Fakulteten för hälso- och livsvetenskap Examensarbete Artidentifiering av mögelsvamp med MADI-TOF MS Författare: Ellinor eander Ämne: Biomedicinsk laboratorievetenskap Nivå: Grundnivå
Artidentifiering av mögelsvamp med MADI-TOF MS Ellinor eander Examensarbete, Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng Filosofie Kandidatexamen Handledare: Medicinsk chef Klinisk mikrobiologi Annika Wistedt och vårdhygien, Hus 17 änssjukhuset 391 85 Kalmar Universitetslektor Institutionen för Kemi Britt-Inger Marklund och Biomedicin, innéuniversitetet 391 82 Kalmar Examinator: Universitetslektor Institutionen för Kemi Maria Bergström och Biomedicin, innéuniversitetet 391 82 Kalmar Examensarbetet ingår i Biomedicinska analytikerprogrammet 180 högskolepoäng Sammanfattning Snabb och korrekt artidentifiering är avgörande för effektiv behandling av svampinfektioner, särskilt bland immunsupprimerade patienter. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MADI-TOF MS) används rutinmässigt på kliniska laboratorier för identifiering av karaktäristiska proteinmönster hos bakterier och jästsvampar genom tolkning av proteinspektra i en masspektradatabas för korrekt artidentifiering. Mögelsvamparnas hårda cellvägg och heterogena växtsätt med varierande proteinuttryck beroende på mognadsstadie, försvårar identifiering med MADI-TOF MS. Metodens tänkbara fördelar mot traditionella metoden mikroskopering är förkortade svarstider, säkrare artidentifiering av fler arter och mindre beroende av subjektiv morfologisk bedömning. Studiens syfte var att undersöka om MADI-TOF MS kunde anpassas och användas för identifieringen av mögelsvamp i klinisk rutindiagnostik. Fyra referensstammar (Aspergillus niger, A. fumigatus,, A.flavus) och ett kliniskt isolat () undersöktes. Preparationsmetoderna (I) fullständig myrsyraextraktion, (II) direktapplicering och (III) suspension i destillerat vatten användes för analys av sporer och frontmycel hos yngre och äldre mögelkulturer. Två olika masspektradatabaser för artidentifiering jämfördes; rutindatabasen och den specialiserade mögeldatabasen Filamentous Fungi ibrary. Även plocktekniken av mögelmaterial inför analys med MADI-TOF MS utvärderades. Vid vissa tillfällen förbättrades artidentifieringen efter extraktion av mögelkulturerna, medan i andra fall var direktapplicering fullt tillräcklig. Mögelmaterial med mycket sporer tenderade ge något fler artidentifieringar i oavsett kulturernas ålder. Filamentous Fungi ibrary tenderade i vissa fall ge bättre resultat jämfört med för yngre kulturer. Fler studier krävs för att utvärdera och optimera MADI-TOF MS som metod för artidentifiering av mögelsvamp.
Nyckelord Mögelsvamp, artidentifiering, MADI-TOF MS, databas Abstract Rapid and accurate species identification is crucial for successful treatment of fungal infections, especially among immunosuppressed patients. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MADI-TOF MS) is used routinely at clinical laboratories to identify characteristic protein patterns of bacteria and yeast by the interpretation of protein spectra in a database for accurate species identification. The hard cell wall of the mold and the heterogeneous growth with varying protein expression due to maturation, complicates identification with MADI- TOF MS. The potential benefits of this method compared to microscopy as traditional method are shortened turn-around times, safer species identification of more species that is independent on subjective morphological assessment. The purpose of the study was to investigate whether MADI-TOF MS could be adapted and used for the identification of molds in clinical routine diagnostics. Four reference strains (Aspergillus niger, A.fumigatus,, A.flavus) and a clinical isolate () were examined. The preparation methods (I) complete formic acid extraction, (II) direct application and (III) suspension in distilled water were used for analysis of spores and frontmycelium from younger and older mold cultures. Two different masspektradatabases for species identification were compared; routine database and the specialized mold database, Filamentous Fungi ibrary. Also the collecting technique of mold prior to analysis with MADI-TOF MS was evaluated. Sometimes, the species identification improved after extraction of mold cultures, while in other cases direct application was sufficient. Cultures with a lot of spores tended to give slightly more species identifications in regardless of the age of cultures. Filamentous Fungi ibrary, in some cases, tended to improve the performance compared to for younger cultures. More studies are required to evaluate and optimize MADI-TOF MS as a method of mold identification. Keywords Filamentous fungi, species identification, MADI-TOF MS, database
Innehållförteckning Introduktion - 1 - Taxonomi för eukaryota svampar - 1 - Mögelsvampars egenskaper - 1 - Reproduktion - 1 - Cellväggens stabilitet - 1 - Virulensfaktorer - 1 - Infektioner med mögelsvamp - 2 - Patientfall med mögelsvamp under 2017 vid Klinisk mikrobiologi i Kalmar - 3 - Nuvarande metod för identifiering av mögelsvamp - 4 - MADI-TOF MS för artidentifiering av mögelsvamp inom klinisk mikrobiologisk rutinverksamhet - 4 - Analysprincip för MADI-TOF MS - 4 - Syfte - 5 - Material och metod - 6 - Odling - 6 - Beredning av lösningar inför provsättning och analys med MADI-TOF MS i Microflex TM T - 6 - Standardlösning - 6 - Bruksfärdig matrixlösning - 6-70% myrsyra - 6 - Plockteknik och preparationsmetoder - 7 - Fullständig myrsyraextraktion enligt Bruker (I) - 7 - Direktapplicering (II) - 7 - Suspension (III) - 7 - Identifiering med MADI-TOF MS i Microflex TM T - 8 - Referensdatabaser - 8 - Kontroller - 8 - Positiv kontroll - 8 - Negativ kontroll - 8 - Kalibrering - 9 - Etik - 9 - Resultat - 9 - Redovisning av score-resultat - 9 - Motivering till förändringar under studien - 9 - Referensstam A.fumigatus - 10 - Referensstam - 12 - kliniskt isolat - 14 - Kontroller och kalibrering - 15 - Diskussion - 16 - Plockteknik och homogenisering av material - 16 - Jämförelse av suspension, direktapplicering och fullständig myrsyra-extraktion - 17 - Skillnader mellan databaser - 17 -
Tillväxtfas och fördelning av mycel respektive sporer - 18 - Kontroll - 19 - Problem och förbättringsförslag - 19 - Slutsats - 20 - Tack - 20 - Referenser - 21 - Bilagor Bilaga I: Substrat Bilaga II: Rådata
Introduktion Taxonomi för eukaryota svampar De eukaryota svamparna utgör ett av livets riken här på jorden (1). Antalet arter uppskattas till mellan 700 000 och 1 500 000. Av nästan 100 000 kända arter har knappt 500 arter beskrivits orsaka infektion hos människa (2). Svampriket delas in i divisionerna Zygomycota, Ascomycota eller Basidiomycota baserat på vilken typ av sexuell (teleomorph) spor svampen producerar; zygospor, ascospor respektive basidiospor (1). Sporer kan även ha asexuellt (anamorpht) ursprung där sporerna indelas utifrån sättet de utvecklas på (3). De tre divisionerna klassificeras vidare in i klasser, ordning, familj, släkte och art. Mögelsvampars egenskaper De mikroskopiska svamparna excisterar som encellig jästsvamp eller som multicellulära långa och ofta förgrenade hyfer. Många hyfer tillsammans bildar mycel, vilket skapar själva mögelkolonin. Beroende på temperatur kan en del svampar anta formen av både jästsvamp och mögelsvamp, och kallas då dimorph (4). Mögelsvampar växer med ett fluffigt ull-likt utseende och har aerob metabolism med liten eller ingen förmåga att växa i anaeroba förhållanden. De flesta växer optimalt vid 30 C där de börjar bilda vitt mycel som sedan ändrar färg när sporuleringen tar fart (5). Reproduktion Mögelsvampar reproducerar sig på två sätt; (I) teleomorpht där två olika haploida celler fuserar, följt av meiotisk och mitotisk delning, vilket leder till genetisk rekombination där avkomman blir genetiskt olik, (II) anamorpht där en haploid cell delar sig genom mitos och avkomman blir genetiskt identisk. Mögelsvamparna använder främst anamorph reproduktion som har fördelar kortsiktigt, medan de använder teleomorph reproduktion i exempelvis näringsfattiga miljöer vilket kan leda till högre överlevnadschanser. Nackdelen med teleomorph reproduktion är att väl anpassade genetiska drag kan gå förlorade, men vägs upp av att genetisk anpassning till nya förhållanden möjliggörs (3, 6). Cellväggens stabilitet Mögelsvampar har mycket större celler än bakterier och därtill robustare och hårdare cellväggar. De främsta beståndsdelarna i cellväggen är glukaner, chitin, galaktomannaner och lipider (7). Kompositionen av dessa varierar mellan arter. Utanför cellväggen kan fler lager finnas t.ex. ett hydrofobt lager på både hyfer och sporer. Vissa starkt pigmenterade arter som Aspergillus niger har även ett melaninlager på sporerna som kan skydda mot oxidativ stress (7, 8). Virulensfaktorer Vid de tillfällen mögelsvampar infekterar människor interagerar vissa molekyler i cellväggen med människans immunförsvar och är således relaterade till mögelsvampars - 1 -
virulens (7). I både hyfer och sporer kan mykotoxiner bildas som försvar mot omgivningen. Dessa orsakar direkta skador i människor och kan påverka syntesen av proteiner, DNA, RNA, eller ändra cellmembranet som leder till försämrade cellfunktioner eller celldöd. De heterotrofa mögelsvamparna kan även utsöndra extracellulära enzymer så som proteaser och hydrolaser för nedbrytning av organiskt material som sedan absorberas genom cellväggen för användning som energi (1). Proteaserna har en förmåga att i människor bryta ner exempelvis kollagen och elastin som lungvävnaden till stor del består av (7). Infektioner med mögelsvamp Människan exponeras ständigt för mögelsvamparnas sporer som sprids naturligt främst via luften men finns även i jorden (5, 9). Inhalation av sporer sker oftast obemärkt men kan orsaka sjukdomar genom allergiska reaktioner, toxikos eller mykos (10). Friska människor har naturligt skydd mot mögelsvampar genom bland annat torr och hel hudyta med normal bakterieflora och omsättningen av hudepitelet (11). Primära infektionsvägen är via luftvägarna. Normalt tar övre luftvägarnas ciliebeklädda epitel och slem hand om inhalerade sporer, där slemmet innehåller skyddande antimikrobiella peptider och surfaktanter (12). Hos immunsupprimerade patienter (t.ex. organtransplanterade) bryts dessa barriärer med följden att mögelsvamparna kan kolonisera och reproducera sig i människan (11, 13). Hur sjukdomen utvecklar sig beror bland annat på mängden mögelsvamp och dess förmåga att reproducera sig i vävnaden, vävnadsskadans storlek samt hur väl fungerande immunförsvaret är hos patienten (11). Den vanligaste exogena och opportunistiska mögelarten i Sverige är Aspergillus fumigatus, följt av A.flavus, A.niger och. Släktet Aspergillus innehåller över 180 kända arter (5, 9). Mögelinfektioner namnges efter det släkte som orsakar infektionen, t.ex. aspergillosis, ett samlingsnamn för flera sjukdomar orsakade av Aspergillus (9). Aspergillom innebär att Aspergillus bildar bollar av hyfer som koloniserar preformerade kaviteter så som lungor, öron och bihålor utan att angripa vävnaden. Aspergillus tillsammans med andra ascomyceter som Fusarium samt zygomyceterna Rhizopus, Mucor och Rhizomucor kan orsaka disseminerad invasiv infektion framför allt hos immunsupprimerade patienter. Vanliga symptom är plötslig feber, hosta, bröstsmärtor och i vissa fall ischemiska cerebrovaskulära symptom (9, 14). Mortaliteten är hög särskilt om felaktig eller ineffektiv behandling ges. Mögelsvampar uppvisar olika känslighet mot antimykotika och vissa antimykotika är toxiska eller orsakar svåra biverkningar. Av dessa anledningar är snabb och korrekt artidentifiering väsentlig (14, 15). - 2 -
Patientfall med mögelsvamp under 2017 vid Klinisk mikrobiologi i Kalmar Klinisk mikrobiologi i Kalmar har ett upptagningsområde på 220 000 invånare. Under 2017 inkom 77110 prover för odling till laboratoriet, varav 72 var positiva för mögelsvamp. Mest frekventa fynd var A.fumigatus (53%) isolerad från provtyperna sputum, cornea, hörselgång, bronkoalveolärt lavage (BA) och bronkialsköljvätska (figur 1). A.niger (23%) isolerades ofta från sårsekret öra/hörselgångssekret och BA. Andra fynd identifierade till släkte var Penicillium spp (9%) isolerad från BA, sputum och abscess, Fusarium spp (4%) isolerad från kontinuerlig ambulatorisk peritoneal dialys (CAPD)-vätska samt Aspergillus spp (1%) isolerad från BA. Övriga fynd svarades ut som trådsvamp eller svampart (7% respektive 3%) isolerade från sputum, BA och bronkborste. I figur 1 presenteras fynden i ett taxonomiträd, tillsammans med exempel på opportunistiska mögelsvampar i de andra divisionerna Zygomycota och Basidiomycota. Fylogenin är dock ifrågasatt i nyare litteratur. Figur 1. Taxonomiträd över släkten och arter inom Ascomycota, isolerade från prover inkomna till Klinisk mikrobiologi i Kalmar under 2017; A.fumigatus (53%), A.niger (23%), Penicillium spp (9%), Fusarium spp (4%). Exempel på opportunistiska mögelsvampar är presenterade i de andra två divisionerna Zygomycota och Basidiomycota. - 3 -
