Metoder för påvisande av gramnegativa återkontaminationsbakterier vid produktion av k-mjölk

Transkript

1 Branschintern Rapport nr 7007-I Metoder för påvisande av gramnegativa återkontaminationsbakterier vid produktion av k-mjölk Anders Christiansson, Kerstin Ekelund, Hiroshi Ogura och Birgitta Svensson Svensk Mjölk Forskning Telefon E-post

2 Metoder för påvisande av gramnegativa återkontaminationsbakterier vid produktion av k-mjölk Anders Christiansson, Kerstin Ekelund, Hiroshi Ogura och Birgitta Svensson Sammanfattning I frånvaro av B. cereus är återkontamination med gramnegativa bakterier oftast begränsande för hållbarheten av pastöriserad mjölk och grädde. Det är därför önskvärt att snabbt kunna påvisa förekomst av dylika bakterier för att kunna kontrollera att processhygienen är tillfredsställande. Med förbättrad produktionshygien är det viktigt att metoder används som fångar så många gramnegativa bakteriegrupper som möjligt. Metoder för att analysera gramnegativa bakterier bygger på tillsats av olika substanser som hämmar grampositiva bakterier men tillåter tillväxt av gramnegativa. Enligt litteraturen är dessa metoder ej helt selektiva utan såväl falskpositiva som falsknegativa resultat kan erhållas för olika bakteriearter. Det är därför nödvändigt att validera metoden genom att testa såväl gramnegativa som grampositiva bakteriers tillväxt på det enskilda odlingsmediet. I denna undersökning har 184 gramnegativa och 62 grampositiva bakterier, representativa för den bakterieflora som är produktförstörande i k- mjölk, använts för att validera ett antal metoder för detektion av gramnegativa bakterier. Bakterierna var isolerade från mjölk i samband med mejerihygienundersökningar eller kom från Svensk Mjölks bakteriebank. Fem substrat avsedda för påvisande av gramnegativa bakterier genom ingjutning eller utstryk på agar har utvärderats. TGA+monensin, RPA (red plate agar) och VRBGA medgav tillväxt av nästan samtliga gramnegativa bakterier efter utstryk på platta och 1 dygns inkubering vid 30 C. Samtliga kolonier oavsett färg eller utseende räknades som växt utan hänsyn till substratets ursprungliga användningsområde. På CFC-Pseudomonas-agar hämmades cirka 10% av de testade gramnegativerna. På blåplatta enligt SIK hämmades också gramnegativer och detta substrat var mest svårläst. På de tre förstnämnda substraten tillväxte endast 1-3 Bacillusisolat bland 62 testade grampositiva stammar. CFC hämmade alla grampositiva medan 7 stammar växte på blåplatta. TGA+monensin, RPA (red plate agar) och VRBGA kan anses som likvärdiga för detektion av gramnegativa bakterier och kan användas efter preinkubering av mjölkpaket vid cirka 20 C. För korrekt resultat är det viktigt att stryka mjölken på ytan av agarn eftersom Pseudomonas växer alltför långsamt vid ingjutning. TTCB (mjölk, tetrazoliumklorid, benzalkoniumklorid) -metoden bygger på att grampositiva bakterier hämmas i mjölk med tillsats av benzalkoniumklorid. När gramnegativa bakterier tillväxer reducerar de tillsatt tetrazoliumklorid varvid en rosa eller röd färg bildas, vilket indikerar tillväxt. Bland de 184 gramnegativa bakterierna kunde 163 påvisas efter 1 dygn vid 30 C och de övriga, med 3 undantag, inom 48 timmar. 3 av 58 testade grampositiva bakterier gav rödfärgning inom ett dygn och ytterligare 5 inom 48 timmar. Fördelarna med metoden är att svar oftast kan erhållas inom 24 timmar och att ingen plattspridning är nödvändig, eftersom mjölken används som substrat. Metoden kan användas för att detektera så låga halter som 1 gramnegativ bakterie/ml inom 24 timmar. Färgutslaget ökade med tiden från rosa till kraftigt röd färg och med förlängd inkubationstid kunde ända ned till 3 bakterier/l påvisas i konsumtionsmjölk med hjälp av en MPN-metod. Vid undersökning av ett antal förpackningsmaskiner vid ett mejeri kunde en maskin visas kontaminera mjölken i halter mellan 11 och 400 gramnegativa bakterier/l mjölk, med motsvarande bakterietal vid framstämplingsdatum 2

3 överstigande 1 miljon/ml. Förutom för bestämning av låga halter kan metoden också användas kvalitativt för att påvisa närvaro eller frånvaro av gramnegativa bakterier i intakt mjölkförpackning efter tillsats av TTCB-indikator och preinkubering av vid 20 C i 24 timmar. Mjölk med tillsats av TTCB kan också användas för att påvisa gramnegativa bakterier genom svabbning. Svabben placeras efter användning i ett rör med 5 ml TTCB-mjölk och inkuberas vid 30 C i 24 timmar eller längre. Rosa eller röd färg indikerar att gramnegativa bakterier funnits på den svabbade ytan. Vid användning av metoden för svabbning av förpackningsmaskiner påvisades gramnegativa bakterier på bottenplattan av maskiner för takåsförpackningar även efter disk. Metoden medger att enkelt och billigt kunna testa många provtagningspunkter efter svabbning. De kemikalier som används är dock giftiga och metoden bör därför användas med försiktighet. 3

4 Bakgrund I frånvaro av B. cereus är återkontamination med gramnegativa bakterier oftast begränsande för hållbarheten av pastöriserad mjölk och grädde. Återkontaminationen sker nästan uteslutande i samband med förpackningen (1, 2). Eftersom gramnegativa bakterier inte överlever pastörisering är analys av gramnegativa bakterier ett enkelt sätt att påvisa återkontamination. Traditionellt har analys av koliforma bakterier eller Enterobacteriaceae använts som ett mått på detta. Den övervägande delen av återkontaminanterna tillhör dock inte dessa grupper utan utgörs av olika Pseudomonas-arter och andra gramnegativer (3, 4). När omfattningen av återkontaminationen minskar genom förbättrad hygien så minskar chansen att påträffa Enterobacteriacae (5). Det är därför av intresse att kunna detektera gruppen gramnegativa bakterier i sin helhet för att få en god bild av hygiensitutationen. Bland de gramnegativa bakterierna finns många arter, särskilt inom Pseudomonas, som växer snabbt i mjölk vid kylförvaring. Ett mjölkpaket som vid bäst före-dagen innehåller 1 miljon totalantal bakterier/ml mjölk domineras med stor säkerhet av gramnegativa bakterier, d.v.s återkontamination har skett. Analys av totalantalet bakterier vid bäst före-datum är ett alltför långsamt sätt kontrollera processhygienen. Därför försöker man få fram snabbare resultat genom att mera specifikt påvisa gramnegativa bakteriegrupper efter inkubering vid högre temperatur under kortare tid genom analys på selektiv agar. Nivån på återinfektionen är oftast så låg att det inte är möjligt att göra en direktanalys av produkterna, utan det krävs någon form av förinkubering. Exempel på sådana temperaturer är 17 C, 21 C, 25 C och 30 C. Ett problem som då uppstår är att även bakterier som inte är psykrotrofa kan växa ju mer temperaturen ökas, d.v.s. att analyssvaret inte entydigt ger besked om förekomsten av de psykrotrofa produktförstörande bakterierna. Å andra sidan erhålls ett snabbare svar vid högre förinkuberingstemperatur. Internationellt sätt har två olika principer för förinkubering använts: 1) Icke selektiv anrikning, d.v.s. inkubering av mjölkprovet enbart, och därefter utspädning och ingjutning i agarmedium selektivt för gramnegativa bakteriegrupper, t.ex. VRBGA eller TGA + benzalkoniumklorid (6), eller 2) selektiv anrikning i närvaro av substanser som hämmar tillväxt av grampositiva bakterier. Exempel på det senare är inkubering av mjölken med i närvaro av t.ex. kristallviolett, penicillin och nisin (7) vid 21 C i 25 tim eller inkubering vid 21 C i 18 tim med närvaro av benzalkoniumklorid i mjölken (8) och därefter plattspridning på selektivt eller oselektivt medium (9). Ambitionen med (7) var att också kunna relatera bakteriehalten i den förinkuberade mjölken med hållbarheten. De samband som erhålls blev dock ganska grova. Resultat erhålls med dessa metoder efter tidigast 2 dygn. En annan variant är att preinkubera mjölken med benzalkoniumklorid och kristallviolett i 24 tim vid 30 C och sedan påvisa bakterieförekomst genom ATP-analys (10). Det finns en mängd substanser som använts för att hämma grampositiva organismer och samtidigt medge växt av gramnegativa. De kan hänföras till färgämnen som kristallviolett och bromtymolblått, detergenter som benzalkoniumklorid och desoxycholate samt antibiotika eller antibiotikaliknande substanser som t.ex. penicillin, cetrimide, cephaloridin, nisin, monensin (6, 9). Genomgående för substanserna är att de har större eller mindre svagheter i form av begränsad selektivitet för olika bakterier (6, 7, 9, 10). Vissa bakteriegrupper bland de grampositiva hämmas mindre än andra. De inhibitorer för grampositiva bakterier som används kan även ha en viss effekt på gramnegativa bakterier, beroende på koncentrationen (9, 11), vilket gör att recepten oftast blir baserade på en kompromiss. I synnerhet i närvaro av mjölk fungerar ej alla system tillfredställande, även om de fungerar bättre i agarmedium (9). Det finns 4

5 endast få undersökningar där mera omfattande studier gjorts över vilka bakterier från mjölk som växer och inte växer på de olika medierna (6, 12). Flera studier har visat att det är viktigt att ta hänsyn till provets natur och de bakterier som finns där när nya substrat utvärderas eller används för nya provmatriser (12, 13) I Sverige används förinkubering av mjölk 1 dygn vid 17 C eller i rumstemperatur. Därefter görs utstryk eller plattspridning på VRBG eller RPA (en blandning av 50% TGA (PCA) och 50% VRA) (14). Svaret fås först ett dygn senare, efter inkubering av plattorna vid 30 C, varför analysen tar 2 dygn. RPA har aldrig noggrant validerats med avseende på växt av olika gramnegativa bakterier och frånvaro av växt av grampositiva. VRBG är selektivt för Enterobactericae, men det är känt att andra bakterier växer på plattorna, som eventuellt kan vara intressanta ur återkontaminationssynpunkt. Det finns därför en viss osäkerhet om båda metodernas tillförlitlighet för detektion av gramnegativa bakterier som grupp. Ett av syftena med denna undersökning har varit att jämföra och utvärdera olika agarsubstrats selektivitet för gramnegativa bakterier. I en australisk artikel har nyligen en snabb och enkel metod för påvisande av gramnegativa bakterier i mjölk beskrivits (5). TTCB-metoden bygger på att man sätter till benzalkoniumklorid (hämmar grampositiva bakterier) och tetrazoliumklorid (reduceras av bakterier till röd/rosa färg) till mjölkprovet. Provet inkuberas vid 30 C i 1 dygn. Om gramnegativa bakterier finns i provet så blir mjölken rosa/rödfärgad. Frånvaro av rosa färg visar att mjölken inte återinfekterats av gramnegativa bakterier. Denna metod har potentiella fördelar i form av snabbhet och enkelhet (1 dygns analystid och inget behov av plattspridning). Denna metod är inte heller validerad med avseende på vilka bakterier som växer och inte växer. Undersökningens andra syfte har varit att utvärdera TTCB-metoden och dessa potentiella användningsområden för hygienkontroll. För att ha ett bra bedömningsunderlag har ett stort antal bakterier som isolerats från mjölk eller grädde i samband med undersökningar i svenska och norska k- mjölksmejerier. Del 1. Selektivitet hos agarmedier för påvisande av gramnegativa bakterier Från tidigare undersökningar utnyttjades ett antal bakterieisolat som artbestämts och som är representativa för de bakterier som är produktförstörande i mjölkförpackningar (4). Dessutom testades bakterier som isolerats från förpackningsmaskinsomgivningen i ett mejerihygienprojekt (1, 2). Risken för falskpositiva resultat, d.v.s. om grampositiva bakterier kan ge utslag bedömdes också. Dessa bakterier kom dels från ovanstående undersökningar och dels från Svensk Mjölks bakteriebank. Bakteriestammar: I undersökningen användes 129 gramnegativa isolat från en tidigare undersökning där identiteten på de bakterier som dominerar i kylförvarad mjölk undersöktes, och som således är representativa för de grupper som begränsar hållbarheten. Isolaten kom från mjölk från 6 norska mejerier och 2 svenska mejerier, samt från leverantörmjölk (undersökning 1) (4). Bland bakterierna dominerade olika Pseudomonas-arter, men även Enterobacteriaceae, andra gramnegativa bakterier, samt Grampositiva bakterier ingick (se Tabell 1A). Flertalet av de gramnegativa bakterierna hade identifierats till artnivå eller lägre. Klusterbeteckningarna i Tabell 1A avser bakterier som identifierats till samma art eller underart. Kluster 1 är således Pseudomonas fluorescens biovar III och det fanns 15 isolat (från olika mjölkpaket). Bland de grampositiva organismerna fanns en stor del Bacillus, i synnerhet 5

6 B. cereus och B. polymyxa. Ytterligare 47 gramnegativa stammar, som kom från en undersökning av hygien i samband med förpackning av mjölk testades också (undersökning 2) (Tabell 1A, klusterbeteckning A1-A10) (15). Dessa hade identifierats som Pseudomonas fluorescens, Ps. corrugata, Ps. putida och Janthinobacterium lividum. Isolaten kom från två olika mejerier och hade isolerats vid två separata provtagningsdagar med minst ett halvt års mellanrum. Dessutom ingick 40 bakterieisolat från Svensk Mjölks bakteriebank, flertalet grampositiva bakterier med mejerirelevans (Tabell 1B). Efter litteraturgenomgång utvaldes 5 olika gramnegativselektiva substrat för utvärdering. Samtliga bakterier odlades upp på TGA eller annat lämpligt substrat. Därefter gjordes ytutstryk på de olika agarsubstraten. 1. Som positiv kontroll gjordes utstryk på TGA (Kemiklia) som avlästes efter 1, 2 och 3 dygns inkubering vid 30 C 2. RPA (rödagar, en blandning av 50% TGA och 50% VRA, Kemikalia), inkubering vid 30 C i 1 dygn (14). 3. TGA med tillsats av monensin (35 mg/l, Sigma M-2513) och KCl 7,5 g/l. Inkubering vid 30 C i 1 dygn. Denna metod visade sig mycket selektiv i originalpublikationen (12) och hade förmågan att påvisa även subletalt skadade bakterier. 4. VRBG (VRA med glukos i stället för laktos, Kemikalia), inkubering vid 26 C, avläsning efter 1, 2 och 3 dygn. Den metod som använts i mejerihygienundersökningarna med avläsning efter 3 dygn (15). 5. Pseudomonas-agar (Oxoid CN559, Pseudomonas agar base + CFC selektivt supplement SR 103; 3 olika antibiotika), inkubering vid 30 C i 1 dygn. Substratet är avsett för selektiv odling av Pseudomonas-arter, men det har i olika undersökningar visats även kunna medge växt av andra bakterier (9). 6. Blåplattor enligt SIK (köttextrakt 10 g, pepton (Oxoid) 10 g, NaCl 5 g, laktos 10 g, natriumtiosulfat 1 g, bromtymolblått (80 µg/ml), kristallviolett (5 µg/ml), agar 14 g och vatten 1000 ml, ph 7,0-7,5). Efter avslutad inkubering noterades tillväxt, samt även koloniutseende och färg. Dokumentation gjordes med digitalkamera. Resultat. Utvärderingen av de olika agarsubstraten framgår av Tabell 1 A och B. Skillnaden mellan de olika substraten var ganska liten. Nästan alla Pseudomonas och alla fakultativt anaeroba gramnegativer ( av 176 stammar) från undersökning 1 och 2 (Tabell 1A) växte på RPA, TGA+monensin and VRBGA. Med två undantag kunde VRBGA avläsas redan efter 1 dygn vid 26 C. Pseudomonas-agar var något mindre produktiv. 18 av 176 stammar växte inte. Bland dessa fanns 11 Pseudomonas-isolat och 7 fakultativt anaeroba gramnegativa bakterier. Däremot växte 13 andra fakultativt aeroba gramnegativer. Blåplattorna fungerade inte heller tillfredsställande. Bland de gramnegativa bakterierna från undersökning 1 och 2 växte inte 13 av 176 bakterier och ytterligare 5 gav endast svag växt. Blåplattorna var också svårast att avläsa. Ytterligare resultat med stammar från Svensk Mjölks bakteriebank visas i Tabell 1B. Tendensen bland gramnegativa bakterier var den samma. Chromobacterium växte dock inte på RPA, Pseudomonasagar eller VRBGA. 6

7 Tabell 1A. Tillväxt av olika mjölkrelaterade bakterier på agarsubstrat med selektivitet för gramnegativa bakterier. Namn Kluster antal TGA RPA TGA+M VRBGA 26 C 1d VRBGA 2d VRBGA 3 d CFC Pseud. SIK blåplatta Pseudomonas fluorescens biovar III Pseudomonas fluorescens biovar I (+3 svaga) Ps. fluorescens okänd biovar Ps. fluorescens okänd biovar Pseudomonas fragi biovar B Pseudomonas fragi Ps. sp nära Ps. fragi (+1 sv) Pseudomonas putida Pseudomonas lundensis Ps. sp nära Ps. lundensis Ps stutzeri Fakultativt aneroba gramnegativer (+1 svag) Pseudomonas fluorescens A Janthinobacterium lividum A Ps. fluorescens A Ps. fluorescens A Ps. corrugata A Ps. fluorescens A Ps. putida A Ps. fluorescens A Ps. fluorescens A Summa gramnegativa bakterier svag (+5 svaga) Bacillus spp (grampositiva) svag 2 svag 0 1 svag (+1 svag) Siffrorna avser antal isolat som växte på respektive substrat, se texten Fakultativt anaeroba gramnegativer: Hafnia alvei, Serratia liquefaciens, Pantoea agglomerans, Yersinia enterocolitica, Y. Intermedia, Y. Fredriksenii, Aeromonas hydrophila Det stora flertalet Bacillus-isolat från undersökning 1 växte inte på gramnegativsubstraten (Tabell 1A). Bland 35 Bacillus-isolat från undersökning 1 växte endast 3 isolat svagt på RPA, 2 stammar på TGA+M, och 1 stam svagt på VRBGA efter 2 dygn. Samtliga Bacillus hämmades på Pseudomonas-agar. På blåplattorna växte 6 stammar kraftigt och ytterligare en stam svagt. Tabell 1B visar att samtliga grampositiva bakterier från Svensk Mjölks bakteriesamling hämmades på RPA, TGA+M, VRBGA och Pseudomonasagar. Streptococcus faecalis växte på blåplatta och ytterligare 6 stammar växte när ympen var extra kraftig (markerat med (+) i tabellen. Några av mjölksyrabakterierna växte inte ens på TGA. Undersökningarna visar att RPA, TGA+M och VRBGA fungerar ungefär likvärdigt för detektion av gramnegativa bakterier, under förutsättning att alla kolonier oavsett utseende och färg räknas som växt. Det är inte ovanligt att alla kolonier räknas på VRBGA-plattor vid driftskontroll med VRBGA-plattor och denna undersökning bekräftar att detta ger ett kvalitativt riktigt svar med avseende på gruppen gramnegativa bakterier. Ytutstryk är nödvändigt av praktiska skäl men har även en fördel jämfört med ingjutning om man vill haltbestämma gramnegativerna: Kolonierna blir större och lättare att läsa efter 1 dygn vid 30 C jämfört med ingjutning. Pseudomonas CFC-agar anges som selektivt för Pseudomonas generellt (Oxoid Manual), men resultaten visar att många andra gramnegativa bakterier också kan växa. Dock visade sig CFC-agar hämma även en del Pseudomonas, tillsammans med vissa andra gramnegativa bakterier. Pseudomonas CFC-agar är därför mindre lämplig än de ovanstående om man syftar att fånga gramnegativa bakterier totalt sett. Blåplattorna visade sig vara det minst lämpliga substratet, med relativt många både falsknegativa och falskpositiva utslag. 7

8 Tabell 1B. Tillväxt av bakterier från Svensk Mjölks bakteriebank på olika agarsubstrat med selektivitet för gramnegativa bakterier Namn Banknr löpnr TGA RPA TGA+M VRBGA 26 C 1d VRBGA 2d VRBGA 3 d CFC Pseud. SIK blåplatta E. coli Citrobacter sp Aerobacter aerogenes Yersinia enterocolitica Alcaligenes viscosus Pseudomonas fragi Pseudomonas fluorescens Chromobacterium sp (+) Summa gramnegativa Lactococcus cremoris L.cremoris L.lactis L.lactis (+) L.diacetylactis L.diacetylactis (+) Leuc.cremoris Leuc.cremoris Str.durans (+) (+) Str. faecalis Lactobacillus.casei Lb.plantarum Bacillus.polymyxa B.cereus Mc.roseus Str.faecium (+) B.cereus B licheniformis B.circulans B.sphaericus B. polymyxa B.subtilis Jäst Listeria innocua Listeria monocytogenes Lb.casei,rhamnosus (+) Str.thermophilus Pediokocker Str.thermophilus (+) Lb.buchneri (+) Staph.aureus SLV Summa grampositiva 23 (2) (6 svag) Slutsatser: Genom utstryk på VRBGA-plattor kan tillväxt påvisas av samtliga av de gramnegativa bakterier som vanligen förekommer i pastöriserad mjölk. Utstryk kan göras med en ympögla direkt från t.ex. ett preinkuberat mjölkpaket på plattan. Alternativt kan 0,01 eller 0,1 ml mjölk spridas ut. Inget annat av de testade substraten var bättre, varför det inte finns någon anledning att byta till annat substrat inom mejeriindustrin, när VRBGA ändå finns tillgängligt. RPA är ett alternativ om så önskas. Både TGA+M och Pseudomonas-agar innehåller toxiska substanser och antibiotika och är därför mindre lämpade ur miljösynpunkt. Det är viktigt att testen görs genom ytutstryk eftersom många Pseudomonas endast har utvecklat pinpointkolonier vid ingjutning och avläsning efter 24 timmar. Vissa Bacillus-stammar kan i begränsad omfattning ge falskpositiv växt, men dessa kan enkelt påvisas genom att gramfärga eller KOH-testa misstänkta kolonier. 8

9 Del 2. Utvärdering av TTCB-metoden 1. Validering av TTCB-metoden Samma bakterieisolat ovan användes också för att kontrollera TTCB-metodens tillförlitlighet. Metoden bygger på att grampositiva bakterier hämmas i mjölken med hjälp av benzalkoniumklorid. När gramnegativa bakterier tillväxer reducerar de tetrazoliumkloriden varvid en rosa eller röd färg bildas, vilket indikerar tillväxt (5). Testbakterierna odlades vid 30 C i steril skummjölk i 24 timmar, eller i vissa fall i annat lämpligt substrat beroende på arten. Därefter ympades 0,0001% till rör innehållande 5 ml steril skummjölk. 50µl sterilfiltrerad bensalkoniumklorid (Sigma B1383) respektive 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (Sigma T- 8877) (från stamlösningar 5% vikt/vikt, sterilfiltrerade vattenlösningar) tillsattes, vilket ger en slutkoncentration på 0,05%. Båda substanserna är giftiga och bör hanteras enligt säkerhetsföreskrifter. Parallellt odlades en andra serie rör där endast tetrazoliumklorid tillsatts. Rören avlästes med avseende på färgomslag efter 24 timmar och därefter efter 2, 3 och ibland 4 dygn. Färgförändringarna följdes och graderades i styrka (0=ingen färgförändring, 1=svagt rosa, 2 ljust rosa, 3=rosa, 4= starkt rosa, 5=röd). Rör utan bakterietillsats inkuberades som kontroll för jämförelse med svaga färgutslag. Plattspridning gjordes för haltbestämning på ett urval av odlingarna. För de bakterier som inte växte p.g.a. lågt bakterietal gjordes upprepningar med ökad ymphalt. Resultat från utvärderingen av TTCB-metoden för gramnegativa bakterier från undersökning 1 redovisas i tabell 2. Av 131 gramnegativa stammar från undersökning 1 gav 55% tydligt positivt utslag efter odling i 1 dygn och ytterligare 35% gav svagt positiv färg, således gav 90% av isolaten utslag efter 1 dygn. Med undantag för två Pseudomonas stutzeri och en stam av Pseudmonas fluorescens biovar 1, som inte växte alls, gav alla tydligt positivt utslag inom 2 dygn. Det fanns vissa skillnader mellan de olika bakteriegrupperna vad gäller styrkan i färgutslag efter 1 dygn. Pseudomonas lundensis, Pseudomonas fluorescens biovar 1samt de fakultativt anaeroba bakterierna hade större tendens att ge tydligt positivt (rosa eller rött) utslag, medan Pseudomonas fluorescens biovar 3 och Pseudomonas fragi oftare gav svagt rosa utslag. Vid ympning till TTCB-rören späddes ympkulturerna till 10-6, med förväntan att antalet bakterier vid ympen skulle motsvara åtminstone några 10-tal till 100-tal/ml. Detta stämde ganska väl. De Pseudomonas-kulturer som haltbestämdes gav miljoner/ml och de fakultativt anaeroba gramnegativa bakterierna miljoner/ml. Syftet var att undersöka bakteriernas förmåga till tillväxt vid låga ymphalter, vilket är fallet vid återkontamination med gramnegativa bakterier. Rör med endast TTC studerades parallellt med TTCB-rör för att undersöka om benzalkoniumklorid hade negativ inverkan på tillväxten av stammarna. Vid jämförelse mellan utslag för TTC med och utan benzalkoniumklorid hämmades 15 stammar något av benzalkoniumkloriden (svagare utslag med än utan efter 1 dygn), men efter 2 dygn kvarstod inte denna skillnad (Tabell 2). För flera fakultativa anaerober stimulerades färgutvecklingen i närvaro av benzalkoniumklorid. Bland de gramnegativa stammarna från undersökning 2 växte samtliga i TTCB och gav tydligt utslag inom 1 dygn utom J. lividum som krävde 2 dygns inkubering (data ej redovisade). 9

10 Tabell 2: Tillväxt av olika återkontaminationsbakterier i mjölk med TTCB Färgutslag efter 1d Ingen tillväxt Hämning av benzalkonium- Grupp Beteckning + svagt + - inom 4 dygn klorid under dygn 1 1 P. fluorescens biovar P. fluorescens biovar a P. fluorescens biovar P. fluorescens okänd biovar P. fluorescens okänd biovar P. fragi biovar B (2 stimulans) 6 P. fragi P. sp närbesläktad fragi P. putida P. lundensis P. sp närbesläktad lundensis P. stuzeri Fakultativt anaeroba gramneg (6 stimulans) Antal gramnegativa (8 stimulans) % av gramnegativa 55,0 35,1 9,9 1,5 14,5% hämning/ 6% stimulans Antal Bacilllus (grampositiva) (2 dygns hämning) Bland 35 Bacillus-isolat från undersökning 1 gav två tydligt färgutslag efter 1 dygn och en gav svagt utslag. Övriga hämmades ända upp till 4 dygn. Några Bacillus hämmades t.o.m. av enbart TTC. Tabell 3. Tillväxt av olika bakterier från svensk Mjölks bakteriebank i mjölk med tillsats av TTC och benzalkoniumklorid eller enbart med TTC Artbeteckning SMR nr Pos med TTCB (tim) Positiv end. TTC (tim) Lactococcus cremoris L. cremoris L. lactis L. lactis L. diacetylactis L. diacetylactis Leuconostoc cremoris Leuconostoc cremoris Streptococcus durans Streptococcus faecalis Lactobacillus casei subsp rhamnosus L. casei Streptococcus thermophilus Streptococcus thermophilus L. buchnneri B. polymyxa B. cereus B. licheniformis B. circulans B. sphaericus >44 B. polymyxa >44 B. subtilis >44 Micrococcus roseus 498 >72 - Staphylococcus aureus SLV 350 >72 - Listeria innocua 1045 >72 - Pediococcus sp >72 - E. coli Citrobacter sp Aerobacter aerogenes Alcaligenes viscosus Pseudomonas fragi Ps. fluorescens Chromobacterium sp. 537 > ej testad Tabell 3 visar tillväxt av olika stammar från Svensk Mjölks bakteriebank. De grampositiva stammarna hämmades tydligt av benzalkoniumklorid (jämför resultat med och utan tillsats) 10

11 och flertalet gav ingen eller mycket svag färgutveckling förrän efter 68 timmar, vilket ger god marginal i förhållande till de gramnegativa bakterier som metoden ska identifiera. Av särskild vikt är att mjölksyrabakterier (Lactococus, Leuconostoc och Lactobacillus), enterokocker (Streptococcus faecalis och S. faecium) samt Bacillus-arter hämmas, eftersom de kan påträffas som återkontaminanter i k-mjölk. De grampositiva bakterier som gav utslag efter >44 timmar har inte identifierats som produktförstörande. De gramnegativa bakterierna betedde sig som förväntat, utom Chromobacterium sp. som inte växte alls. 2 Tillämpningsområden för TTCB-metoden Laboratorieundersökning Hur hög bakteriehalt krävs för att kunna påvisas inom 24 timmar? Här undersöktes hur olika gramnegativa bakterier reagerade i TTCB-substratet beroende av ympad halt. Pseudomonas fluorescens SMR531 odlades upp i steril skummjölk (30 C i 1 dygn). Plattspridning gjordes på TGA för att bestämma bakteriehalten. Spädvattenrören sparades. Vanlig standardmjölk fördelades i sterila 100 ml flaskor, 50 ml per flaska, varefter tillsattes 0,5 ml sterilfiltrerad kemikalieblandning till vardera flaskan. Från spädningsrören tillsattes bakterier till mjölken enligt följande: 0,1 ml från spädning -6 till flaska 1 1 ml från spädning -6 till flaska 2 1 ml från spädning -5 till flaska 3 1 ml från spädning -4 till flaska 4 Ingen bakterietillsats i flaska 5 (negativ kontroll) På så sätt erhölls en serie flaskor med olika ursprungshalt av bakterien. Flaskorna inkuberades vid 30 C. De inspekterades vid olika klockslag mellan 16 timmar till 48 timmar efter ympning och eventuell färgförändring noterades. Jämförelse gjordes med kontrollflaskan. Flaskorna skakades inte om vid avläsning. Färgförändringarna följdes och graderades i styrka På samma sätt testades ytterligare 6 Pseudomonas-stammar och 5 Enterobacteriaceaestammar som isolerats från mjölk i återkontaminerade mjölkförpackningar (15). Statistisk analys av resultaten gjordes med SYSTAT 9 för Windows. Resultat. För varje bakterie erhölls en serie med olika utgångshalter, som kunde vara olika för stammarna. I allmänhet erhölls högre halter för Enterobacteriaceae än för Pseudomonas. Figur 1 visar färgutslagen för samtliga stammar och ursprungshalter. Det fanns ett starkt samband mellan ursprunglig bakteriehalt i mjölken och färgutslaget vid 24 timmar efter inkubering vid 30 C. Det krävdes vanligen minst 1 bakterie per 10 ml mjölk (log =-1) för att erhålla färgutslag med värde 1 inom 24 timmar, men oftast cirka 1/ml. Pseudomonas VM3g gav inget utslag vid någon spädning ens efter 48 timmar, men bakteriehalten var här för låg, maximalt 2/ml i ympen. Övriga bakterier gav med få undantag utslag i testen vid 1/ml efter 24 timmar. I allmänhet var färgutvecklingen starkare för Enterobacteriaceae-stammar än för Pseudomonas, vid samma bakteriehalt (p<0,001vid envägs variansanalys mellan grupperna), se Figur 1. För Pseudomonas är det viktigt att jämföra med kontrollmjölken för att kunna avgöra 11

12 svaga färgutslag. Vissa Enterobacteriaceae-stammar kunde detekteras redan efter 16 timmar och gav styrka 3-4 i utslag efter 24 timmar. Figur 1 Färgutslag i TTCB-mjölk, beroende på ymphalt (logcfu/ml), för olika Enterobacteriacae- och Pseudomonas-stammar, efter 24 timmars odling vid 30 C. 6 5 Färgutslag Log cfu/ml GRUPP Ent Pseud Styrkan på färgen ökade med tiden (Figur 2, 3). Med undantag för Pseudomonas VM3g kunde samtliga stammar detekteras på kortare tid än 40 timmar och för några stammar i så låga halter som några 10-tal per liter mjölk. Våra resultat stämmer väl överens med australiska erfarenheter där man rapporterar att 1 gramnegativ bakterie/ml kan detekteras inom 24 timmar, 1 på 10 ml inom 30 timmar och 1 per liter inom 48 timmar (5). På grund av att olika bakteriestammar ger olika färgutslag vid samma bakteriehalt är det inte möjligt att använda färgutslaget som ett mått på den ursprungliga bakteriehalten, utom rent kvalitativt: Vid tidig och kraftig färgutveckling är halten hög. Figur 2. Färgutveckling som funktion av inkubationstid för en Pseudomonas- och en Enterobacteriacae-stam i TTCB-mjölk vid 30 C 5 Färgutslag Tid (tim) Pseud. F12g Ent. A2C 12

13 Figur 3 Exempel på färgutslag för mjölk med TTCB-metoden Anledningen till att lägre halter erhölls vid uppodling av vissa Pseudomonas-stammar kan vara att en del av de psykrotrofa Pseudomonas-stammarna har lägre temperaturoptimum än 30 C, varför de tillväxer långsammare än Enterobacteriaceae vid denna temperatur (16). Det tar då längre tid att nå upp till den halt som orsakar rosafärgningen (1-10 miljoner/ml). Detta är dock inte den enda förklaringen till skillnad i färgintensitet mellan grupperna. Enterobacteriaceae gav i allmänhet kraftigare färg än Pseudomonas vid samma bakteriehalt (Figur 1). Orsaken till detta är sannolikt att Pseudomonas är mera oxidativ än Enterobacteriaceae och deras metabolism ger inte upphov till lika kraftig reduktion (färgutslag) som Enterobacteriaceae. Men metoden är ändå tillräckligt känslig för att upptäcka Pseudomonas i halten 1/ml inom 24 timmar. Om behov av ökad känslighet finns kan inkuberingstiden utökas, men då förloras delvis snabbheten i metoden. Mejeriundersökningar 1. Bestämning av ursprungshalten av kontaminerande gramnegativa bakterier i mjölkförpackningar För haltbestämning av Gramnegativa bakterier uttogs förpackningar med nypastöriserad mjölk eller grädde från 5 olika förpackningsmaskiner från ett mejeri vid 4 olika tillfällen. Mjölken fördelades aseptiskt i två satser om 500 ml vardera. TTCB-indikatorer tillsattes till en slutkoncentration av 0,05% i den ena. Därefter fördelades denna mjölk i sterila flaskor och rör enligt följande: 3*100 ml, 3*50 ml, 3*10 ml och 3*1 ml. Delproven inkuberades vid 30 C och avlästes, utan omskakning, regelbundet vid olika tidpunkter mellan 16 till 48 timmar. Delprov med rosa eller röd färg noterades och den mest sannolika halten gramnegativa bakterier i ursprungspaketet avlästes med MPN-tabell. Den andra 500 ml-volymen inkuberades vid 8 C i 7 dygn, varefter plattspridning gjordes på TGA (totalantal bakterier), VRA (koliforma bakterier) och RPA (gramnegativa bakterier). Dessa resultat jämfördes med MPN-resultaten. Tabell 4 visar MPN-uppskattningarna av halten kontaminerande gramnegativa bakterier efter avläsning av rören vid 24 respektive 48 timmar. Maskin nr 5 uppvisade systematisk återkontamination vid alla provtagningsdagarna. Det fanns en tendens till ökande värden med 13

14 tiden, vilket också kunde ses för de mellanliggande avläsningarna (ej i tabell). Värdena var således inte alltid stabila efter 24 timmars avläsning. Halten återkontaminerande bakterier varierade mellan inga (<3/l) och 400/l, d.v.s. mindre än 1/ml i samtliga förpackningar. Jämförelse med analyserna vid bäst före-dagen visar en god överensstämmelse mellan förekomst av gramnegativa bakterier och höga bakterietal efter 7 dygn vid 8 C. Vid påvisande av gramnegativa bakterier, även i låga halter, påträffades också förhöjda halter av gramnegativa bakterier på VRA och RPA vid bäst före-dagen. Tabell 4 Ursprungshalten gramnegativa bakterier i mjölkförpackningar analyserat med MPNmetod baserad på TTCB (avläst efter 24 och 48 timmar), samt motsvarande bakteriehalt vid 7d/8 C Provdag Maskin nr Bakterier/l Bakterier/l Analys efter 8 /7dygn (cfu/ml) MPN 24 tim MPN 48 tim TGA VRA RPA 1 3 (startprov) <3 6 1,3E+07-9,80E ,80E+03-7,10E A <3 < < ,10E+06-7,20E <3 < < <3 < < <3 < < <3 < < ,10E+07-6,80E <3 <3 250 <10 < <3 <3 350 <10 < <3 <3 180 <10 < ,30E+07 1,80E+07 2,40E <3 <3 <1000 <10 < <3 <3 420 <10 < <3 <3 350 <10 < <3 <3 740 <10 < <3 11 4,10E <3 <3 440 <10 <10 Ökningen av MPN-halterna med tiden kan delvis bero på att halterna var lägre än 1/ml och att det då tar längre tid att nå tillräcklig halt för att ge färg (jämför sid. 11 ). En annan anledning till att MPN-bestämningarna inte var stabila efter 24 timmar kan vara att de bakterier som återkontaminerade förpackningarna sannolikt kan ha varit subletalt skadade p.g.a. att de t.ex. torkat ut i samband med luftspridning eller att de kom från ytor i maskinen som utsatts för rengörings- eller desinfektionsmedel. De kraftigaste återinfektionerna kunde dock med lätthet upptäckas redan efter 24 timmar. Ett undantag utgör startprovet från maskin 3 dag 1, där mycket höga halter påvisades vid bäst före-dagen men få (mycket låga antal) bakterier kunde påvisas med TTCB-metoden. En möjlig förklaring kan vara att startprovets bakterier var mera kraftigt skadade än de övriga. MPN-bestämning av ursprungshalten gramnegativa bakterier i förpackningar kan göras för att skapa en uppfattning om återkontaminationstrycket och kan användas som jämförelsevärden för att studera förändringar över tiden, som t.ex. ett resultat av gjorda åtgärder. Med ledning av data i Tabell 4 bör inte återkontaminationstrycket i nyförpackad mjölk överstiga 10 gramnegativa bakterier/l för att erhålla en god hållbarhet. Vid flera hundra/l är risken stor att antalet/ml vid framstämplingsdatum överstiger 1 miljon/ml. Det är enligt resultaten i Tabell 4 fullt möjligt att producera mjölk där inga gramnegativa bakterier kan påvisas i en liters-förpackning. 14

15 2. Kvalitativt påvisande av gramnegativ återkontamination direkt i förpackning TTCB-metoden kan även användas för att på ett enkelt och snabbt sätt kvalitativt påvisa förekomst av Gramnegativa bakterier i mjölkförpackningar. TTCB-lösning kan injiceras med spruta och kanyl genom ett silikongummiseptum som klistras på förpackningen och desinficeras med sprit före injektion. Hela förpackningen inkuberas sedan vi 30 C i 24 timmar, varefter den öppnas. Förekomst av rosa eller röd färg indikerar förekomst av återinfektion. Denna metod kan tyckas något komplicerad, men kan vara värdefull i situationer där ett stort antal prover behöver analyseras, t.ex. vid test av en ny förpackningsmaskin. En alternativ metod, och fullt tillräcklig med de återinfektionsnivåer som påträffades i undersökningen ovan, är att aseptiskt ta ut 100 ml produkt och inkubera i steril flaska med TTCBlösning. Fördelen med dessa metoder är att plattspridning inte är nödvändig utan visuell avläsning är tillräcklig. Resultatet erhålls redan efter 24 tim mot tidigast 48 tim om preinkubering och plattspridning görs. 3. Användning av TTCB-metoden för svabbning Laboratorieförsök: Hur känslig är svabbmetoden? Pseudomonas F12g och Enterobacteriacae-isolatet B1c odlades upp i TG-buljong på skak vid 30 C över natten. Plattspridning gjordes för att bestämma bakteriehalterna. Utspädning gjordes hela vägen från 1 till 9 för att få bakteriesuspensioner av olika täthet. Halterna bestämdes genom ingjutning i TGA. 0,25 ml av spädning 1 till 6 med tillsats av steril skummjölk spädd 1/500 spreds ut på diskade och desinficerade glasytor om 10*10 cm och fick torka i 60 minuter i rumstemperatur. Detta motsvarar då lätt nedsmutsning med olika många bakterier på ytan. Därefter svabbades ytorna noggrant med bomullssvabbar i 10 ml peptonvatten respektive 5 ml steril skummjölk som svabbvätska. 2-3 ytor svabbades för varje bakterie och bakterienedsmutsningsnivå. Rören med spädvätska som svabbmedium spreds omedelbart på TGA och inkuberades vid 30 C i 3 dygn. Till mjölksvabbproverna tillsattes TTCB-lösning och rören inkuberades vid 30 C och färgutslag avlästes mellan 16 och 48 timmar. Som ett komplement gjordes också övergjutning av glasytor med TSA (trypton soja agar) med 0,045% TTC (utan benzalkoniumklorid) enligt SIK (17). Dessa avlästes efter 24 tim vid 30 C och antalet röda kolonier noterades. Resultat: Ursprungligen sprayades bakteriesuspensionerna på ytorna med hjälp av en s.k. airbrush-spruta avsedd för sprutmålning av hobbymodeller (18). Efter denna behandling kunde inga bakterier påvisas vare sig med svabbning eller TTC-agaringjutning. Uppenbarligen hade spridningen med tryckluft i airbrush-sprutan en alltför uttorkande effekt på bakterierna. Sprutan har använts framgångsrikt för att applicera sporsuspensioner på ytor (18). Därför spreds bakterierna i fortsättningen ut på glaset med en steril triangel. Exempel på resultat visas i Tabell 5. Variationerna mellan olika försök var ganska stora. Det är dock tydligt att svabbning med spädvatten gav betydligt lägre resultat än förväntat. Detta kan bero på att många bakterier torkat ut och dött, eller blivit subletalt skadade på ytorna före analys. Det är dessutom troligt att inte alla bakterier lossgjordes vid svabbningen. Svabbning med mjölk/ttcb indikerade förekomst av gramnegativa bakterier vid ett lägre bakterietal än med spädvatten. Ingjutning med TSA-TTC var ytterligare något känsligare än TTCB-svabbning. Resultaten stämmer väl överens med andra undersökningar, där också endast en bråkdel av de applicerade bakterierna kan detekteras på ytor efter svabbning (19). Att svabbning med TTCB 15

16 och mjölk är känsligare än med spädvatten beror sannolikt på inkuberingen vid 30 C i mjölken, som ger fler skadade bakterier möjlighet att reparera sig. Det samma gäller för övergjutning med TSA-TTC. Tabell 5 Jämförelse mellan känsligheten för svabbning med buffert, TTCB-svabbning och ingjutning i TTC-agar. Halt/ml i spädvattenrör Förväntat antal bakterier på ytorna Antal efter svabbning Antal efter Pseudomonas F12g Spädvatten Mjölk TTCB TTC-ingjutning < <1 + < < <1 + Saknas Enterobacteriaceae B1c Förväntat antal bakterier på ytorna Spädvatten Mjölk TTCB TTC-ingjutning < < m m m Kontroll av ytor i förpackningsmaskiner Möjligheten att använda TTCB-metoden för hygienkontroll av förpackningsmaskiner undersöktes. Rör med 5 ml steril skummjölk med TTCB-indikator användes, samt sterila bomullssvabbar. På våta ytor användes svabbarna direkt, varefter de placerades i TTCB-mjölken för inkubering vid 30 C i 1-2 dygn. För torra ytor fuktades svabben i ett rör med sterilt vatten (ett för varje svabb). Ett antal punkter inne i en maskin för takåsförpackningar svabbades (se Tabell 6). Ett flertal försök gjordes och två representativa exempel visas i tabellen. Maskinen svabbades vid produktionsdagens slut, dels före och dels efter disk. Dessutom upprepades provtagningarna nästa morgon före produktionsstart vid det ena tillfället. Tabell 6 visar att ett flertal ställen i maskinen var kontaminerade med gramnegativa bakterier vid slutet av produktionsdagen: kondensplatta under formarmar, kondensplatta runt fyllrör, transportband och ett flertal ytor på bottenplattan. I andra försök kunde även formarmarna och andra punkter visas vara kontaminerade. De flesta punkterna utgjordes av icke direkt produktberörda ytor. Flertalet resultat kunde avläsas efter 1 dygn, men vissa först efter 2 dygn. I viss mån kan färgintensiteten och tiden för synlig färg utgöra ett mått på kontaminationsgraden (Figur 4). Färgintensiteten ökade i alla positiva prover med tiden jämför avläsning vid 24 och 48 timmar) Intressant nog påträffades fler punkter med gramnegativa bakterier efter disk än före! Detta beror sannolikt på att bakterier sprids i aerosoler vid disken och sedan landar på de diskade ytorna. Vid mätning morgonen därpå kunde dock inga påvisas med undantag för bottenplattan. Orsaken till detta är troligen att bakterierna dör av uttorkning under natten. Bottenplattan blir dock aldrig helt torr, varför denna redan vid uppstart utgör en kontaminationsrisk t.ex. i samband med spolning (20). Resultaten bekräftar de slutsatser som dragits i tidigare undersökningar angående bottenplattan som kontaminationskälla för k-mjölk vid förpackning. Eftersom bottenplattan aldrig blir helt ren utgör den alltid en kontaminationskälla vid spolning av maskinen, då aerosoler med gramnegativa bakterier sprids. 16

17 Figur 4 Resultat av svabbning i förpackningsmaskin Särskilt anmärkningsvärt var att gramnegativa bakterier kunde påvisas på en uttorkad yta av bottenplattan på en maskin, som på grund av transport från annat mejeri varit ur drift i mer än 14 dagar! Detta antyder att de växer i biofilmer som skyddar dem mot uttorkning och som gör att mycket kraftig mekanisk bearbetning samt rengöringsmedel med oxiderande substanser som hypoklorit krävs för att bli av med dem (21). Tabell 6. Svabbförsök i förpackningsmaskiner med TTCB-mjölk som indikator Maskin A Maskin B Svabbning före disk Svabbning efter disk Svabbning före disk Svabbning efter disk Svabbning följande morgon före start Svabbad yta Avl. 24 tim Avl. 48 tim Avl. 24 tim Avl. 48 tim Avl. 24 tim Avl. 48 tim Avl. 24 tim Avl. 48 tim Avl. 24 tim Avl. 48 tim Fyllmunstycke vid skarv - sv. + sv Fyllmunstycke vid skarv - - sv Fyllmunstycke vid skarv - - sv Formarmar sv Kondensplatta Bottenplatta sv Förvikare - - sv Slutvikare - - sv Kondensplatta sv sv. + Kondensplatta + ++ sv Hållare till transportband Yta 1dm 2 på bottenplatta Yta 1dm 2 på bottenplatta Yta 1dm 2 på bottenplatta sv sv. + Yta 1dm 2 på bottenplatta sv Ränna vid bottenplatta TTCB-metoden lämpar sig väl för svabbning, där svabben placeras i mjölk med TTCB. Metoden är enkel och medger ett stort antal svabbtester till låg kostnad vid hygienundersökningar. Den är känsligare än ATP-metoden och påvisar endast levande bakterier. En nackdel med TTC och benzalkoniumklorid är dock att kemikalierna är giftiga och svårnedbrytbara i naturen. 17

18 Slutsatser VRBGA fungerar alldeles utmärkt för detektion av samtliga gramnegativa bakteriegrupper som är vanligt förekommande i konsumtionsmjölk. Efter preinkubering vid 20 C/24 timmar stryks 0,1-0,01 mjölk direkt från förpackningen på ytan av VRBGA. Inkubering vid 30 C medger analyssvar inom 48 timmar. TTCB-metoden visade sig vara robust och medgav växt av praktiskt taget alla bakterier inom gramnegativgruppen. Fördelen med metoden är att mjölken preinkuberas vid 30 C i 24 timmar, varefter förekomst av gramnegativa bakterier kan påvisas genom att mjölken färgats rosa eller röd. Svar erhålls 1 dygn snabbare än vid preinkubering och plattspridning på VRGBA. Metoden kan också användas för att haltbestämma återkontaminationsbakterierna samt som ett indikatormedel föra att påvisa gramnegativa bakterier efter svabbning. Giftigheten hos TTCB-kemikalierna gör dock att TTCB-metoden bör användas med urskiljning och då i synnerhet när det finns behov att snabbt få svar från många prover. Referenser 1. Eneroth, Å., Ahrné, S. & Molin, G Contamination routes of Gramnegative spoilage bacteria in the production of pasteurised milk, evaluated by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). International Dairy Journal 10: Eneroth, Å., Ahrné, S. & Molin, G Contamination of milk with Gramnegative spoilage bacteria during filling of retail containers. International Journal of Food Microbiology 57: Craven, H.M. & Macauley, B.J Microorganisms in pasteurised mik after refrigerated storage 1. Identification of types. The Australian Journal of Dairy Technology 47: Ternström, A., Lindberg, A.-M. & Molin, G Classification of the spoilage flora of raw and pasteurized bovine milk, with special reference to Pseudomonas and Bacillus. Journal of Applied Bacteriology 75: Craven, H.M., Forsyth, S.R., Drew, P.G. & Macauley, B.J A new technique for early detection of Gram-negative bacteria in milk. The Australian Journal of Dairy Technology 49: Langeveld, L.P.M., Cuperus, F., Van Breemen, P. & Dijkers, J A rapid method for the detection of post-pasteurization contamination in HTST pasteurized milk. Netherlands Milk & Dairy Journal 30: Phillips, J.D., Griffiths, M.W. & Muir, D.D Preincubation test to rapidly identify post-pasteurisation contamination in milk and single cream. Journal of Food Protection 47: Byrne, R.D., Bishop, J.R. & McGilliard, M.L Selective preliminary incubation for gram-negative psychrotrophic bacteria in milk. Journal of Food Protection 52(6): Phillips, J.D. & Griffiths, M.W Estimation of Gram-negative bacteria in milk: A comparison of inhibitor systems for preventing Gram-positive bacterial growth. Journal of Applied Bacteriology 60:

19 10. Waes, G.M. & Bossuyt, R.G Usefulness of the benzalkon-crystal violet- ATP method for predicting the keeping quality of pasteurized milk. Journal of Food Protection 45(10): Svensson, U., Bergwik, B.-M., M., C., Sjögren, B. & Sved, L Gramnegativ bakterier som hygienindikator vid mjölkpulverframställning. SMR Forskning och Utveckling Petzel, J.P. & Hartman, P.A Monensin-based medium for determination of total gram-negative bacteria and Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 13. Tryfinopoulu, P., Drosinos, E.H. & Nychas, G.J Performance of Pseudomonas CFC-selective medium in the fish storage ecosystems. Journal of Microbiological Methods 47: Fondén, R. & Fitger, U Hur bestämma återinfektion av mjölk och grädde. Nordisk Mejeriindustri (10): Eneroth, Å., Bacteriological hygiene in the production of pasteurised milk, in Avd för Livsmedelshygien. 1999, Doktorsavhandling, Lunds Tekniska Högskola: Lund. 16. Langeveld, L.P.M. & Cuperus, F The relation between temperature and growth rate in pasteurized milk of different types of bacteria which are important to the deterioration of that milk. Netherlands Milk & Dairy Journal 34: Husmark, U., Faille, C., Rönner, U. & Benezech, T Bacillus spores and moulding with TTC agar: a useful method for the assessment of food processing equipment cleanability. Biofouling 14(1): Christiansson, A., Ogura, H., Ahlqvist, B. & Nielsen, L Utvärdering av ozon som möjligt disk- och desinfektionsmedel för mjölkningansläggningar. Svensk Mjölk Forskning. Rapport Bredholt, S., Maukonen, J., Kujanpää, K., Alanko, T., Olofson, U., Husmark, U., Sjöberg, A.M. & Wirtanen, G Microbial methods for assessment of cleaning and disinfection of food-processing surfaces in a low-pressure system. European Journal of Food Research and Technology 209: Eneroth, Å. & Svensson, B Rengöringsrutiner för förpackningsmaskiner. Svensk Mjölk Forskning. Rapport Carpentier, B. & Cerf, O Biofilms and their consequences, with particular reference to hygiene in the food industry. Journal of Applied Bacteriology 75: