Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 hp 2011 Evaluation of a Flow Cytometry Method for Identifying and Quantifying Fetal Red Blood Cells in Maternal Blood Camilla Nilsson Studieort: Mittuniversitetet, Sundsvall Handledare: Monica Brian, Anders Henriksson Klinisk kemi, Sundsvalls sjukhus
ABSTRACT Hemoglobin is an oxygen binding protein in erythrocytes. Hemoglobin is composed of four polypeptide chains. During the fetal stage the type of hemoglobin called fetal hemoglobin (HbF) dominates. After birth HbF is replaced by adult hemoglobin (HbA). HbF persists in concentrations less than 1%. Elevated concentration of HbF in adults exists in different conditions, Talassemi for example. When the uterus is damaged and the fetus doesn t feel well its blood can pass the placenta barrier and enter the blood stream of the mother. A venous blood sample from the mother is analyzed to determine the status of the fetus. Laboratory Medicine Västernorrland already has two methods for analyzing HbF, one routine and one on call. The routine method needed to be replaced and the possibility to use flow cytometry was investigated. In this study, results from flow cytometry using Fetal Cell Count kit was compared to the results from the presently used methods, Kleihauer-Betke and HPLC. Cord blood was diluted with venous blood from an adult with the same blood group in various concentrations. A number of tests were performed and showed a fairly good correlation between the different methods. However more tests will be necessary to draw any clear conclusion. KEYWORDS Kleihauer-Betke, Fetomaternal hemorrhage, Fetal hemoglobin, HPLC, Cord blood 2
INTRODUKTION Hemoglobin är ett syrebindande protein som finns i erytrocyterna. Hemoglobinet har tre livsviktiga funktioner; att binda syre för att transportera det från lungorna ut till övriga vävnader, att binda koldioxid i den perifera vävnaden för att transportera det till lungorna samt att agera som ett buffertsystem i blodet för att förhindra ändringar i ph utanför det fysiologiska riktområdet. Hemoglobinet som finns i de mänskliga erytrocyterna är uppbyggda av fyra polypeptidkedjor. I varje kedja finns en hemmolekyl som innehåller järn. Hemoglobin kan bestå av fyra olika polypeptidkedjor α-kedja, β-kedja, γ-kedja respektive δ-kedja. Under senare delen av fostertiden samt under de första levnadsmånaderna dominerar det fetala hemoglobinet (HbF) som består av två α-kedjor och två γ-kedjor, den senare hemoglobintypen är mer effektivt när det gäller transport av syre. Efter födseln börjar det fetala hemoglobinet att ersättas av adult hemoglobin (HbA) som är uppbyggt av två α- kedjor och två β-kedjor. Inom 3-6 månader kommer övergången att ske och HbA kommer sedan att dominera vid vuxen ålder medan HbF endast kommer att närvara i koncentrationer mindre än 1% av det totala hemoglobinet 1. När balansen mellan α- och β-globin förändras uppstår ett tillstånd som kallas för Talassemi. Talassemi förekommer i två former; α-talassemi och β-talassemi. De två olika formerna beror på vilken utav kedjorna som har en reducerad syntes. Båda Talassemiformerna förekommer i alla folkgrupper men har en ökad frekvens kring Medelhavet och i Asien. β- talassemi ger en brist på β-kedjor vilket ibland leder till en ökad syntes av HbF. Personer med β-talassemi kan alltså ha en högre koncentration HbF än normalt. Förhöjda värden av HbF kan även ses hos personer med en lindrigare form av sickle cell anemi. De kan även vara genetiskt betingade genom så kallad hereditärt persisterande HbF (HPFH) eller kan bero på vissa hematologiska maligniteter. Erytrocyter hos vuxna innehållande HbF kallas allmänt för F-celler [1]. Analys av HbF kan användas för flera ändamål, ett viktigt användningsområde är som en fingervisning för att se hur ett foster mår när det fortfarande ligger i livmodern. Att detta går att analysera utan att behöva ta prov eller på annat sätt störa fostret är så klart en stor fördel. När ett foster är skadat eller på annat sätt mår dåligt kan delar av dess blod gå över 1 www.nationalencyklopedin.se 3
placentabarriären och in i moderns blodomlopp, så kallat fetomaternell hemorrhage (FMH). Det finns flera anledningar till varför det är aktuellt att ta reda på om fostrets blod har läckt över till modern eller inte. Vid trauman som bilolyckor eller andra skador mot en gravid kvinnas buk kan prov tas för att säkerställa att fostret inte tagit skada [2]. En av de vanligaste anledningarna till analys av HbF på Sundsvalls sjukhus är vid oförklarad intrauterin fosterdöd. Då bör prov tas som en del av en utredning för att försöka ta reda på vad som gick fel [3]. Det går även att använda för att sätta en korrekt dos profylax till en RhD negativ kvinna som fött ett RhD positivt barn för att undvika immunisering. Detta utförs genom att uppskatta mängden blod som överförts till moderns blodomlopp. Det kan även vara aktuellt om det finns misstanke att fostret skulle lida av anemi. Vilken åtgärden blir vid ett positivt provresultat beror självklart på frågeställningen, men det kan ge läkarna en uppfattning om hur fostret mår och därifrån kan beslut fattas om det finns behov för några åtgärder [1]. På Laboratoriemedicin Västernorrland används för närvarande två olika metoder för att analysera HbF på gravida kvinnor. Rutinmetoden som används under dagtid är High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Vätskekromatografi använder sig av en mobil fas och en stationär fas, i detta fall en katjonbytare. Provet passerar tillsammans med en bärarvätska genom jonbytarkolonnen. Vid HPLC är den kolonn som provet ska passera genom så tätt packad att det inte går att bara låta bärarvätskan rinna igenom, därför behövs en högtryckspump som trycker bärarvätskan igenom kolonnen. Eftersom det genom kontrollförsök går att bestämma hur lång tid det tar för olika substanser att passera genom systemet går det att säga att den topp som kommer på diagrammet vid en speciell tidpunkt sannolikt är en speciell substans, se figur 1. Under jourtid används Kleihauer-Betke (KB) som metod. Då används det fetala hemoglobinets resistens mot syra för att utesluta att HbA färgas. Utstryket doppas i syra, vilket tömmer de vuxna erytrocyterna på HbA medan de erytrocyter som innehåller HbF förblir oförändrade. När utstryket sedan färgas blir erytrocyterna med HbF starkt röd-rosa medan de erytrocyter som innehöll HbA bara syns som svagt rosa skuggor, se figur 2 [4]. Kleihauer-Betke har visats vara kliniskt användbar för att upptäcka FMH, trots det är det en metod som lider av subjektivitet och imprecision. Metoden har en förmåga att överskatta mängden blod från fostret eftersom det inte går att skilja fostrets erytrocyter ifrån kvinnans egna erytrocyter som också kan innehålla HbF (F-celler) [1]. 4
Eftersom rutinmetoden för att analysera HbF med HPLC kommer att försvinna inom en snar framtid ämnar Laboratoriemedicin Västernorrland införa en ny metod som ska användas som rutinmetod. Behovet finns att hitta en metod som är relativt snabb och effektiv utan att för den sakens skull förlora den specificitet som HPLC inneburit. Då det finns flera undersökningar som visar på att analyser av HbF med hjälp av flödescytometri är en enkel och pålitlig metod förefaller införande av denna metod som ett bra alternativ [1,5]. Metoden grundar sig på användandet av Fetal Cell Count