Övning: Släktträd sid 1 Övning i bioinformatik Släktträd med hjälp av databaser och program från Internet Det finns databaser som är fritt tillgängliga och innehåller nukleotid- och amino-syrasekvenser från ett stort antal organismer. Den största DNA-databasen är GenBank medan SwissProt är störst när det gäller proteiner. Det finns också gratisprogram på Internet för att arbeta med de omfattande datamängderna. Denna övning handlar om hur man använder aminosyrasekvenser för att bygga släktträd som kan användas för att studera släktskap och förstå evolutionära skeenden. Ett bra hjälpmedel är Biology Student Workbench, en webbplattform som underlättar arbetet att hämta data från databaser och sedan hantera materialet med hjälp av olika dataprogram. Biology Student Workbench har utvecklats på San Diego Supercomputer Center (SDSC), vid University of California San Diego, för att användas i skolan. Med utgångspunkt i de molekylära databaserna kan evolutionära frågeställningar ställas och utvecklingen av de levande organismerna studeras på molekylnivå. Elever i skolan kan på detta sätt arbeta som molekylärbiologiska forskare med samma material som används av professionella forskare. Att bygga ett släktträd Så här ser arbetsgången ut för att bygga ett släktträd med utgångspunkt i nukleotid- eller aminosyrasekvenser: 1. Sekvenser hämtas från DNA- eller proteindatabaser Det gäller att välja en sekvens som är gemensam för de organismer man vill studera och dessutom har en förändringstakt som lämpar sig för det evolutionära skeende man vill studera. Genom att jämföra motsvarande proteinsekvenser från olika organismer kan man följa evolutionen tillbaka till ett gemensamt ursprung. 2. Alignment Nukleotid- eller aminosyrasekvenser från flera organismer läggs parallellt med hjälp av ett dataprogram så att den bästa överensstämmelsen uppnås. De regioner av aminosyrasekvenserna som överensstämmer helt mellan de olika arterna markeras med blå färg. Denna procedur kallas alignment. Om man väljer sekvenser utan att ha mer ingående kunskap om deras uppbyggnad kan släktträdet se väldigt egendomligt ut. Detta kan t.ex. bero på att det skett evolutionära förändringar i nukleotidsekvensen i form av t.ex. deletioner som medför gap i sekvensen eller att det bildats olika antal duplikationer hos de olika arterna.
Övning: Släktträd sid 2 3. Släktträd Ett släktträd konstrueras sedan med hjälp av ett dataprogram med målsättningen att det ska krävas ett så litet antal förändringar av nukleotider eller aminosyror som möjligt för att förklara de data man har. Vid den traditionella metoden att konstruera släktträd utgår man från synliga skillnader i organismernas byggnad. Med bioinformatik kan släktskap visas mellan helt skilda organismer som t.ex. jäst, bananflugor och människor kan beskrivas med utgångspunkt i molekylärbiologi. Biology Student Workbench Till följande övningar används en plattform kallad Biology Student Workbench, som ger möjlighet att söka i protein- och DNA-databaser. Här finns också program som behövs för hantera informationen. Att bygga ett släktträd med utgångspunkt i myoglobin Myoglobin har som uppgift att förse musklerna med syre genom att överta och lagra det syre som transporteras av hemoglobinet i de röda blodkropparna. Myoglobin är ett protein som finns hos ett stort antal djurarter. Det finns t.ex. hos både människa och fisk och man kan därför dra slutsatsen att det bildats tidigt under evolutionen innan de olika djurgrupperna skiljdes åt. Övningen handlar om att söka i en proteindatabas efter jämförbara sekvenser av proteinet myoglobin som hämtas från olika djurarter. Med utgångspunkt i dessa sekvenser byggs sedan ett släktträd som visar den evolutionära utvecklingen. Släktträdet kan sedan användas för att studera släktskapet mellan djurarterna. Utförande Biology Student Workbench Starta genom att gå in på webbsidan http://bsw-uiuc.net. Registrering Klicka på Use student workbench (i rutan med texten STUDENTS). Om du inte har använt Student workbench tidigare behöver du registrera dig. Registreringen är gratis och tar bara någon minut. I den nya sida som öppnats väljs länken Biology Workbench registration page. Du väljer själv User ID och Password. Resultatet av ditt arbete med Workbench lagras och du kan komma tillbaka och fortsätta arbetet vid senare tillfälle. Skriv därför ner inloggningsnamn och lösenord. När registreringen är klar kommer du tillbaka till Biology workbenchs startsida. Klicka igen på Use student workbench (i rutan med texten STUDENTS) och logga in med den inloggning du skapat. Starta en ny session Första gången du använder Biology Student Workbench måste du alltid starta en ny s.k. session i likhet med att du öppnar ett nytt word-dokument för att börja skriva. En session kan liknas vid en mapp där du samlar ditt arbete. Sessionen döps till ett namn och sparas, vilket innebär att det går bra att återkomma till sessionen vid senare tillfälle. Klicka på NEW till höger om Create a
Övning: Släktträd sid 3 NEW Session. I det nya fönster som öppnas skrivs ett valfritt namn in vid Session Description, välj sedan Start New Session. På den nya sidan som visas finns den nya sessionen med. Framför namnet finns en ruta som ska vara markerad när du arbetar med sessionen. Arbetet med att hämta och analysera DNA- eller aminosyrasekvenser kan nu börja! 1. En aminosyrasekvens väljs 1.1 Klicka på knappen Protein Tools som finns i övre delen av sidan. 1.2 Skriv in human AND myoglobin i den tomma rutan i övre delen av sidan. 1.3 Välj Swissprot Database från rutan Select one or more databases. Klicka sedan på knappen Njinn som finns till höger. 1.4 I listan med träffar väljs den aminosyrasekvens som ska vara utgångspunkt för den fortsatta sökningen. Markera rutan framför filen SWISSPROT:MYG_HUMAN 1.5 Klicka därefter på knappen Import sequence (s) längst ner på sidan. Detta innebär att filen SWISSPROT:MYG_HUMAN hämtas till Workbench. 2. Sök efter proteiner med likartade aminosyrasekvenser 2.1 På den nya sidan syns längst ner en text som anger den fil du valt: SWISSPROT:MYG_HUMAN. Markera filen genom att klicka i rutan framför namnet. 2.2 I en av rutorna i övre delen av sidan står Compare a Protein sequence to a protein sequence database och nedanför denna text står Select one or more Databases. I denna ruta väljs SwissProt. Klicka sedan på knappen BLASTP som står till höger i samma ruta. BLASTP är ett hjälpmedel för att jämföra den utvalda proteinsekvensen med proteinsekvenser i en databas och söka efter likartade sekvenser. (Sökningen kommer att ge ett stort antal sekvenser.) 3. Aminosyrasekvenser väljs ut för alignment 3.1 I det nya fönstret som öppnas finns en lång lista på proteiner från olika organismer som matchar den ursprungliga sekvensen. Från denna lista väljs de organismer för vilka vi vill undersöka släktskapet. Sätt en markering framför de valda organismerna (proteinsekvenserna). Ett dataprogram kommer att söka efter partier med samma sekvens av aminosyror i de olika proteinerna. Följande exempel på organismer är valda från helt skilda organismgrupper och är exempel på organismer som kan väljas. MYG_HUMAN MYG_PANTR MYG_GORBE MYG_PIG MYG_APTFO MYG_BALAC MYG_ALLMI MYG_GALJA MYG_THUAL (människa, Homo sapiens) (schimpans, Pan troglodytes) (gorilla, Gorilla gorilla beringei) (gris, Suscrofa domesticus) (vikval, Balaenoptera acutorostrata) (kejsarpingvin,aptenodytes forsteri) (Alligator, Alligator mississippiensis) (Gråhaj, Galenorhinus galeus) (gulfenad tonfisk, Thunnus albacares)
Övning: Släktträd sid 4 3.2 Klicka på knappen Import sequence(s) i övre delen av sidan. Data importeras för att alignment ska kunna göras. 4. Alignment och släktträd 4.1 I det nya fönstret som öppnas klickar du i rutorna framför de sekvenser som ska ingå i alignment. 4.2 Klicka på länken CLUSTALW ovanför tabellen, till höger (t.v. står: Align multiple protein sequences with each other). I det fönster som nu öppnas läggs aminosyrasekvenserna parallellt (alignment). Blå färg och tecknet (*) visar att alla arter har samma aminosyrarest, grön färg och tecknet (:) visar överensstämmelse mellan aminosyror som har likartade sidogrupper som starkt inverkar på aminosyrornas egenskaper, mörkviolett färg och tecknet (.) visar att överensstämmelsen mellan aminosyrsresterna är mindre. Svart färg visar att det finns avsevärda skillnader mellan aminosyraresterna (under aminosyraresterna finns inget tecken). 4.3 Klicka på knappen Import Alignment. 4.4 Markera rutan CLUSTALW-Protein, som finns längst ner till vänster om sekvenserna. 4.5 Välj antingen knappen DRAWTREE som ger ett orotat fylogeniträd eller DRAWGRAM som ger ett rotat fylogeniträd. 5. Återgå till en tidigare session Om du vill återgå till en session som du arbetat med tidigare, klicka på webbläsarens bakåtknapp tills du når sidan där bl.a. knappen Preferences syns överst. Klicka på Preferences och i den nya sida som öppnas väljs den sparade filen. Välj sedan RESUME i stället för NEW. Ordlista Biology Student Workbench SESSION SWISSPROT BLASTP Alignment CLUSTALW Rotat släktträd Orotat släktträd En plattform som underlättar arbetet med att söka i databaser efter proteiner och DNA-sekvenser, samt innehåller program för hantering av stora datamängder. Den mapp som skapas när man arbetar med Workbench kallas SESSION. Proteindatabas med lagrade aminosyrasekvenser från en mängd organismer. Med programmet BLASTP kan en viss aminosyrasekvens jämföras med alla aminosyrasekvenser i en proteindatabas. BLASTP söker rätt på likartade sekvenser och ger en förteckning på dessa. Alignment innebär att aminosyra- eller DNA-sekvenser läggs parallellt så att de partier som är lika hamnar ovanför varandra. Ett program som utför alignment och bygger släktträd. Släktträdet har en rot och en stam som visar det evolutionära ursprunget till de organismer som finns med i släktträdet. Avståndet mellan grenarna i släktträdet visar hur nära släkt organismerna är. Släktträdet saknar rot och stam. Avståndet mellan grenarna i släktträdet visar hur nära släkt organismerna är.
Övning: Släktträd sid 5 Övningsuppgifter och reflektioner Släktträdet kan användas för reflektioner tillsammans med eleverna och för att gå vidare med studier i organismernas evolution. 1. Överensstämmer släktträdet med det som är den allmänna uppfattningen om släktskap mellan de ingående organismerna? Om inte vilka kan orsakerna vara till avvikelserna? 2. Välj bland nedanstående uppgifter beroende på vilka organismer du har med i släktträdet: Hur är de tre primaterna - människa, gorilla och schimpans placerade i förhållande till varandra? Hur mycket skiljer sig DNA mellan dessa arter? När tror man att de skiljdes åt under evolutionen? Hur är valar placerade i förhållande till fiskarna respektive däggdjuren? Vad säger oss detta om valarnas ursprung? Hur kommer det sig att djur som till det yttre är förhållandevis lika finns så långt ifrån varandra på släktträdet? Varför uppkommer en sådan likhet mellan djur som endast är avlägset släkt? Hur är haj och tonfisk placerade i förhållande till varandra, samt i förhållande till gruppen av övriga organismer? De organismer vi studerar är alla resultatet av en evolution från en gemensam förfader. Evolutionen har pågått under lång tid och förändringarna är stora. Inom t.ex. gruppen fiskar, som är den äldsta gruppen av ryggradsdjur, har förändringarna blivit så omfattande att fiskar sinsemellan skiljer sig åt väldigt mycket och kanske är skillnaderna större än inom andra grupper av ryggradsdjur. Fortsätt med att bygga egna släktträd 3. Pröva att göra släktträd med utgångspunkt i andra proteiner som är gemensamma för en grupp organismer. (Var medveten om att de släktträd du får fram på detta sätt kan vara svårtolkade eftersom man måste känna till proteinsekvenserna väl som man använder för att få pålitliga resultat.) 4. Pröva att göra ett bestämningsschema för t.ex. några föremål (olika pennor eller nycklar) eller några olika växter eller djur. Vilka karaktärer hos de olika föremålen eller organismerna är bra att använda i en nyckel? Hur ska nyckeln konstrueras för att vara lätt att använda? Studera några examinationsnycklar för växter och djur i handböcker. Webbsidor National Center for Biotechnology Information (NCBI) med nukleotiddatabasen GenBank (www.ncbi.nih.gov). Proteindatabasen SwissProt (www.expasy.org/) Biology Student Workbench (http://bsw-uiuc.net)