Validation of Steins/Arla Foods method for lactate fermenting clostridia in milk

Transkript

1 Uppsala universitet Medicinska fakulteten Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Validation of Steins/Arla Foods method for lactate fermenting clostridia in milk Jessica Flodin Anders Christiansson, Svensk Mjölk, Lund Lena Tryggvason, Eurofins Steins Laboratorium AB, Jönköping

2 Abstract One of the most serious and economically important defects caused by clostridia in milk products is the late blowing of semi-hard cheeses. Clostridia occur naturally in soil and can contaminate milk through crops contaminated by dung and soil followed by a less successful silage process, that give them opportunity to grow unaerobically. When anaerobic conditions occur, such as storage of semi-hard cheese, they ferment lactic acid to butyric acid and the gases CO 2 and H 2. At the fusion of Arla and MD Foods, a series of changes were conducted on the MPN method for lactic acid fermentation for clostridia in milk. These changes resulted in an increased accuracy due to an increased number of test tubes and the change of media from MRCM to BBB, Bryant & Burkey Broth, that was thought to be more selective for Cl. tyrobutyricum, the organism mostly found in hard cheese. When the number of dairy farmers that were given quality reduction fines increased, the new method was suspected and a validation was conducted. The validation included inoculation of different clostridia and bacillus strains into BBB substrate and enzymatic testing of positive samples with Rapid ID 32A. The inoculation result showed that almost all tested different clostridia strains could grow in BBB substrate. Test on BBB positive tubes with Rapid ID 32A resulted in 95% clostridia of which 70% was Cl. tyrobutyricum. These results correlated well with earlier studies on MRCM substrate and the increase in quality reduction fines probably depended on the larger number of test tubes used in the new method rather than the change of substrate. Sammanfattning Clostridier eller främst Cl. tyrobutyricum är den art som i de flesta fall orsakar feljästa eller sönderjästa ostar, vilket är ett välkänt problem inom mejeriindustrin. Clostridiesporer finns naturligt i jord och hamnar i mjölkråvaran via gröda som kontaminerats med gödsel och jord och som tillsammans med en mindre lyckad ensileringsprocess gör att clostridierna växer till. När anaeroba förhållanden uppstår, såsom vid lagring av hårdost, förjäser clostridierna laktat och smörsyra varvid vätgas och koldioxid bildas. I samband med fusionen av Arla/MD Foods, genomfördes metodförändringar för MPNmetoden för laktatjäsande clostridier i mjölk, som används inom mjölkbedömningen. Dessa förändringar innebar en skärpning i noggrannheten genom att man ökade antal rör, samt ett substratbyte från MRCM till BBB, Bryant & Burkey Broth, som ansågs mer gynnsamt för Cl. tyrobutyricum. Då antalet mjölkproducenter som fick kvalitetsavdrag ökade, riktades misstankar mot den nya metoden och en validering genomfördes. Resultatet av valideringen, som innebar ympning av renkulturer, utodling av positiva rör med efterföljande typning, visade att de flesta av de tillsatta stammarna av clostridier hade förmågan att ge ett positivt utslag vid tillsats av renkulturer. Utodling och typning av positiva rör visade att ca 70 % av de positiva utslagen innehöll Cl. tyrobutyricum och hela 95 % någon clostridieart. Dessa resultat korrelerar med tidigare studier på MRCM-substrat och ökningen av positiva utslag berodde troligtvis på det ökade antalet rör som den nya metoden innebar. 2