Nuvarande metod för identifiering av mögelsvamp På Klinisk Mikrobiologi vid änssjukhuset i Kalmar län utförs artbestämning av mögelsvampar genom I) makroskopisk bedömning av koloniernas morfologi (färg, struktur), tillväxthastighet och tillväxttemperatur samt II) mikroskopisk identifiering av hyfer och reproduktiva strukturer. För att uppfylla kriterierna för artidentifikation krävs tillräcklig tillväxt och sporulering, vilket kan ta flera dagar (16). Ibland begränsas identifieringen till släktnivå. aboratoriets metod för artidentifiering av bakterier och jästsvamp är analys av isolatens specifika proteinmönster med matrix-assisted laser desorption ionization timeof-flight mass spectrometry (MADI-TOF MS), en snabb och känslig masspektrometrisk metod (17). Tänkbara fördelar med MADI-TOF MS som framtida rutinmetod även för artidentifiering av mögelsvamp, är förkortade svarstider, säkrare identifiering av fler arter och ett mindre beroende av subjektiv morfologisk bedömning. MADI-TOF MS för artidentifiering av mögelsvamp inom klinisk mikrobiologisk rutinverksamhet MADI-TOF MS har revolutionerat identifieringen av bakterier och jästsvamp, men har hittills fungerat sämre för klinisk rutinmässig identifiering av mögelsvamp (18). Tillämpningen av MADI-TOF MS för identifiering av mögelsvamp har i studier rapporterats försvåras av att mögelkolonier är fenotypiskt heterogena beroende av samtidig växt av både hyfer och sporer (19). Beroende på mognadsstadie skiljer sig proteinuttryck och proteinsammansättning (17, 19). Därtill har hyfer och sporer hårda cellväggar som gör dem motståndskraftiga mot frigörande av intracellulära proteiner (19, 20). Odlingsbetingelser och valet av preparationsmetod påverkar också kvaliteten på spektra (21). Därutöver är databaser för mögelsvamp sämre utvecklade. Det finns flera kommersiella MADI-TOF MS system framtagna för rutinidentifiering av mögelsvamp (13). Tillgängligt instrument på Klinisk Mikrobiologi i Kalmar är Biotyper (Bruker Daltonik) och rutindatabasen som används innehåller vissa spektra för mögelsvamp. Tillverkaren rekommenderar dock en specialiserad databas som innehåller fler spektra från mögelsvamp. Studier talar dock för att det finns potential för förbättringar i befintliga databaser, dels förbättras utfallen vid användning av utökade in-house-databaser och dels kan korrekt identifiering till lägre score ofta ses (13, 18, 22). Analysprincip för MADI-TOF MS En masspektrometer arbetar under vakuum och är huvudsakligen uppbyggd av en jonkälla, en massanalysator och en detektor kopplad till ett datasystem (23). - 4 -
Vid provsättning täcks och kristalliseras provet med en matrixlösning på en metallprovplatta. Matrixen möjliggör joniseringssteget genom att fungera som en protondonator då matrixen innehåller en svag organisk syra (24). I jonkällan exciteras matrixen av en UV-laser (23). Vid övergång till gasfas överförs protoner från matrix till proteiner som får laddningen +1 (23, 25). Eftersom MADI är en så kallad mjuk jonisering sker minimal fragmentering av proteinerna (23). Från jonkällan accelereras proteinerna i ett spänningsfält mot TOF-massanalysatorn där proteinerna separeras efter förhållandet mellan massa och laddning (m/z) innan de når detektorn. Då proteinerna har samma laddning men olika storlek, når små proteiner detektorn snabbare än stora proteiner. Tiden för proteinernas färd mellan acceleration i jonkällan till detektorsignal mäts i nanosekunder som omvandlas till massa. Provets detekterade proteinmassor sammanställs i ett masspektrum vilket jämförs mot kända arters masspektra i en referensdatabas (23). Hur väl det okända masspektrumet liknar referensspektra bestäms genom tre faktorer; andelen av topparna från det okända masspektrumet som matchas mot toppar från masspektra i referensdatabasen, därefter andelen av topparna från masspektra i referensdatabasen som matchas mot toppar från det okända masspektrumet och slutligen beräknas överensstämmelsen av topparnas höjd mellan okänt masspektrum och referensspektra. Resultatet efter multiplicering och logaritmering av dessa tre faktorer är ett score-värde mellan noll och tre för att se hur väl provets proteinspektrum stämmer överens med referensspektrum från en känd mikroorganism (26). Från tillverkaren rekommenderas klassificering av score-värde mellan 2,3-3,0 som säker släkt- och artidentifiering, score-värde 2,0 2,3 som säker släktidentifiering och trolig artidentifiering, score-värde 1,7 2,0 som trolig släktidentifiering och score-värde < 1,7 som osäker identifiering. När inga masstoppar detekterats ges benämningen no peaks found (NP) (27). Vid analys används en positiv kontroll bestående av en bakteriestam och en negativ kontroll. Positiv kontroll direktappliceras genom att sprida en del av bakteriekolonin på en metallprovplatta avsedd för instrumentet, som därefter täcks med samma matrix som proverna. Negativ kontroll består av en tom provposition som täcks med matrix. Syfte Studiens syfte var att undersöka om på laboratoriet tillgänglig metod för artidentifiering av bakterier och jästsvamp med MADI-TOF MS på ett effektivt sätt kan anpassas och användas även för identifieringen av snabbväxande mögelsvamp som isoleras från kliniska prov. - 5 -
Material och metod Till studien valdes referensstammarna A.fumigatus,, A.flavus och A.niger då Aspergillus spp är vanligast förekommande i kliniska prover på mikrobiologen i Kalmar. Valda isolat har under åren 2015-2017 ingått i UK NEQAS externa kontrollutskick och fanns nedfrysta (-70 C) på laboratoriet. Till studien valdes ett av de senast infrysta isolaten av respektive art. I studien inkluderades också ett isolat från ett patientprov taget från öronsekret där mögelsvamp växte. Isolatet artbestämdes till i faskontrastmikroskop enligt laboratoriets rutinmetodik av ordinarie personal på laboratoriet. Isolatet användes i studien som jämförelse mot referensstam. Odling Mögelsvampmaterial erhölls dels genom odling av nedfrysta sporer eller så spreds sporer från äldre koloni på det fasta substratet Sabouraud Dextrose Agar med tillsatt benzylpenicillin och streptomycin (SAB) (bilaga I). Odlingarna inkuberades aerobt 30 C (± 1 C) fram till analystillfället. Beredning av lösningar inför provsättning och analys med MADI- TOF MS i Microflex TM T Nya lösningar bereddes i dragskåp inför varje försök. Standardlösning I eppendorfrör blandades 475 μ ultrarent vatten (OTnr BCBH3697V, Sigma- Aldrich), 25 μ 99 % trifluorättiksyra (TFA, OTnr STBG1988V, Sigma-Aldrich) och 500 μ 99,9 % acetonitril (OTnr SZBC278AV, Sigma-Aldrich) enligt anvisningar från Bruker Daltonik. Bruksfärdig matrixlösning Till frystorkad α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA; OTnr 278008, Bruker Daltonik GmbH) sattes 250 μ standardlösning enligt anvisningar från Bruker Daltonik. HCCA-matrixlösningen blandades homogen. 70% myrsyra I eppendorfrör blandades noggrant 700 μ av 100 % myrsyra (OTnr SZBB2650V, Sigma-Aldrich) med 300 μ ultrarent vatten enligt anvisningar från Bruker Daltonik. - 6 -
Plockteknik och preparationsmetoder Plocktekniken av mögelmaterial från SAB-plattorna utvärderades genom att använda plastplatinös 1 μ (VWR, Italien), skalpell (Swann-Morton, England) eller träpinne (2mm x 14 cm; Oxoid TD, Storbritannien). Under försöken utvärderades tre olika preparationsmetoder; (I) fullständig myrsyraextraktion enligt Bruker baserad på deras Standard Operation Procedure (SOP) för odling och provpreparering av mögelsvamp (28), (II) direktapplicering av mögelmaterial till provpositioner på en Micro SCOUT Plate (MSP) 96-brunnars polished steel MADI provplatta (Bruker Daltonik GmbH). (29), (III) suspension i ultrarent vatten, baserat på protokoll från Umeå universitet (personlig kommunikation). Dessa tre preparationsmetoder beskrivs detaljerat i ett senare avsnitt. Resultat från frontmycel (kanten på mögelkolonin, figur 2) jämfördes mot resultat från den centrala kolonidelen där sporer hade utvecklats i större utsträckning. Dessa två stadier analyserades hos både yngre kulturer (1-2 dagar) som äldre kulturer (5-6 dagar). Olika metoder för applicering på MADIprovplattan genomfördes. Fullständig myrsyraextraktion enligt Bruker (I) Från mögelkolonin suspenderades material i ungefärlig storlek av ca 4-6 mm i diameter i 300 μ ultrarent vatten (28). För inaktivering av mögelsvampen tillsattes 900 μ 99,5 % etanol (CCS Healthcare AB, Borlänge, Sverige) följt av blandning och centrifugering (Sigma 1-15, abex instrument AB, Helsingborg) i två minuter vid 13000 rpm (15200 g) (30). Supernatanten avlägsnades försiktigt genom pipettering följt av centrifugering i några sekunder. Kvarvarande vätska efter den andra centrifugeringen avlägsnades med pipett och pelleten torkades vid rumstemperatur. Beroende på pelletens storlek tillsattes 20-50 μ 70 % myrsyra som frigör proteiner genom att penetrera och lösa upp cellväggen (30). Pelleten suspenderades och därefter tillsattes samma volym 99,9 % acetonitril (Sigma-Aldrich) för extraktion av proteinerna som därefter suspenderades (30). ösningen centrifugerades två minuter vid 13000 rpm. Till en position på MADI-provplattan överfördes 1 μ supernatant som efter torkning täcktes med 1 μ bruksfärdig matrixlösning. Direktapplicering (II) En del av mögelkolonin, i storlek av ca 3-4 mm diameter, överfördes direkt till MADIprovplattan med 1 μ plastplatinös, skalpell eller träpinne (29). En provposition täcktes med 1 μ 70 % myrsyra som efter torkning täcktes med 1 μ bruksfärdig matrixlösning. Suspension (III) Vid suspensionen doppades en bomullspinne i ultrarent vatten och gnuggades på mögelkolonin. Mögelmaterialet från bomullspinnen suspenderades i 300 μ ultrarent vatten förberett i eppendorfrör och blandades. En provposition på MADI-provplattan - 7 -
täcktes med 1 μ av suspensionen. Provet täcktes efter torkning med 1 μ 70 % myrsyra, som efter torkning täcktes med 1 μ bruksfärdig matrixlösning. Identifiering med MADI-TOF MS i Microflex TM T Identifieringen av mögelsvamparna utfördes med en MADI-TOF Microflex TM T masspektrometer (Bruker Daltonik GmbH) utrustad med en nitrogenlaser som emitterade UV-ljus vid 337 nm och en linjär detektor. Analyserna utfördes med standardinställningar (40 laserpulser per sekund; totalt 240 pulser för en provposition, vacuum < 5,0e -6 mbar för analys och ett m/z intervall på 2-20 kda lämpligt för detektion av mögelsvamparnas proteiner) (31-33). Programvaran FlexControl Version 3.4 (Bruker Daltonik GmbH) användes för att sätta in och ta ut MADI-provplattan samt för avläsning av vacuum. Programvaran Maldi Biotyper RTC Version 3.1 (Bruker Daltonik GmbH) användes för analys av proverna och bearbetning av resultat. Referensdatabaser Erhållna spektra jämfördes mot referensspektra i databasen MADI Biotyper 6903 (Bruker Daltonik GmbH) som innehåller två spektra från A.flavus, fem från A.fumigatus, sex från A.niger och två från. Vid ett tillfälle skickades erhållna spektra (försök 1-6) till Bruker Daltonik i Danmark, som var behjälpliga och utförde jämförelse mot referensspektra i MADI Biotyper Filamentous Version 1.0 (Bruker Daltonik GmbH) som innehåller 364 spektra från 110 mögelarter. Kontroller I samband med analys av mögelsvamparna analyserades även en positiv och en negativ kontroll. Positiv kontroll Referensstammen Staphylococcus aureus CCUG 15915 spreds med steril plastplatinös 1 μ på blodagarplatta och inkuberades aerobt över natt i 37 C. Vid analys direktapplicerades dagsfärsk koloni på en provposition på MADI-provplattan och täcktes med 1 μ bruksfärdig matrixlösning inom tio minuter. Analys utfördes med MADI-TOF MS i Microflex TM T i samband med försök 1-8 för kontroll av instrumentet. Negativ kontroll Vid försök 1-6 användes ingen negativ kontroll. Vid försök 7 och 8 pipetterades 1 μ 70% myrsyra och 1 μ bruksfärdig matrixlösning till varsin position för att utesluta kontamination av använda lösningar samt dåligt tvättade MADI-provplattor. - 8 -