kit. Kitet baseras på en kombination av två antikroppar. En monoklonal antikropp riktad mot HbF som alltså bara finns i de fetala erytrocyterna samt i en liten del av de vuxna erytrocyterna (F-celler) samt en polyklonal antikropp riktad mot ett enzym som endast finns i vuxna erytrocyter, kallat karbanhydras. Det har bevisats att det finns väldigt lite karbanhydras i de fetala cellerna innan födsel. Produktionen av detta enzym slås på ungefär vid tiden för normal förlossning, alltså ungefär i gestationsvecka 40, men mängden celler som innehåller karbanhydras når vuxna nivåer tidigast efter 6 månader. Det innebär att denna metod kan skilja de erytrocyter med HbF som kommer ifrån ett foster från de erytrocyter med HbF som kommer ifrån en vuxen, se figur 3. Det gör att gravida kvinnor med egna förhöjda värden av HbF inte längre kommer att ge ett falskt positivt resultat 2 [6]. Detta har tidigare varit ett problem för de existerande metoderna eftersom de endast kan avgöra om det finns HbF i provet eller inte. De säger ingenting om hemoglobinet kommer ifrån fostret eller ifrån mamman. Det gick därför varken att fastställa eller utesluta att blodet kom från fostret vid närvaro av HbF så länge inte modern testats före graviditeten. Detta arbete bestod av att etablera en för Laboratoriemedicin Västernorrland ny metod för att analysera HbF. Genom litteraturstudier och praktiskt utförande har den nya metoden testats och utvärderats. De nuvarande metoderna har undersökts och jämförande prover har analyserats på alla metoder för att kunna se om det finns en tillfredsställande överensstämmelse mellan provsvaren. 2 www.iqproducts.nl 5
MATERIAL OCH METOD Eftersom antalet prover till dessa metoder är få och antalet prover som faktiskt är positiva är ännu färre späddes egna prover. Anledningen till att antalet prover är så lågt är att de flesta graviditeter går problemfritt och att det sällan finns någon anledning att oroa sig för fostret. Spädningarna utfördes genom att ta navelsträngsblod från nyfödda (där mödrarna fått lämna godkännande) och späda det i olika koncentrationer med blod tagit venöst från en frivillig vuxen med samma blodgrupp som barnet. Endast ABO och RhD-grupp togs hänsyn till. Inget ytterligare etiskt godkännande behövs eftersom metodetableringar ryms inom klinikens verksamhet. Blodet togs i EDTA-rör och förvarades i kyl i högst tre dagar fram till analys. Utstryk till Kleihauer-Betke utfördes genast och förvarades efter fixering högst två dagar i +4 C innan färgning. Provförberedelser Fyra omgångar med prover analyserades. Vid första analystillfället späddes prover med koncentrationer av navelsträngsblod på 0,5, 1, 5, 10, och 25%. Blodet kom ifrån navelsträngen på ett barn som hade blodgrupp A RhD-positiv och späddes med venblod från en vuxen kvinna med samma blodgrupp. Vid andra analystillfället späddes prover med koncentrationer av navelsträngsblod på 0,5, 1, 2 och 5%. Blodet kom ifrån navelsträngen på ett barn som hade blodgrupp A RhDpositiv och späddes med venblod från en vuxen kvinna med samma blodgrupp. Vid tredje analystillfället späddes prover med koncentrationer av navelsträngsblod på 0,5, 1, 2 och 5%. Blodet kom ifrån navelsträngen på ett barn som hade blodgrupp B RhDpositiv och späddes med venblod från en vuxen kvinna med samma blodgrupp. Vid fjärde analystillfället späddes prover med koncentrationer av navelsträngsblod på 0,5, 1, 2 och 5%. Blodet kom ifrån navelsträngen på ett barn som hade blodgrupp O RhDpositiv och späddes med venblod från en vuxen kvinna med samma blodgrupp. 6
Kleihauer-Betke (KB) Reagens Citrat-fosfat-buffert ph 3,3 Citrat-fosfat-buffert blandades genom ca 0,07M citrat och ca 0,05M fosfat. För att säkerställa att citrat-fosfat-bufferten hade ph 3,3 användes en ph-meter. Bufferten bereddes på nytt vid varje färgningstillfälle. Erytrosine 0,1% Erytrosine B (Merck & Co Inc, USA) löstes i vatten till en koncentration av 1g/L. Erytrosine bereddes på nytt vid varje färgningstillfälle. Utförande Utstryk utfördes på 3 objektglas som lufttorkades. Som negativ kontroll användes blod från en vuxen och som positiv kontroll användes navelsträngsblod. Glasen fixerades i 80% etanol i 5 minuter. Därefter sköljdes de under rinnande vatten och lufttorkades. Citrat-fosfat-bufferten hälldes i en färgningsbägare och förvärmdes sedan i 37 C under 10 minuter. Utstryken placerades i bufferten och inkuberades i 5 minuter, varefter de lyftes upp och ner en gång efter 1 minut och ytterligare en gång efter 3 minuter [7]. Utstryken sköljdes sedan 2 gånger med vatten i en färgningsbägare. Utstryken täcktes av surt hematoxylin (Sigma-Aldrich) enligt Mayer i 3 minuter. De sköljdes därefter med vatten. Utstryken färgades 3 minuter i 0,1% erytrosine. De sköljdes därefter i vatten och lufttorkades. När utstryken torkat räknades 1000 erytrocyter med immersionslins och andelen erytrocyter med fetalt hemoglobin angavs i procent. 7
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) De egenspädda proverna kördes tillsammans med de rutinprover som skulle analyseras för HbA1c. Först blandades blodspädningen väl i 10 minuter. De kontroller som användes var desamma som för HbA1c, en med hög och en med låg nivå (tillverkad på Laboratoriemedicin Västernorrland). Analysserien började och slutade alltid med de två kontrollerna, skulle dessutom fler än 40 prover analyseras sattes kontroller även i mitten. Minst 100µL kontroll pipetterades i varsitt uppmärkt eppendorfrör. 10µL prov blandades med 800µL borsyralösning med en koncentration på 0,1mol/L (tillverkad på Laboratoriemedicin Västernorrland) i eppendorfrör märkta med samma nummer som provet. Därefter förslöts rören och innehållet blandades på en vortex. Efter inkubering i 30 minuter vid 37 C centrifugerades proverna vid 2000g i 15 minuter. Därefter placerades proverna i maskinens kassett och den startades enligt instruktioner för maskinen. Proverna kördes i en Beckman Coulter HPLC System Gold med en PL-SAX förkolonn och en Mono S 5/50 GL kolonn eluerad med gradient av 0,02M malonsyra med 0,02% natriumazid, ph 5,7 till gradient av 0,02M malonsyra med 0,3M litiumklorid och 0,02% natriumazid, ph 5,7. Flödescytometri Till dessa försök användes Fetal Cell Count kit (IQ products, Nederländerna). Som kontroller användes en normal (negativ), en låg och en hög koncentration av HbF i ett kit. Kontrollernas koncentrationer kan ses i tabell 2. FETALtrol (Trillium Diagnostics, LLC). Förberedelser Innan analysen påbörjades späddes tvättlösningen (Flaska D) tio gånger med MilliQ-vatten. Först tvättades blodet med 6mL tvättlösning och centrifugerades vid 300g i 3 minuter. Permeabiliseringslösningen (Flaska C) fick anta rumstemperatur innan start. Kontrollerna fick även de anta rumstemperatur under 10 minuter utan att blandas. Efter det rullades kontrollerna horisontellt mellan handflatorna, för att sedan vändas försiktigt några gånger. Därefter behandlades kontrollerna som ett vanligt prov. 8
