helt enkelt är mer aktiva och byter oftare tillstånd. Ytterligare en sak rörande TMAPs är att längden på dem, figur 28, är lite missvisande. Topparna vid 42-48 och 66-72 beror på att till de staplarna räknas alla TMAPs som är i TMAP när experimentet slutar vid 48 min respektive 72 min. Undersöker vi kontaktdatan ser vi att för våra odopade NK-celler är kontaktlängden kort. Från det kan man dra slutsatsen att det finns en koppling mellan hur långa kontakterna är och om de lyckas oskadliggöra tumörcellerna. Det kan ses som normalt NK-cell beteende att cellen är i en sorts cykel, denna cykel skulle då bestå av tre olika steg och repeteras tills det att cellen dör. Stegen skulle naturligt vara att den först rör sig snabbt för att hitta ett område med olika tumörceller, för att sedan när cellen hittat ett område där det finns ett eller flera målceller saktar in och rör sig runt tumörcellerna. Till sist skulle cellen komma att ta kontakt med en av tumörcellerna för att kanske döda denna eller gå direkt vidare till första steget. 2

5. Referenser [1] Vivier, E., Raulet, D.H., Moretta, A., Caligiuri, M.A., Zitvogel, L., Lanier, L.L., Yokoyama, W.M. & Ugolini, S. (211). "Innate or Adaptive Immunity? The Example of Natural Killer Cells". Science 331: 44 49 [2] Skapat av Klas Magnusson, doktorand, KTH. Ursprungsartikel: P. M. Gilbert, et al., Substrate Elasticity Regulates Skeletal Muscle Stem Cell Self-Renewal in Culture, Science 27 Aug 21, Vol. 329 no. 5995 pp. 178-181 [3] Permanent länk, Confidence interval, 9 Maj 213 http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=confidence_interval&oldid=553766154 [4] http://www.math.kth.se/matstat/gru/fs/tabeller_gk.pdf, 9 Maj 213 [5] Modifierat program av Ksenia Chechet, Oscar Mickelin. Ursprunligen från M.A.Khorshidi, Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro. Integrative Biology, vol 3, Juli 211, pp. 77-778. [6]Mohammad Ali Khorshidi, Bruno Vanherberghen, Jacob M. Kowalewski, Kym R. Garrod, Sara Lindström, Helene Andersson-Svahn, Hjalmar Brismar, Michael D. Cahalan and Björn Önfelt, Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro, Integr. Biol., 211, 3, 77 778 [7] B. Vanherberghen, P.E. Olofsson, E. Forslund, M. Sternberg-Simon, M.Ali. Khorshidi, S. Pacouret, K. Guldevall, M. Enqvist, K.J. Malmberg, R. Mehr and B. Önfelt, Classification of human natural killer cells based on migration behavior and cytotoxic response. Blood, Jan 15 213 21