Kalibrering Microflex TM T kalibreras en gång i veckan mot Bacterial Test Standard (BTS; Bruker Daltonik, bestående av frystorkad Escherichia coli DH5 α samt proteinerna RNase A och myoglobin), enligt rutiner på laboratoriet. Kalibrering utfördes således inte specifikt för studien. Etik Klinisk stam identitetsmärktes utan koppling till patientdata efter artbestämning i mikroskop. Detta för att skydda patientens integritet. Provet destruerades enligt rutiner på laboratoriet. Resultat Redovisning av score-resultat Även lägre score än de som tillverkaren rekommenderar för artidentifiering redovisas i resultaten (tabell II-IV). Instrumentet anger score-värden med tre decimaler. I tabellerna presenteras faktiskt uppnått score-värde med en decimal. För prover som inte givits någon tolkning på grund av avsaknad av tolkningsbart spektrum anges resultatet NP. Vid en sammantagen bedömning av resultatet utan att ta hänsyn till databas, plockteknik, preparationsmetod, kulturernas ålder och fördelning mellan sporer och frontmycel blev 46/53 artbestämningar med score 1,4 korrekta medan 26/26 av artbestämningarna var korrekta med score 1,5 och 1,6. Träffar som inte nådde score 1,5 redovisades därför inte utan anges som (låg score) i resultattabellerna (tabell II-IV). För score 1,6-2,0 var 91/91 av artbestämningarna korrekta. För score > 2,0, vilket är tillverkarens gräns för artidentifiering, var 20/20 av angiven artmatchning med högsta score korrekt för de fyra analyserade arterna. Motivering till förändringar under studien I försök 1-2 jämfördes direktapplicering (II) mot suspension i ultrarent vatten (III) på 1, 2 och 3 dagars kulturer av de fyra referensstammarna A.fumigatus,, A.niger och A.flavus. Varken direktapplicering (II) eller suspension (III) av 1 och 2 dagars kulturer erhöll något spektra (NP) (tabell V-VI; bilaga II). Identifieringen av 3 dagars kulturer blev korrekt för referensstammarna A.fumigatus och, men felaktig för referensstammarna A.niger och A.flavus (tabell V-VI; bilaga II). Utifrån dessa resultat beslutades att korrekt identifierade arter ( och A.fumigatus) skulle ingå i fortsatta försök tillsammans med det kliniska isolatet. Då direktappliceringen (II) gav något fler identifieringar och högre score jämfört med suspension i ultrarent vatten (III), valdes direktapplicering (II) till fortsatta - 9 -
försök, som en snabbare preparationsmetod att jämföra mot fullständig myrsyraextraktion (I). I försök 3-8 jämfördes således direktapplicering (II) mot fullständig myrsyraextraktion (I) på yngre (1-2 dagar; tabell II-IV a) och äldre (5-6 dagar; tabell II-IV b) kulturer av referensstammarna A.fumigatus, samt det kliniska isolatet. Fullständig myrsyraextraktion (I) tillämpades först efter uteslutning av A.niger och A.flavus. Referensstam A.fumigatus Yngre kulturers direktöverförda (II) sporer av referensstam A.fumigatus artidentifierades i 8 fall av 18 (44%) med, 3/12 fall (25%) med (tabell II a). Fullständig myrsyraextraktion (I) av sporer artidentifierades i 8/24 positioner (33%) med, 4/16 fall (25%) med. Direktöverfört (II) frontmycel artidentifierades i 1/18 positioner (6%) med, 1/12 (8%) med Fungilibrary, fullständig myrsyraextraktion (I) av frontmycel identifierades i 1/20 fall (5%) med, 1/12 (8%) identifierades med. Tabell II a. Yngre kultur (1-2 dagar) referensstam A.fumigatus med score-värden och tolkningar av resultaten. Vid direktöverföringen sattes sporer och frontmycel i triplikat på MADI-provplattan. Fullständig myrsyraextraktion enligt Bruker utfördes parallellt i dubbla rör och varje rörs suspension sattes i duplikat på MADI-provplattan. Identifiering med score 1,5 är grönmarkerat. Score < 1,5 anses vara osäker artidentifiering och har ersatts med (låg). NP står för No Peaks found och innebär att inget spektrum erhållits. Ej utförd analys har lämnats blankt. Den direktapplicerade positiva kontrollen S.aureus CCUG 15915 är presenterad med erhållet score-värde från försök 3-8. Yngre kultur A.fumigatus Spor direkt Front direkt Spor extraktion Front extraktion Kontroll Plockteknik Försök Databas Rör 1 Rör 2 Rör 1 Rör 2 Platinös Skalpell 3 4 5 6 7 8 1,6 1,6 1,8 NP NP NP 1,7 NP NP 1,7 NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP 1,5 1,6 NP 1,7 NP 1,6 1,7 NP NP NP NP 1,6 1,5 1,5 NP 2,3 NP 1,6 NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP 1,8 NP 1,7 1,9 1,5 NP NP NP 1,5 NP NP NP NP NP NP 1,8 1,7 1,7 NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP 2,3 NP 2,3 2,3 1,7 NP NP NP 2,2 2,5 2,1 Notering: Försök 3: Supernatanten dekanterades efter första centrifugeringen. Försök 4: Mer material erhölls än i övriga försök. 2 dagar kulturer i försök 3, 6, 7, 8 1 dagars kulturer i försök 4 och 5 Äldre kulturers direktöverförda (II) sporer av referensstam A.fumigatus artidentifierades korrekt i 6 fall av 18 (33%) med -databasen men inte alls med (tabell II b). Fullständig myrsyraextraktion (I) av sporer artidentifierades varken med - 10 -
eller. Direktöverfört (II) frontmycel identifierades i 8/15 positioner (53%) med men inte med (0/9). Fullständig myrsyraextraktion (I) av frontmycel identifierades vid några tillfällen 3/16 (19%) med, respektive 1/8 (13%) med. Tabell II b. Äldre kultur (5-6 dagar) referensstam A.fumigatus med score-värden och tolkningar av resultaten. Vid direktöverföringen sattes sporer och frontmycel i triplikat på MADI-provplattan. Fullständig myrsyraextraktion enligt Bruker utfördes parallellt i dubbla rör och varje rörs suspension sattes i duplikat på MADI-provplattan. Identifiering med score 1,5 är grönmarkerat. Score < 1,5 anses vara osäker artidentifiering och har ersatts med (låg). NP står för No Peaks found och innebär att inget spektrum erhållits. Ej utförd analys har lämnats blankt. Den direktapplicerade positiva kontrollen S.aureus CCUG 15915 är presenterad med erhållet score-värde från försök 3-8. Äldre kultur A.fumigatus Spor direkt Front direkt Spor extraktion Front extraktion Kontroll Plockteknik Försök Databas Rör 1 Rör 2 Rör 1 Rör 2 Platinös Skalpell 3 4 5 6 7 8 1,6 1,5 1,6 1,7 1,5 1,6 NP NP NP 1,6 1,8 NP 1,6 NP NP NP NP NP NP 1,6 NP NP NP 1,6 1,6 1,5 1,7 1,7 NP NP NP 1,7 1,5 NP 1,5 NP NP NP NP NP NP NP NP NP 2,2 2,5 2,1 Notering: - Försök 3: Supernatanten dekanterades efter första centrifugeringen. - Försök 4: Mer material erhölls än i övriga försök. - 6 dagar kulturer i försök 3, 4, 6, 8-5 dagar kulturer i försök 5 och 7-11 -
Referensstam Yngre kulturers direktöverförda (II) sporer av referensstam artidentifierades i 4/18 fall (22%) med och i 1/12 fall (8%) med (tabell III a). Fullständig myrsyraextraktion (I) av sporer artidentifierades i 12/24 fall (50%) med och i 5/16 fall (31%) med. Direktöverfört (II) frontmycel artidentifierades varken med eller. Fullständig myrsyrextraktion (I) av frontmycel artidentifierades inte alls med (0/20), medan 3/12 (25%) artidentifierades med. Tabell III a. Yngre kultur (1-2 dagar) referensstam med score-värden och tolkningar av resultaten. Vid direktöverföringen sattes sporer och frontmycel i triplikat på MADI-provplattan. Fullständig myrsyraextraktion utfördes parallellt i dubbla rör och varje rörs suspension sattes i duplikat på MADI-provplattan. Identifiering med score 1,5 är grönmarkerat. Score < 1,5 anses vara osäker artidentifiering och har ersatts med (låg). NP står för No Peaks found och innebär att inget spektrum erhållits. Ej utförd analys har lämnats blankt. Den direktapplicerade positiva kontrollen S.aureus CCUG 15915 är presenterad med erhållet score-värde från försök 3-8. Yngre kultur Spor direkt Front direkt Spor extraktion Front extraktion Kontroll Plockteknik Försök Databas Rör 1 Rör 2 Rör 1 Rör 2 Platinös 3 NP 1,7 NP NP NP 1,6 1,6 1,7 1,7 NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP 2,2 Skalpell 4 5 6 7 8 NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP 2,2 2,2 2,3 2,3 NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP 2,2 NP NP NP NP NP NP NP 2,1 NP 2,2 2,2 NP NP NP NP NP NP NP NP 1,6 NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP 1,6 NP NP NP NP 1,6 1,5 1,5 NP NP NP 1,5 NP NP NP 1,5 1,6 1,5 1,5 1,8 1,6 NP NP NP NP NP NP NP 2,5 2,1 Notering: Försök 3: Supernatanten dekanterades efter första centrifugeringen. Försök 4: Mer material erhölls än i övriga försök. 2 dagar kulturer i försök 3, 6, 7, 8 1 dagars kulturer i försök 4 och 5-12 -
Äldre kulturers direktapplicerade (II) sporer av referensstam artidentifierades i 13 fall av 18 (72%) med men inte alls med (0/12) (tabell III b). Fullständig myrsyraextraktion (I) av sporer artidentifierades i 16/24 fall (67%) med, men inte alls med (0/16). Direktapplicerat (II) frontmycel identifierades i 8/15 fall (53%) med och 2/9 (22%) identifierades med Fungilibrary. Fullständig myrsyraextraktion (I) av frontmycel artidentifierades i 9/16 fall (56%) med och i 3/8 fall (38%) med. Tabell III b. Äldre kultur (5-6 dagar) referensstam med score-värden och tolkningar av resultaten. Vid direktöverföringen sattes sporer och frontmycel i triplikat på MADI-provplattan. Fullständig myrsyraextraktion utfördes parallellt i dubbla rör och varje rörs suspension sattes i duplikat på MADI-provplattan. Identifiering med score 1,5 är grönmarkerat. Score < 1,5 anses vara osäker artidentifiering och har ersatts med (låg). NP står för No Peaks found och innebär att inget spektrum erhållits. Ej utförd analys har lämnats blankt. Den direktapplicerade positiva kontrollen S.aureus CCUG 15915 är presenterad med erhållet score-värde från försök 3-8. Äldre kultur Spor direkt Front direkt Spor extraktion Front extraktion Kontroll Plockteknik Försök Databas Rör 1 Rör 2 Rör 1 Rör 2 Platinös 3 1,6 1,7 1,5 1,7 1,6 NP NP NP NP 2,2 Skalpell 4 1,5 1,8 1,5 1,7 NP 1,6 1,7 NP 5 6 7 8 2,0 1,9 1,9 1,8 1,9 1,8 1,8 1,6 1,7 1,5 1,6 1,8 NP 1,6 1,7 1,6 NP 1,9 1,7 1,6 1,7 1,8 1,7 1,8 1,8 NP NP 1,5 1,9 1,9 1,7 1,7 1,7 1,5 1,6 1,7 1,8 1,7 1,6 1,5 1,7 1,6 NP NP NP 1,7 1,6 NP NP NP NP 2,5 2,1 Notering: - Försök 3: Supernatanten dekanterades efter första centrifugeringen. - Försök 4: Mer material erhölls än i övriga försök. - 6 dagar kulturer i försök 3, 4, 6, 8-5 dagar kulturer i försök 5 och 7-13 -
kliniskt isolat Yngre kulturers direktapplicerade (II) sporer av det kliniska isolatet artidentifierades varken med eller (tabell IV a). Fullständig myrsyraextraktion (I) av sporer identifierades inte med (0/24), men med Fungilibrary i 8/16 fall (50%). Direktapplicerat (II) frontmycel identifierades i varken eller. Fullständig myrsyraextraktion (I) av frontmycel identifierades aldrig med (0/16), men i 1/8 fall (13%) med. Tabell IV a. Yngre kultur (1-2 dagar) kliniskt isolat med score-värden och tolkningar av resultaten. Vid direktöverföringen sattes sporer och frontmycel i triplikat på MADI-provplattan. Fullständig myrsyraextraktion utfördes parallellt i dubbla rör och varje rörs suspension sattes i duplikat på MADI-provplattan. Identifiering med score 1,5 är grönmarkerat. Score < 1,5 anses vara osäker artidentifiering och har ersatts med (låg). NP står för No Peaks found och innebär att inget spektrum erhållits. Ej utförd analys har lämnats blankt. Den direktapplicerade positiva kontrollen S.aureus CCUG 15915 är presenterad med erhållet score-värde från försök 3-8. Yngre kultur prov Spor direkt Front direkt Spor extraktion Front extraktion Kontroll Plockteknik Försök Databas Rör 1 Rör 2 Rör 1 Rör 2 Platinös 3 NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP 2,2 Skalpell 4 5 6 7 8 NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP 2,0 NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP 2,3 2,3 2,3 2,3 2,1 NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP 1,9 1,9 NP 2,0 NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP 2,5 2,1 Notering: Försök 3: Supernatanten dekanterades efter första centrifugeringen. Försök 4: Mer material erhölls än i övriga försök. 2 dagar kulturer i försök 3, 6, 7, 8 1 dagars kulturer i försök 4 och 5-14 -
Äldre kulturers direktapplicerade (II) sporer av det kliniska isolatet artidentifierades i 3 fall av 18 (17%) med men inte alls med (0/12) (tabell IV b).fullständig myrsyraextraktion (I) av sporer artidentifierades i 1/24 fall (4%) med men inte med (0/16). Direktapplicerat (II) frontmycel identifierades med varken eller. Fullständig myrsyraextraktion (I) av frontmycel identifierades aldrig med (0/16) men i 3/8 fall (38%) med Fungilibrary. Tabell IV b. Äldre kultur (5-6 dagar) kliniskt isolat med score-värden och tolkningar av resultaten. Vid direktappliceringen (II) sattes sporer och frontmycel i triplikat på MADI-provplattan. Fullständig myrsyraextraktion (I) utfördes parallellt i dubbla rör och varje rörs suspension sattes i duplikat på MADI-provplattan. Identifiering med score 1,5 är grönmarkerat. Score < 1,5 anses vara osäker artidentifiering och har ersatts med (låg). NP står för No Peaks found och innebär att inget spektrum erhållits. Ej utförd analys har lämnats blankt. Den direktapplicerade positiva kontrollen S.aureus CCUG 15915 är presenterad med erhållet score-värde från försök 3-8. Äldre kultur prov Spor direkt Front direkt Spor extraktion Front extraktion Kontroll Plockteknik Försök Databas Rör 1 Rör 2 Rör 1 Rör 2 Platinös 3 NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP 2,2 Skalpell 4 5 1,5 NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP 2,5 6 NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP 1,7 1,8 1,7 7 8 1,5 1,5 NP NP NP 1,6 NP NP NP 2,1 Notering: - Försök 3: Supernatanten dekanterades efter första centrifugeringen. - Försök 4: Mer material erhölls än i övriga försök. - 6 dagar kulturer i försök 3, 4, 6, 8-5 dagar kulturer i försök 5 och 7 Kontroller och kalibrering Den positiva kontrollen S.aureus CCUG 15915, analyserad i försök 1-8, gav score > 2,0 vid samtliga analyser (tabell I). Resultatet från försök 3-8 presenteras även i resultattabell II-IV som visar resultatet från analys av mögelsvamparna. Negativ kontroll av matrix och myrsyra i försök 7 och 8 gav resultatet NP. Negativ kontroll analyserades inte i försök 1-6. Kalibrering av Microflex TM T noterades godkänd innan analys. Tabell I. Score-värden över positiva kontrollen S.aureus CCUG 15915 analyserad i försök 1-8. Positiv kontroll S.aureus CCUG 15915 Försök 1 Försök 2 Försök 3 Försök 4 Försök 5 Försök 6 Försök 7 Försök 8 2,3 2,2 2,5 2,1-15 -
Diskussion Trots att MADI-TOF MS snabbt har blivit rutinmetod för artidentifiering av bakterier och jästsvamp på kliniska laboratorier används tekniken ännu inte för mögelsvamp på de flesta kliniska mikrobiologiska laboratorierna i Sverige. Studien syftade till att undersöka och försöka påverka faktorer som försvårar användningen av just MADI- TOF MS för identifierng av mögelsvamp. I början av studien (försök 1-2) testades fyra referensstammar. Utifrån resultaten från dessa två försök beslutades att fortsättningsvis använda de arter som blivit korrekt identifierade (referensstammarna A.fumigatus och ). Referensstammarna A.niger och A.flavus blev felaktigt identifierade i båda försöken och uteslöts därmed för fortsatta studier. Plockteknik och homogenisering av material Från resultaten i försök 1-2 där direktapplicering (II) jämfördes mot suspension i ultrarent vatten (III), beslutades att utesluta suspension i fortsatta försök då något sämre resultat erhållits med denna preparationsmetod. Största problemet under studien var att få upp material från mögelodlingar på agarplattor, i andra hand att få mögelmaterialet homogent fördelat vid direktapplicering och extraktion. Kolonimaterial togs med hjälp av plastplatinös, skalpell och träpinne. Subjektivt var det mest tillfredsställande verktyget träpinnen. Kolonimaterialet ansamlades och fångades upp lättare med träpinnens breda yta och den var lättare att manövrera än en böjlig plastplatinös. ikvärdiga resultat kunde iakttas med plastplatinös, men det är svårbedömt då platinösen utvärderades vid färre tillfällen. Viss progression sågs genom försöken och berodde delvis på den mänskliga faktorn, där erfarenhet och träning gällande plockning av material gav förbättrade resultat över tid. Skalpellen testades i ett försök att erhålla mer material än vad som erhölls med platinös. Med skalpell var det lättare att ta upp större mängder kolonimaterial men mera tidskrävande. Det var även svårt att undvika agar som kan störa i analysen (16). Den morfologiska skillnaden mellan referensstam och kliniskt isolat märktes vid upptagningen av kolonierna från odlingsplattan. Kliniska isolatet var enkel att plocka med sammanhängande sjok av mycel, men svårare att homogenisera vid prepareringen. Referensstam var tvärtom svårare att plocka men lättare att homogenisera. Mellan de två isolaten av kunde ses att referensstammen gav betydligt fler träffar än det kliniska isolatet, framför allt vid jämförelse av de äldre kulturerna. Sämre resultat för kliniskt isolat kan bero på den morfologiska skillnaden som förmodligen kommer av olika proteinuttryck. Dock gav yngre kultur av kliniskt isolat i försök 5 höga score, över 2,0, med Fungi ibrary, vilket kan tyda på att plockning och preparering förmodligen spelar stor roll för resultatet. - 16 -
Referensstam A.fumigatus var svår att plocka men något lättare att homogenisera vid prepareringen. Svårigheter att plocka kolonimaterial är främsta anledningen att flertalet provpositioner överlag gav resultatet NP. Annars kan NP ha uppstått på grund av ojämn provsättning på MADI-provplattan som medförde för lite proteiner till detektion. Sammanfattningsvis har svårigheterna att samla tillräckligt med kolonimaterial och att fördela det i lämplig mängd och homogent över MADI-provplattan gett mycket varierande resultat. Detta gör att utvärderingen av andra parametrar endast är preliminär. Jämförelse av suspension, direktapplicering och fullständig myrsyraextraktion Efter de två första försöken, som jämförde direktapplicering (II) och suspension i ultrarent vatten (III), beslutades att suspension i ultrarent vatten togs bort som preparationsmetod för fortsatta försök i denna studie. Direktapplicering (II) valdes som den snabbare preparationsmetoden att jämföra mot fullständig myrsyraextraktion (I). I början av studien (försök 1-2) testades fyra referensstammar. Utifrån resultaten bestämdes att använda korrekt identifierade arter (referensstammarna A.fumigatus och ) tillsammans med kliniskt isolat. A.niger och A.flavus uteslöts då de blev felaktigt identifierade och preparerades således aldrig med fullständig myrsyraextraktion (I). Möjligen skulle A.niger och A.flavus kunna bli korrekt identifierade genom fullständig myrsyraextraktion, eftersom denna preparationsmetod rekommenderas av tillverkaren i de fall direktapplicering inte fungerar. Ingen större skillnad i score-värden mellan frontmycel och sporer erhölls vid direktappliceringen, mer än att frontmycel oftare inte gav något spektrum, troligen beroende på för lite material. Vid vissa tillfällen hjälpte extrahering (exempelvis yngre kulturer för båda isolaten ; tabell IIIa och IVa) medan i andra fall var direktapplicering tillräcklig (exempelvis äldre kultur referensstam A.fumigatus; tabell IIb). Då referensspektra i både och Filamentous Fungi library skapats genom fullständig proteinextraktion förväntades högst överensstämmelse av spektra från mögelsvampar som preparerats med just fullständig myrsyraextraktion (20). Score 2,0 erhölls i högre utsträckning med extraktion, men uppnåddes i enstaka fall även vid direktapplicering. Den fullständig myrsyraextraktionen är ett lämpligt val vid fortsatta försök gällande plocktekniken, eftersom preparationen påverkar kvaliteten på spektra (22). Skillnader mellan databaser En intressant iakttagelse var att säkerheten i träffarna varierade mellan och, exempelvis för yngre kultur referensstam (försök 3 och 4; tabell - 17 -
III a), yngre kultur referensstam A.fumigatus (försök 3 och 5; tabell II a), yngre kultur kliniskt isolat (försök 4-6; tabell IV a) samt äldre kultur referensstam (försök 5 och 6; tabell III b). Skillnaden kan bero på att spektra i respektive är från mögelkulturer med olika odlingsbetingelser. Enligt personlig kommunikation med representant för tillverkaren har konstaterats att spektra i är från mögelkulturer odlade på agarplattor medan spektra i är från mögelkulturer odlade i buljong. Buljongodlingens fördel är att homogen växt av mycel erhålls med liten produktion av sporer, medan agarplattor ger fler växtfaser. Olika växtfaser ger i sin tur oftast olika spektra (22). Vid försök till sporpreparation från de yngsta kulturerna (1 dagar) kan materialet ändå till stor del ha bestått av mycel. Detta kan förklara varför överensstämmelse med Fungilibrary var bättre då databasen är baserad på proteinmönster från ungt mycel. Spektra som erhållit lägre score mellan 1,5 och 1,7 skulle kunna vara av god kvalitet, men matchar inte referensspektra i databasen och/eller Fungi ibrary, vilket kan tyda på att databaserna behöver utökas med fler spektra över och inom arter (27). Avsaknad av tillräckligt antal spektra från mögelsvamp är en nackdel som försvårar identifiering av kliniska isolat med MADI-TOF MS. Då en stor andel av proverna fick resultatet NP finns en viss osäkerhet i bedömningen av databaserna. Den av tillverkaren rekommenderade cut-off gränsen för artidentifiering är satt till score 2,0. Studier visar att en sänkning av cut-off från 2,0 till 1,7 kan användas för artidentifiering och ökar antalet korrekta artidentifieringar för vissa isolat (13, 16). Resultaten i denna studie visade att score 1,5 till och med 1,7 för just dessa fyra stammar gav rätt artidentifiering. Det kan vara av intresse att utvärdera den kliniska betydelsen av lägre score-gränser för tidig rapport av preliminära resultat. Tillväxtfas och fördelning av mycel respektive sporer Det klinska isolatet och referensstam skiljde sig åt morfologiskt gällande koloniernas struktur och färgnyans, samt att kliniskt isolat hade bredare frontmycel. Referensstam A.fumigatus hade smalast frontmycel med snabbare sporulering. Generellt resulterade detta i att sporer mestadels analyserades tillsammans med frontmycel på äldre kulturer. Vid lägre mängd inokulat sågs viss tendens till bredare frontmycel eller frontmycel under något längre tid. Frontmycel gav generellt färre träffar än sporer vid både direktapplicering och extraktion av äldre och yngre kultur, förmodligen främst beroende på att för lite material erhållits till analys. Med äldre kulturer, exempelvis referensstam A.fumigatus försök 6 och 7; tabell II b, sågs enstaka fall där frontmycel gav bättre resultat än sporer. Orsaken till detta är oklart. Oberoende av preparationsmetod var äldre sporer benägna att artidentifieras i till lägre score men identifierades inte i. Yngre kulturers sporer erhöll oftast över score 2,0 med, men lägre score med, eller blev inte alls identifierade med någon av databaserna. Detta kan bero - 18 -
på att yngre kulturers sporer snarare främst bestod av frontmycel med olika grad av sporulering och att erhållna spektra därför stämmer bättre överens med referensspektra i. Detta kunde studeras vid mikroskopering, utförd under enstaka tillfällen för de olika mognadsstadierna. Score > 2,0 sågs endast för de allra yngsta sporerna (1 dag) analyserad med. Det analyserade sporstadiet bestod snarare av mycel och de höga score-värdena kommer antagligen av god överensstämmelse mot spektra i som är framtagna på ungt mycel. De två dagar gamla sporerna gav generellt lägre score. En avvikande resultat sågs i försök 3 (tabell II a, III a) där score-värdet för yngre sporer blev sämre med, vilket kan ha berott på att kvarvarande etanol från extraheringen störde analysen. Fenomenet kunde dock inte förklaras av samma orsak i direktappliceringen, eftersom ingen etanol användes. Orsaken till sämre resultat med förblev oklar. Kontroll Den direktapplicerade positiva kontrollen S.aureus CCUG 15915 fick score-värde > 2,0 (tabell I) i samtliga analyser. Detta utesluter instrumentella fel som orsak till de sämre resultat som erhölls vid analys av mögelsvamparna. Problem och förbättringsförslag En del problem tillstötte under studien som att stor del av mögelkulturerna kontaminerades och att stora svårigheter fanns i att plocka upp mögelmaterial och samtidigt undvika agar. Kontamineringarna löstes med förbättrad arbetsstruktur vid odling och provsättning på MADI-provplatta och plocktekniken optimerades med träpinnen. Agar var vid en del tillfällen svårt att undvika och kan, som tidigare nämnts, mycket väl ha stört analyserna. För att eliminera misstänkt ojämn provsättning på MADI-provplattan skulle upprepade analyser på samma applicerade material kunna utföras, exempelvis där score < 1,7 erhållits. Extraktionen i denna studie har endast använt 70% myrsyra för att lysera cellväggen hos mögelsvampar. Olika koncentrationer skulle kunna testas då arter kanske kräver olika koncentration med tanke på kompositionsskillnader i cellväggen. TFA, som Bruker rekommenderar för sporbildande mikroorganismer, skulle kunna testas i olika koncentrationer (29). Vid fortsatta studier kan optimering för en art vara aktuellt. En fungerande metod kan sedan testas på fler kliniska stammar och en bredare kollektion av kliniskt relevanta arter. För att förkorta svarstiderna borde optimering utföras på yngre kolonier, exempelvis 1 och 2 dagar. Eventuellt skulle suspension i destillerat vatten (III) kunna utvärderas vidare tillsammans med direktapplicering (II), då det är intressant för laboratoriet att använda en mindre tidskrävande metod än fullständig myrsyraextraktion (I). Studier bör utföras som värderar betydelsen av olika beslutsregler för identifiering, - 19 -