Utförande Några ändringar mot kitinsert genomfördes. Utförande skedde enligt följande. Först pipetterades 100µL fixeringslösning (Flaska A) till ett 10mL falconrör, därefter tillsattes 10µL blod som blandades med vortex. Efter det tillsattes 100µL fixeringslösning (Flaska B) och allt blandades på vortex. Cellblandningen inkuberades i rumstemperatur i 30 minuter. Cellsuspensionen blandades var femte minut. 2mL tvättlösning tillsattes och cellerna blandades på vortex. Cellsuspensionen centrifugerades vid 300g i 3 minuter. Supernatanten hälldes bort. 100µL tvättlösning tillsattes och cellpelleten resuspenderades och blandades på vortex. 100µL permeabiliseringslösning (Flaska C) tillsattes och cellerna resuspenderades genom att blandas på vortex. Cellsuspensionen inkuberades i 10 minuter. Därefter tillsattes 4mL tvättlösning och cellerna blandades genom att röret vändes ett par gånger. Cellsuspensionen centrifugerades vid 300g i 3 minuter och supernatanten hälldes bort. Cellpelleten resuspenderades i 1mL tvättlösning och blandades försiktigt på vortex. Till ett nytt falconrör sattes 50µL reagens E (polyklonal anti-humant karbanhydras-fitc), 50µL reagens F (monoklonal anti-human HbF-R-PE) och 50µL erytrocytsuspension. Blandningen inkuberades mörkt i rumstemperatur i 15 minuter. 2mL tvättlösning tillsattes och cellsuspensionen centrifugerades vid 300g i 3 minuter. Supernatanten hälldes bort. Cellpelleten resuspenderades i 500µL tvättlösning för att sedan köras i flödescytometern (BD FACSCalibur med CellQuest Pro) inom 30 minuter 2. 9
RESULTAT HPLC-digrammen visar en topp för HbF, en för HbA1c samt en för HbA. De visar dessutom varje topps procent av det totala värdet. HbF-toppen måste ofta ritas om på grund av en förlängd början på toppen som generellt kallas för HbX. Det är viktigt att den delen utesluts eftersom HbF-värdet annars blir för högt. Se figur 1. Figur 1. HPLC-diagram av ett prov med 5% koncentration av HbF. 10
Figur 2 visar tre exempel på utstryk färgade enligt Kleihauer-Betke. Den negativa och positiva kontrollen används för att se att färgningen har fungerat. På bilden med provet som innehöll 5% HbF (b) syns en tydlig skillnad mellan de olika cellerna. (a) (b) (c) Figur2.Bild på tre utstryk enligt Kleihaur-Betke (a) negativ kontroll, vuxen (b) prov med 5% koncentration av HbF (c) positiv kontroll, navelsträngsblod. Eftersom klungan med HbF låg så pass nära klungan med F-celler i flödescytometridiagrammen gick det inte att sätta kvadranterna på ett sådant sätt att varje grupp med celler hamnade i varsin kvadrant. Därför användes istället gater. Varje gate gavs en färg för att lättare åskadliggöra vilka celler som hör ihop, se figur 3. 11
(a) (b) (c) Figur 3. Tre flödescytometridiagram. (a) visar alla erytrocyter som ligger i region 1 (R1) Summan av dessa anges i gate 1 (G1), endast det ena visas i denna bild. De gröna klungorna är fetala blodceller som ligger i region 2 (R2). Summan av dessa anges i gate 2 (G2). De lila klungorna är F-celler som ligger i region 3 (R3). Summan av dessa anges i gate 3 (G3). (b) visar ett prov med 1% koncentration HbF (c) visar ett prov med 2% koncentration HbF. 12
I tabell 1 redovisas de erhållna resultaten för de olika spädningarna. För flödescytometri redovisas både de fetala cellerna och den vuxnas egna erytrocyter med HbF alltså F-celler. Den positiva kontrollen för KB redovisas inte. Vid varje tillfälle som prover kördes på flödescytometri kördes även de inköpta kontrollerna. I tabell 2 redovisas de erhållna resultaten för de olika kontrollerna. Tabell 1.Jämförelse mellan Kleihauer-Betke (KB), High Performance Liquid Chromatography (HPLC) och flödescytometri Datum Prov Koncentration Kleihauer- Betke HPLC Flödescytometri HbF F-celler 2011-03-31 1 Neg kontroll 0% 0% 0% 0% 0% 2011-03-31 2 0,5% 3% 0% 0,45% 2,21% 2011-03-31 3 1% 4% 0% 0,84% 2,26% 2011-03-31 4 5% 8% 3,49% 3,22% - 2011-03-31 5 10% - 7,94% 8,90% 2,36% 2011-03-31 6 25% - 20,18% 21,65% 3,18% 2011-04-20 7 Neg kontroll 0% 0% 0% 0% 0% 2011-04-20 8 0,5% 0,6% 0% 0,48% 0,86% 2011-04-20 9 1% 1% 0% 0,84% 0,75% 2011-04-20 10 2% 2,3% 1,69% 1,67% 1,04% 2011-04-20 11 5% 5,6% 4,11% 2,20% 1,2% 2011-04-28 12 Neg kontroll 0% 0% 0% 0% 0% 2011-04-28 13 0,5% 0,6% 0% 0,48% 1,54% 2011-04-28 14 1% 1,2% 0,97% 0,73% 1,95% 2011-04-28 15 2% 1,6% 1,79% 1,81% 1,54% 2011-04-28 16 5% 5,5% 4,24% 4,02% 1,92% 2011-05-13 17 Neg kontroll 0% - 0% 0% - 2011-05-13 18 0,5% - 0% 0,37% - 2011-05-13 19 1% - 0% 1% - 2011-05-13 20 2% - 1,57% 1,03% - 2011-05-13 21 5% - 3,98% 2,86% - 13
Tabell 2. Jämförelse mellan kontrollerna på flödescytometri för de skilda analystillfällena Datum Normal kontroll Låg kontroll Hög kontroll (0,0-0,03%) (0,14-0,22%) (1,28-1,72%) 2011-03-31 0,05% 0,14% 1,43% 2011-04-20 0,09% 0,26% 1,53% 2011-04-28 0,03% 0,04% 1,26% 2011-05-13 0,03% 0,18% 1,03% DISKUSSION Det är en stor fördel att på förhand veta vilka koncentrationer proverna som ska analyseras har när nya metoder ska testas. Men det ligger även en viss felkälla i spädningsmomentet. Blod är svårt att pipettera i exakta mängder, vilket gör att det inte går att säkerställa att alla prover hade exakt de avsedda koncentrationerna. Det kan även påverka de färdiga resultaten att koncentrationerna är kända innan då det alltid finns en risk att resultaten omedvetet justeras för att de ska passa bättre in mot den kända koncentrationen. Därför bör det vid fortsatta försök även köras prover där koncentrationen inte är känd för den som analyserar. Att Kleihauer-Betke (KB) ger förhöjda resultat i förhållande till flödescytometri kan bero på svårigheten att räkna på ett rättvisande sätt [4,8]. Detta har dock Laboratoriemedicin Västernorrland åtgärdat genom att endast ett fåtal personer med mycket vana inom området räknar cellerna. En annan anledning till de förhöjda resultaten är att det inte finns något i KB som gör att de fetala röda blodkropparna kan skiljas ifrån F-cellerna. Det gör att resultaten för KB teoretiskt sett bör stämma överens med den sammanlagda koncentrationen av HbF och F- celler i flödescytometri. Att resultaten för KB i första försöket är så mycket högre beror på att 14
det där utfördes ett försök att räkna cellerna med ett retikulocytokular. Detsamma utfördes även under andra och tredje försöket men jämfördes då mot det resultat som blev när ett vanligt okular användes och 1000 erytrocyter räknades. De resultat som erhölls när 1000 celler räknades visade sig vara mycket mer rättvisande, vilket verkar troligt eftersom det har tagit hänsyn till en större del en utstrykets celler. Kontrollernas resultat efter de första tre omgångarna stämde inte alls överens med kitinsertet. De varierade mycket i förhållande till varandra men även mot sig själva mellan de olika omgångarna. På grund av kontrollernas korta hållbarhet var det endast vid det första analystillfället som de fortfarande var giltiga. Både vid den andra och det tredje analystillfället hade kontrollerna egentligen passerat sitt bäst före datum, vilket kan tänkas förklara de dåliga resultaten. För att undersöka om det var kontrollernas hållbarhet som var problemet med de varierande värdena testades även en ny förpackning kontroller. Där datumet fortfarande var giltigt. Det visade sig då att utvärderingen av resultatet av kontrollerna var lite mer svårtolkat än för proverna. Det är svårt att skilja de olika grupperna av celler åt vilket gjorde att de tidigare diagrammen var tvungna att omvärderas. Detta gav i slutändan mer acceptabla resultat som redovisas i tabell 2. Den extra undersökningen av kontrollerna utfördes tillsammans med spädda prover för att efterlikna tidigare körningar så mycket som möjligt, dessa prover analyserades aldrig med KB. Anledningen till att prover med lite högre koncentration av HbF inte kördes fler än en gång i flödescytometern beror på att resultatet inte blir pålitligt eftersom en slöja av celler hänger ner under HbF-klungan ända ner i den nedre vänstra kvadranten. Dessa celler kan vara döda celler, vilka gör det svårt att säga vilka celler som är fetala. Detta är en nackdel för flödescytometrimetoden i förhållande till HPLC. Dock kan sägas att så höga koncentrationer som 10-25% inte förekommer i riktiga prover och att ha en metod som kan mäta så högt är därför inte nödvändigt. En fördel med flödescytometrin är dess förmåga att detektera även låga koncentrationer HbF, något som inte HPLC lyckades med. Eftersom även små mängder blod som går över från fostret till modern kan orsaka antikroppsbildning hos en RhD-negativ moder kan även låga koncentrationer vara av intresse [9]. Tidigare har andra studier med flödescytometrimetoder utförts där endast en antikropp mot HbF använts. Även dessa har visat bra resultat. Det använda kitet har ändå en stor fördel i 15
att ha en till antikropp som gör det möjligt att ytterligare skilja fostrets och moderns celler åt. Det finns även metoder som förutom HbF även märker in RhD, men dessa metoder fungerar endast på mödrar som har en annan RhD-grupp än sina barn. Den testade metoden är mer allsidig och i slutändan också mer pålitlig eftersom den gör det enklare för även den oefarne att få ett rättvisande provresultat [10,11]. Det som däremot är en stor nackdel för flödescytometri i jämförelse med KB och HPLC är ekonomi. Det är relativt dyrt att köpa in både det använda kitet och kontrollerna. Eftersom det dessutom är så få prover till den här typen av analys gör det att risken finns att utgångsdatumet hinner nås innan produkten har hunnit användas upp. Detta måste vägas mot KB och HPLC där nästan alla de använda lösningarna blandas på plats och på så sätt håller kostnaderna nere. Den stora nackdelen som både HPLC och KB delar är deras oförmåga att skilja fetala erytrocyter med HbF från F-celler. Detta gör flödescytometrin överlägsen för diagnostisering av kvinnor med någon form av sjukdom som påverkar syntesen av HbF [1]. Detta kan vara extremt viktigt om metoden ska användas för att beräkna mängden profylax som ska ges till en kvinna efter förlossning. Om kvinnans egna F-celler misstas för fostrets röda blodkroppar kan onödiga mängder profylax ordineras. Detta eftersom prov taget efter injektion av profylax då hela tiden kommer att visa att HbF persisterar och mer profylax kommer därför att ordineras [8]. Men så länge metoden inte kommer att användas för att beräkna mängden profylax utan endast mer som en screeningmetod för att se om blod gått över fungerar KB utmärkt [12]. Flödescytometrimetodens problem ligger i dess långa förberedelser samt att endast ett fåtal i personalen på Laboratoriemedicin Västernorrland är utbildade på flödescytometern. Att förberedelserna tar runt två timmar och att det egentligen inte finns några tillfällen att hinna göra något annat är förstås ett stort minus. Leverantörens löfte om färdiga resultat inom 2 timmar är kanske rimligt vid rejält inkörda rutiner och när endast ett prov åt gången ska göras i ordning. Det ska även nämnas att det inte är bara flödescytometrimetodens förberedelser som tar tid, även för KB tar spädningen av reagensen tid. För att vara helt säker på att spädningarna var pålitliga borde egentligen det venösa blodet från en vuxen som navelsträngsblodet späddes med kommit ifrån en frisk vuxen man med samma blodgrupp. Detta för att utesluta möjligheten att navelsträngsblodet späddes med 16
blod ifrån en kvinna som inte visste att hon var gravid. Det skulle kunna resultera i falskt förhöjda värden. Dessutom borde lite grundligare undersökning utförts för att kontrollera så att de vuxna blodgivarna inte ovetandes hade någon av de tillstånd som gör att HbF-koncentrationen kan vara förhöjt. Det skulle vara intressant att köra prover från en person med något av de tillstånd som gör att de naturligt har en förhöjd koncentration HbF i blodet [13]. För att se om metoden kan (vilket den ska kunna) skilja dessa åt från fetala erytrocyter med HbF. Sett till alla resultat så verkar korrelationen mellan de tre metoderna vara hyfsad. Det går inte att dra några klara slutsatser eftersom alldeles för få prover har kunnat analyseras. För att säkerställa att metoden för att analysera HbF med flödescytometri ska vara säker att användas bör alltså betydligt fler prov analyseras. Tillgång på navelsträngsblod har varit den största anledningen till att det inte funnits möjlighet att köra fler omgångar. ACKNOWLEDGEMENT Detta arbete har kunnat genomföras tack vare många människor. Först vill jag tacka Monica Brian som har offrat mycket utav sin egen tid och varit till stor hjälp uppe på labet. Jag vill dessutom tacka Anders Henriksson, personalen på HPLC som hjälpt mig köra prover samt personalen på förlossningen på Sundsvalls sjukhus för att de skaffade navelsträngsblod åt mig. Jag vill även tacka de personer på Laboratoriemedicin Västernorrland som lämnade blod så att jag kunde göra mina spädningar. 17
REFERENSER [1] Porra V, Bernaud J, Gueret P, et al. Identification and quantification of fetal red blood cells in maternal blood by dual-color flow cytometric method: evaluation of the fetal cell count kit. Transfusion 2007; 47: 1281-1289. [2] Hanefeld Dziegiel M, Kofoed Nielsen L, Berkowicz A. Detecting fetomaternal hemorrhage by flow cytometry. Current Opinion in Hematology 2006; 13: 490-495. [3] Petersson K, Hulthén-Varli I. Ökad kunskap om intrauterin fosterdöd kan på sikt minska antalet fall. Läkartidningen 2003; 100: 2512-2516. [4] Duckett J.R.A, Constantine G. The Kleihauer technique: an accurate method of quantifying fetomaternal haemorrhage? British Journal of Obstetrics and Gynaecology 1997; 104: 845-846. [5] Janssen W.C.M, Hoffmann J.J.M.L. Evaluation of flow cytometric enumeration of foetal erythrocytes in maternal blood. Clinical and Laboratory Haematology 2002; 24: 89-92. [6] Akbar S.A, Brown P.R. Measurement of human erythrocyte CAI and CAII in adult, Newborn, and Fetal Blood. Clinical Biochemistry 1996; 29: 157-164. [7] Salzberg M. Påvisande av erytrocyter innehållande fetalt hämoglobin i blodutstryk enl. kleihauer. Läkartidningen 1959; 56: 2845-2850. [8] Iyer R, Mcelhinney B, Heasley N, et al. False positive Kleihauer tests and unnecessary administration of anti-d immunoglobulin. Clinical and Laboratory Haematology 2003; 25: 405-408. [9] Chen J.C, Davis B.H, Wood B, et al. Multicenter clinical experience with flow cytometric method for fetomaternal hemorrhage detection. Cytometry (Clinical Cytometry) 2002; 50: 285-290. [10] Johnson P.R.E, Tait R.C, Austin E.B, et al. Flow cytometry in diagnosis and management of large fetomaternal haemorrhage. Journal of Clinical Pathology 1995; 48: 1005-1008. 18
[11] Davis B.H, Olsen S, Bigelow N.C, et al. Detection of fetal red cells in fetomaternal hemorrhage using a fetal hemoglobin monoclonal antibody by flow cytometry. Transfusion 1998; 38: 749-756. [12] Bromilow I.M, Duguid J.K.M. Measurement of feto-maternal haemorrhage: a comparative study of three Kleihauer techniques and two flow cytometry methods. Clinical and Laboratory Haematology 1997; 19: 137-142. [13] Patton W.N, Nicholson G.S, Sawers A.H, et al. Assessment of fetal-maternal haemorrhage in mothers with hereditary persistence of fetal haemoglobin. Journal of Clinical Pathology 1990; 43: 728-731. 19