3 Keywords Clostridium tyrobutyricum, silage, hard-cheese blowing, MPN-methods. 1. Introduktion Anaeroba sporbildare av arten clostridium är ett välkänt problem för mejerierna vid osttillverkningen. Clostridierna hamnar i mjölkråvaran via gröda som förorenats med gödsel och jord och som tillsammans med en mindre lyckad ensileringsprocess gör så att clostridierna växer till. Av clostridiearterna är Clostridium tyrobutyricum den, vilken i de flesta fall orsakar feljästa eller sönderjästa ostar (1, 2). För mejerierna innebär detta ett ekonomiskt bortfall eftersom korrigeringsmöjligheterna av råvaran är begränsad. Tidigare använda metoder för att förhindra sporgroning som exempelvis tillsats av salpeter till ystmjölken, har reglerats och de mekanisk-termiska metoderna för att reducera sporhalten är kostsamma. På gårdsnivå kan även mjölkproducenterna drabbas ekonomiskt, dels via avdrag på grund av hög sporhalt i mjölken och dels av energiförluster på ensilaget, som en kraftig tillväxt av bakterier orsakar (3). Eftersom sporerna överförs till mjölken via kontaminering av spenarna, är även sporförekomsten i mjölken en möjlig användbar markör på rengöringsrutiner av spenar och juver. Då det är stora värden som står på spel om dessa bakterier utvecklas i färdiga produkter, har man på senare år satsat utvecklingsresurser på ensilerings-och rengöringsrutiner för mjölkproducenterna, samt för att få fram säkra och användbara analysmetoder (3-5). Clostridier är naturliga jordbakterier, och dess sporer överlever olika former av värmebehandling, exempelvis normal pastörisering. Om anaeroba förhållanden uppstår såsom vid lagring av hårdost, uppstår optimala förhållanden för sporgroning, och en övergång till vegetativ fas kan ske. Fördelningen av clostridier i sönderjäst ost och ensilage har tidigare beskrivits (1, 6) där Cl. tyrobutyricum visade sig vara den mest förekommande (70-75%), men även andra arter av Clostridium, såsom Cl. butyricum, Cl. beijerinckii och Cl. sporogenes var vanliga. I ostens lagringsfas förjäser Cl. tyrobutyricum mjölksyra till smörsyra samtidigt som koldioxid och vätgas bildas. Smörsyran ger en sötbesk karakteristisk smak och gasbildningen leder till okontrollerad hålbildning och sönderjäst trasig form. Sporerna förekommer normalt i så låga halter i mjölkråvaran att de inte kan analyseras med konventionell teknik, såsom plattspridning. Trots den låga halten blir mjölkens lämplighet som råvara begränsad för produktion av ost (3). För bedömning av sporhalt i leverantörmjölk är man av kostnads och tidsskäl hänvisad till förenklade rörmetoder så kallade MPN (most probable number) metoder (2). Principen för dessa metoder är att man fördelar en bestämd mängd mjölk i rör med odlingssubstrat och paraffin för att skapa en anaerob miljö. Rören värmebehandlas för att avdöda vegetativa celler och initiera sporgroning, ofta 80 C i 10 min. Vid efterföljande inkubering gror sporerna ut och tillväxer. Med ledning av antalet positiva rör görs sedan en bedömning av sporhalten. Med positivt rör menas en gasutveckling som synligt har lyft paraffinproppen. Höga sporhalter medför hög sannolikhet att samtliga rör innehåller sporer och ger positivt utslag, medan låg sporhalt innebär låg sannolikhet. Analysvolymerna är anpassade så att leverantörer med höga sporhalter alltid detekteras, samtidigt som leverantörer med låga eller mycket låga sporhalter inte riskerar att få utslag i analysen. 3

4 Vid analys av clostridiesporer har man tidigare i Sverige använt rör innehållande RCM, Reinforced Clostridial Medium och MRCM, Modified Reinforced Clostridial Medium (7). Vid Arlas fusion med danska MD Foods, genomfördes ytterligare metodförändringar för att bönder inom Arla Foods skulle få en likvärdig bedömning. Metodförändringen innebar bland annat övergång till automatiserad pipettering, ökning av antal rör från tre till tolv och byte av substrat till BBB, Bryant and Burkey Broth (6). BBB innehåller laktat som Cl. tyrobutyricum kan utnyttja för tillväxt medan många andra clostridier inte har denna egenskap, samt har ett ph-värde nära 6,0 vilket anses ge kraftigare gasutveckling hos Cl. tyrobutyricum (1, 8), jämfört med RCM som har ph 6,8 och innehåller glukos, som teoretiskt sett kan utnyttjas av ett större spektrum clostridier. Det finns en rad olika test för identifiering av anaerober, såsom konventionell mikrobiologisk typning, API 20 A, Elisa-test och PCR-metoder (9, 10). I detta arbete valdes enzymatiska identifikationssystemet Rapid ID 32 A, då den är flitigt använd och väldokumenterad, snabb och att den kan typa ett relativt stort antal arter av clostridium (11, 12). Valet var även baserat på vad för arter man kunde förväntas påträffa i mjölk, med ledning av tidigare studier. Syftet med detta examensarbete har varit att validera MPN-metoden som för närvarande används inom mjölkbedömningen, dels för att se om det är några andra bakterier förutom laktatjäsande clostridier som kan växa fram och dels för att se hur fördelningen av olika clostridiearter ser ut i producentmjölken. När det gäller andra bakterier som eventuellt kunde tänkas växa fram, riktades energi främst på bacillusarter på grund av deras vanliga förekomst i producentmjölk. Arbetet påbörjades genom att ympa referensstammar av olika clostridie- och bacillusarter i UHT-mjölk, BBB och paraffin enligt Steins Laboratorium AB:s/Arla Foods metod för laktatjäsande clostridier i mjölk för att få en bild av vad som kan tänkas ge positivt utslag i analysen. Med ledning av detta resultatet, utfördes sedan en ympning av ytterligare Bacillus polymyxa-stammar på samma sätt. I nästa steg användes positiva producentmjölksprov, som odlades ut på RCA-agar samt BBBagar. Efter renodling, mikroskopiering och vidare renodling på RCM, typades stammarna med Rapid ID 32 A. Resultatet av typningen gav 95 % clostridiearter, varav 69 % av dessa var Cl. tyrobutyricum. 4

5 2. Metod och material I följande del presenteras utförandet. Vissa modifieringar fick genomföras, då kolonimaterialet var för litet för att slammas från blodagar, som var rekommenderat substrat, för att räcka till för typningen med Rapid ID 32 A. För övrigt följdes metodbeskrivningen för laktatjäsande clostridier i mjölk och typningsprotokoll som medföljde rapid ID 32 A-kitet. 2.1 Renkulturer/referensstammar Till försöken användes renkulturer av clostridier och bacillus som finns presenterade i tabell 1 och 2, som referensstammar. Dessa har tillhandahållits av och typats av Svensk Mjölk i Lund. Stammarna förvarades frysta i skummjölk eller nutrient broth med tillsats av 10% glycerol fram till användning. Tabell 1. Renkulturer av clostridier från Svensk Mjölk ID Ursprung Namn 184 Falkenberg, ost Clostridium tyrobutyricum 185 Falkenberg, ost Clostridium tyrobutyricum 190 Hörby, mjölk Clostridium perfringens 191 Kemikalia, löpe Clostridium limosum 193 Hörby, rcm-rör Clostridium tyrobutyricum 195 Alnarp, mjölk Clostridium sticklandi 199 NCDO, 1710 Clostridium sporogenes 200 NCDO, 1712 Clostridium acetobutylicum 205 ATCC, Clostridium butyricum Clostridium pasteurianum 214 SLU 214 Clostridium tyrobutyricum 231 Kalmar NIZO-rör Clostridium tyrobutyricum 233 Kalmar NIZO-rör Clostridium bifermentans 235 Kalmar NIZO-rör Clostridium sporogenes 239 ATCC 6014 Clostridium beijerinckii 242 ATCC Clostridium sporogenes 355 Statens Livsmedelsverk Clostridium sordellii 360 NCDO 1755 Clostridium tyrobutyricum 364 Norge, ost Clostridium tyrobutyricum 5

6 Tabell 2. Renkulturer av bacillus från Svensk mjölk ID Ursprung Namn 131 Umeå 4 Bacillus cereus 143 ATCC Bacillus polymyxa ? Bacillus subtilis 155 ATCC Bacillus cereus 175 Lund, Kemikalia Bacillus sphaericus 180? Bacillus megaterium 713 ATCC Bacillus megaterium 715 ATCC 6051 Bacillus subtilis 716 Mikrob. Inst. Lunds Universitet Bacillus brevis 754 HER 1231 Bacillus thuringiensis 758 ATCC Bacillus var mycoides 763 CCUG 7416 Bacillus circulans 765 Lund, livsmedelshygien Bacillus amyloliquefaciens 766 CCUG 7422 Bacillus licheniformis 769 CCUG 7426 Bacillus polymyxa 770 CCUG Bacillus pumilis 2.2 Ympning av renkulturer i UHT-mjölk och BBB Ympningsförfarande 10 µl av okända koncentrationer av renkulturer av bacillus och clostridier, ympades i rör innehållande 2 ml UHT-mjölk (Arla Foods, Tillsats av odlingssubstrat/värmebehandling/inkubering 8 ml BBB tillsattes manuellt till en slutlig volym av 10 ml. Rören paraffinerades och värmebehandlades i 80ºC i 10 min. Efter avsvalning om minst 30 min, inkuberades rören i 37ºC i 4 dygn ± 4 h Växtkontroll Kontroll av växt på samtliga renkulturer efter värmebehandling utfördes genom utodling på BBB-agar. Detta för att försäkra sig om att tillräckligt antal sporer hade ympats i rören samt för att se om renkulturerna överlevde värmebehandlingen Avläsning av rör Avläsningen av rören skedde enligt Steins/Arlas metod för laktatjäsande clostridier i mjölk, i avseendet vad som anses som tillräcklig gasbildning för att gälla som ett positivt utslag. 6

7 2.3 Ympning av renkulturer, Bacillus polymyxa Med anledning av att en bacillus-art, Bacillus polymyxa kunde ge positivt utslag, ympades fler stammar av just denna art. Utförandet samt utvärdering skedde på samma sätt som för redan ympade renkulturer. Även dessa stammar tillhandahölls av Svensk Mjölk i Lund. Stammarnas identitet redovisas i tabell 3. Tabell 3. Renkulturer av Bacillus polymyxa från Svensk Mjölk. ID Källa Art Bacillus polymyxa 782 Bacillus polymyxa 783 Uppsala, jordprov Bacillus polymyxa 784 Bacillus polymyxa 785 Bacillus polymyxa 786 Bacillus polymyxa 787 Bacillus polymyxa 788 Bacillus polymyxa 789 Bacillus polymyxa 790 Bacillus polymyxa 791 Bacillus polymyxa 792 Bacillus polymyxa 2.4 Utodling av positiva leverantörsprov Urval av prov Positiva rör (figur 1), totalt 103 st, analyserade enligt Steins/Arlas metod för laktatjäsande clostridier, plockades slumpmässigt ut under perioden februari 2006 till maj Innehållet i rören blandades noggrant och 10 µl odlades ut på Reinforced clostridial agar (Oxoid, och BBB-agar (Biokar, Plattorna inkuberades anaerobt i 37ºC, h. Figur 1. Positivt rör, efter 96 h inkubering i 37 C 7

8 2.4.2 Utvärdering av kolonimaterial I detta moment kontrollerades renheten på kolonimaterialet, samt om det var fler än en sorts kolonimorfologi som uppträdde. Utvalda kolonier odlades från BBB-agarn ut på RCM agar och Columbia blood agar base (Oxoid) med tillsats av 5 % fårblod, följt av anaerob inkubering i 37ºC, h. 2.5 Modifieringar Byte av odlingssubstrat I protokollet för Rapid ID 32 A (Bio-merieux, rekommenderades blodagar med tillsats av fårblod som odlingsplatta för typning. Då kolonimaterialet blev begränsat vid användning av blodagar, framförallt för Cl. tyrobutyricum, användes istället RCM som sista steg före typning. 2.6 Verifiering av existerande (modifierad), typningsmetod Typning av renkulturer med Rapid ID 32 A, modifierad version. Befintliga renkulturer av clostridier och Bacillus polymyxa odlades ut på RCM och typades med Rapid ID 32 A, för att utröna eventuella skillnader som kan uppkomma vid byte av rekommenderat substrat. Renkulturer av clostridier användes senare som kontroller vid varje typningsomgång. 2.7 Kompletterande tester Innan typning med Rapid ID 32 A (Bio-merieux, utfördes kompletterande tester i form av mikroskopering, KOH-test, samt morfologisk beskrivning av utvalda kolonier. 2.8 Typning med Rapid ID 32 A Utfördes enligt Rapid ID 32 A protokoll, med avvikelsen beskriven i Tolkning av resultat För utvärderingen av resultatet användes API Web (Bio-merieux), och CCUG:s databas (Culture Collection, University of Gothenburg). 8

9 3. Resultat 3.1. Ympning av renkulturer i BBB-rör Resultatet i tabell 4 och 5 visar hur renkulturerna gav positivt utslag per totalt antal rör. Tabell 4. Resultat av renkulturer clostridier i BBB. ID Art Utslag (Antal positiva/totalt antal rör) 184 Clostridium tyrobutyricum 12/ Clostridium tyrobutyricum 12/ Clostridium perfringens 0/ Clostridium limosum 12/ Clostridium tyrobutyricum 12/ Clostridium sticklandi 9/ Clostridium sporogenes 12/ Clostridium acetobutylicum 12/ Clostridium butyricum 12/ Clostridium pasteurianum 12/ Clostridium tyrobutyricum 12/ Clostridium tyrobutyricum 12/ Clostridium bifermentans 12/ Clostridium sporogenes 12/ Clostridium beijerinckii 12/ Clostridium sporogenes 12/ Clostridium sordellii 1/ Clostridium tyrobutyricum 12/ Clostridium tyrobutyricum 12/12 9

10 Tabell 5. Resultat av renkulturer bacillus i BBB. ID Art Utslag (Antal positiva/totalt antal rör) 131 Bacillus cereus 0/ Bacillus polymyxa 0/ Bacillus subtilis 0/ Bacillus cereus 0/ Bacillus sphaericus 0/ Bacillus megaterium 0/ Bacillus megaterium 0/ Bacillus subtilis 0/ Bacillus brevis 0/ Bacillus thuringiensis 0/ Bacillus var mycoides 0/ Bacillus circulans 0/ Bacillus amyloliquefaciens 0/ Bacillus licheniformis 0/ Bacillus polymyxa 12/ Bacillus pumilis 0/12 Tabell 5. Av referensstammarna gav alla clostridier utom ID 190 positivt utslag (tabell 4), medan endast en av bacillusstammarna, ID 769 som var en Bacillus polymyxa, gav positivt utslag (tabell 5). 3.2 Ympning av renkulturer. Med anledning av resultatet av i tabell 5, med avseende på stam 769, Bacillus polymyxa, utfördes kompletterande analyser med ytterligare 13 st Bacillus polymyxa stammar vilket redovisas resultatet i tabell 6. Tabell 6. Renkulturer av Bacillus polymyxa. ID Källa Art Utslag (antal positiva/totalt antal rör) Bacillus polymyxa 0/ MCIMB 4447 Bacillus polymyxa 0/ Uppsala, jordprov Bacillus polymyxa 0/ MCIMB 7575 Bacillus polymyxa 0/ MCIMB 8094 Bacillus polymyxa 0/ MCIMB 8158 Bacillus polymyxa 4/ MCIMB 8228 Bacillus polymyxa 0/ MCIMB 8524 Bacillus polymyxa 4/ MCIMB 8599 Bacillus polymyxa 0/ MCIMB 8648 Bacillus polymyxa 0/ MCIMB Bacillus polymyxa 9/ MCIMB 4496 Bacillus polymyxa 0/12 Tabell 6. Av de 13 Bacillus polymyxa stammarna (tabell 6), gav 3 av dem positiva utslag vid ympningen. 10

11 3.3 Resultat av verifiering av Rapid ID 32 A, modifierad version Modifieringen som innebar ett substratbyte, RCM istället för rekommenderad blodagar, visade inga synbara skillnader i reaktionsmönster jämfört med blodagar vid typningen med Rapid ID 32 A, som var ett kontrollförfarande. Därför användes resultatet av typningen på kolonierna från de positiva producentmjölksproven utan att ta någon hänsyn till substratbytet. 3.4 Resultat typning av positiva producentmjölksprov med Rapid ID 32 A I tabell 7 redovisas resultatet av 103 utplockade positiva rör från lika många mjölkproducenter, analyserade enligt Steins/Arlas metod för laktatjäsande clostridier i mjölk och därefter typade med Rapid ID 32 A. Tabell 7. Resultat av typning med Rapid ID 32 A. Art Antal Clostridium tyrobutyricum 70 Clostridium beijerinckii/butyricum a) 10 Clostridium acetobutylicum 3 Clostridium perfringens 9 Clostridium fallax 1 Clostridium bifermentans 2 Clostridium sp 3 Okända b) 5 a). Rapid ID 32 A kunde ej skilja Cl. beijerinckii och Cl. butyricum åt biokemiskt. b). Okända är detta fall de som ej kunde typas med Rapid ID 32 A. I Tabell 7 ses att den vanligast förekommande clostridiearten i de positiva leverantörsproven var Cl. tyrobutyricum, följt av Cl. beijerinckii/butyricum och Cl. perfringens. 4. Diskussion Valideringen av Steins/Arlas MPN-metod för laktatjäsande klostridier utfördes på grund av de metodförändringar som genomfördes i samband med fusionen av Arla/MD Foods. Metodförändringarna innebar dels ett substratbyte, från MRCM till BBB (Bryant & Burkey Broth), samt dels en skärpning i noggrannheten genom en ökning av antal rör från 3 till 12. Resultatet av dessa förändringar medförde att ett ökat antal mjölkproducenter fick kvalitetsavdrag vilket i sin tur ledde till misstankar om att det nya substratet var mindre selektivt. BBB innehåller laktat som kolkälla och eftersom Cl. tyrobutyricum kan förjäsa laktat, till skillnad från de flesta andra clostridiearter, skulle detta teoretiskt sett innebära att BBB kan vara något mer selektivt än föregångaren MRCM. Tyngdpunkten i detta arbete lades på att kartlägga vad som gett positiva utslag analyserade med ovannämnd MPN-metod, genom utodling och typning. Valet av typningsmetod grundades på vilka clostridier man kunde förväntas hitta i producentmjölk och möjligheten att typa dessa med vald metod. Denna möjlighet begränsades 11

12 av att Cl. tyrobutyricum, vilken var den art som förväntades att påträffas i störst andel, inte inkluderades i så många identifikationssystem. ELISA- metoden, omnämnt i introduktionen, var inte kommersiellt tillgänglig och kunde inte användas på grund av kostnadsskäl då antalet prov som skulle typas i detta arbete var för litet. När det gäller PCR-metoder, så finns protokoll beskrivna (10, 13-17). Men av tidsskäl valdes dessa bort. För identifiering av olika arter krävs dessutom antikroppar eller PCR-prober, men sådana finns inte tillgängliga utom för ett begränsat antal arter (10). Den valda typningsmetoden ger på så sätt en bredare uppfattning av artförekomsten. När det gäller ympningen av renkulturer i BBB-rör kunde man se att i princip alla tillgängliga stammar av clostridier gav positivt utslag i BBB-rören (tabell 4,5). Även de clostridier som räknas som laktatnegativa gav positivt utslag, detta förmodligen beroende på att de utnyttjat proteiner i BBB-substratet som kolkälla, istället för sockerarter. Liknande har rapporterats för (M)RCM (1, 12). I tabell 5 och 6 kunde man se att även en Bacillusart, Bacillus polymyxa hade förmågan ge ett positivt utslag, beroende på att de använder laktos och nitratkväve i sina metaboliska processer. Men undersökningar hos Steins Laboratorium AB tyder inte på att Bacillus polymyxa är vanligt förekommande i positiva rör (Flodin, opublicerat). Ändringen av odlingssubstrat inför typningen fick göras på grund av för litet kolonimaterial, samt för kort inkubationstid för utväxt av Cl. tyrobutyricum på rekommenderad blodagar. Rekommendationen var förmodligen byggd på ett urval av clostridier isolerade från medicinskt material och eftersom Cl. tyrobutyricum inte hör hemma där kan detta göra det besvärligt att använda rapid ID 32A på detta materialet utan en modifiering med efterföljande validering. Avläsning och tolkning av rapid ID 32 A underlättades av CCUG:s egen uppdelning av positiva och negativa utslag i en skala från ett till fem. Av typningsresultatet framgår att framgår att ca. 70 % av de utodlade proven innehöll Cl. tyrobutyricum, vilket korrelerar med tidigare studier, hela 95 % av proven innehöll någon clostridieart. Resultatet speglar floran som finns i ensilage (1) och fynden av Cl. tyrobutyricum låg på samma nivå som MRCM (12). Om man bortser från MPN-metodernas kända brister så fungerar Steins/Arlas metod bra för syftet att hitta laktatjäsande clostrider i producentmjölk. Det är inte någon nackdel att andra clostridier också detekteras eftersom åtminstone Cl. sporogenes och Cl. beijerinckii har visats kunna medverka i jäsning av Emmenthalerost (18). De avspeglar dessutom floran i ensilaget, vilket gör att mjölkanalysen ger en bredare signal om ensilagekvalitèn. Orsaken till det förhöjda antalet mjölkproducenter som fick högre högre antal positiva utslag med den nya metoden, berodde därför troligtvis inte på substratbytet, utan låg i skillnaden att man fick ökad precision vid övergången från 3 till 12 rör, och därmed påvisade fler clostridier. Önskvärt skulle vara att lite närmare studera olika clostridiearters förmåga att producera gas i BBB-substrat för att utröna skillnader som skulle kunna vara använbara i bedömningen som en ytterligare urskiljning. Det vore även önskvärt att testa en snabbare och billigare metod för massanvändning, som ett alternativ till MPN metoden. ELISA-metoden med antikroppar mot Cl. tyrobutyricum har potential att kunna öka specificiteten i analysen och anses vara relativt lättarbetad (19), men förbättrar inte MPN-metodernas precision. Ännu mera intressant skulle 12

13 det vara att utnyttja realtids-pcr för bestämning av Cl. tyrobutyricum (20), men då krävs också en enkel metod att koncentrera sporerna så att de kan detekteras i en liten volym. 5. Acknowledgements Tack till Anders Christiansson, Svensk Mjölk i Lund, som hjälpt mig att genomföra detta examensarbete. Även stort tack till Steins Laboratorium AB, Jönköping som finansierat material och framförallt ställt min arbetstid till förfogande för utbildning. 6. Referenser 1. Jonsson, A., Enumeration and confirmation of Clostridium tyrobutyricum in silages using neutral red, d-cycloserine and lactat dehydrogenase activity. Journal of Diary Science Vol. 73, No Bergère, J.L., Sivelä, S., Detection and enumeration of clostridial spores related to cheese quality classical and new methods. IDF bulletin Everitt, B., Christiansson, A., Projekt sporer i mjölk - omfattning orsak och betydelse för vidareförädlingen. SLU rapport nr Everitt, B., Kvalitetssäkrad Mjölkproduktion - sporer. Svensk Mjölk bulletin. 5. Magnusson, M., Christiansson, A., Svensson, B., Kolstrup C., Effect of different premilking manual teat.cleaning methods on bacterial spores in milk. Journal of Dairy Science 89: Bryant, M.P., Burkey, L.A., The characteristics of lactate-fermenting sporeforming anaerobes from silage. Journal of Bacteriology. 71: Christiansson, A., Ogura, H., Ekelund, K., Persson, M., von Below, M., Utveckling av ny, snabbare metodik för analys av klostridiesporer i leverantörmjölk. SMR rapport nr Kleter, W.L., Lammers, E.A.., The influence of ph and concentration of lactic acid and NaCl on the the growth of Clostridium tyrobutyricum in whey and cheese. 2. Experiments in cheese. Netherlands Milk and Dairy Journal 38: Lodi, R., Brasca, M., Detection and enumeration of Clostridia, of importance to cheese, with immunological methods. IDF bulletin Klijn, N., Nieuwenhof, F.F.J., Hoolwerf, J.D., Van Der Waals, C.B., Weerkamp, A.H., Identification of Clostridium tyrobutyricum as the causative agent of late blowing in cheese by species-species PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology 61:

14 11. Eisgruber, H., Eignung des Rapid ID 32 A-Testsystems zur schnellen Identifizierung. Archiv für Lebensmittelhygiene 43: Nieuwenhof, Ir.F.F.J., Hoolwerf, J.D., Comparison of three methods for the detection of spores of butyric acid bacteria in milk. Nizo-Nieuws nr Herman, L.M., De Block, J.H., Waes, G.M., A direct PCR detection method for Clostridium tyrobutyricum spores in up to 100 milliliters of raw milk. Applied and Environmental Microbiology 61: Le Bourhis, A.G., Saunier, K., Doré, J., Carlier, J.P., Chamba, J.F., Popoff, M.R., Tholozan, J.L., Development and validation of PCR primers to assess the diversity of Clostridium spp. in cheese by temporal temperature gradient gel electrophoresis. Applied and Environmental Microbiology 71: Cocolin, L., Innocente, N., Biasutti, M., Comi, G., The late blowing in cheese: a new molecular approach based on PCR and DGGE to study the microbial ecology of the alteration process. International Journal of Food Microbiology 90: Kojima, A., Uchida, I., Sezaki, T., Sasaki, Y., Ogikubo, Y., Tamura, Y., Rapid detection and identification of Clostridium chauvoei by PCR based on flagellin gene sequence. Veterinary Microbiology 78: Hein, I., Jorgensen, H.J., Loncarevic, S., Wagner, M., Quantification of Staphylococcus aureus in unpasteurised bovine and caprine milk by real-time PCR. Research in Microbiology 156: Le Bourhis, A.G., Doré, J., Carlier, J.P., Chamba, J.P., Popoff, M.R., Tholozan, J.L., Contribution of Clostridium beijerinckii and Clostridium sporogenes in association with Clostridium tyrobutyricum to the butyric fermentation in Emmental type cheese. International Journal of Food Microbiology 113: Kuchenbecker, R., Diehl, Y., Examination of the NIZO-Ede method regarding its value in detecting the presence of Clostridium tyrobutyricum by means of ELISA. Deutsche Milchwirtschaft 4a6 (19): López-Enríquez, L., Rodríguez-Lázaro, D., Hernández, M., Quantitative detection of Clostridium tyrobutyricum in milk by real-time PCR. Applied and Environmental Microbiology 73: