Upprättare: Thomas K Claesson Granskare: Annelie Strömbäck Fastställare: Lars Hansson

Transkript

1 Upprättat datum: (40) Division Diagnostik Revisionsnr: 8 Giltigt t.o.m.: Laboratoriemedicin Metodansvarig: Thomas K Claesson Medicinskt ansvarig: Lars O Hansson Upprättare: Thomas K Claesson Granskare: Annelie Strömbäck Fastställare: Lars Hansson CDT, disialo; HPLC Innehållsförteckning Analyskod i labdatasystemet NPU-kod Referenser Medicinsk bakgrund Mätprincip Instrument och tillbehör Beställningsinformation Reagens Beställningsinformation Reagens Kvantitets och beredningsbeskrivning Gradientbuffert A; Bis Tris 10 mmol/l, ph 6,20 Gradientbuffert B; Bis Tris 10 mmol/l, natriumklorid 0,5 mol/l, 2 % metanol (v/v), ph 6,20 Gradientbuffert C; Natriumklorid 2,0 mol/l Tvättlösning Natriumazid 0,02 % Nitrilotriacetic trisodium salt monohydrate10 mmol/l, järn(iii)klorid 10 mmol/l, ph 6,5 (FeNTA) Dextransulfatlösning 2 % (w/v) Magnesiumklorid 1 mol/l Natriumklorid 1 mol/l Natriumhydroxid 1 mol/l Saltsyra 1 mol/l Salpetersyra 2 % (w/v) Pepsinlösning 0,1 g/l Nåltvättlösning; Isopropanol (2-propanol) 20 % Sealwash solution; Metanol 20 % Provtagning Kalibrering

2 2(40) Kontroller Intern kontroll Extern kontroll: Equalis Utförande Integrering Provberedning Järnmättning och lipoproteinfällning av serum Vattenspädning Kontrollberedning Efter analys Empower-mjukvaruprogram Inloggning Jämviktning av kolonn Analysering av prov Lägga till ett prov i provsekvensen under pågående analysering Avbryta en provsekvens Process-omintegrering och bearbetning av kromatogram för enstaka prov Utskrift med förhandsgranskning Utskrift utan förhandsgranskning Inställning av gemensamma integreringsparametrar Inställning av analys område (Show Events) Ställa in toppidentiteten (Show Components) Spara inställningar För att skriva och processa om resultat från hela provlistan Gränser för retentionstider Underhåll Systemtvätt Kolonntvätt Förkolon Kolonn Kolonnidentitet Ny kolonn Svarsrutiner Referensintervall

3 3(40) Verifiering Imprecision Riktighet Mätområde Angiven mätosäkerhet Interferens och felkällor Revideringar

4 4(40) Analyskod i labdatasystemet CDT NPU-kod NPU19601 Referenser Waters 2695 Separations Module Operator s Guide Waters 2695 Separations Module Quick Start Guide 2695 Separations Module Degasser Reference Sheet Waters 2487 Dual Absorbance Detector Operator s Guide Laurells Klinisk kemi i praktisk medicin. Åttonde upplagan, Lund: Studentlitteratur, S-CDT ( Carbohydrate Deficient Transferrin). Metodbeskrivning KK Farmakologi. Version 4. Laboratoriemedicin Värmland. Information inför harmonisering av CDT-analysen , Uppsala 21 maj EQUALIS. HPLC-metoder, SWEDAC DOC 03:01, datum , ISSN Medicinsk bakgrund Transferrin är ett glykoprotein som utifrån antalet kolhydratkedjor kan separeras i olika isomerer. Kolhydratfattigt transferrin (CDT) är den mest specifika markören för hög alkoholkonsumtion. Normalt finns det låga nivåer kolhydratfattigt transferrin med endast två sialinsyror, d.v.s. disialotransferrin. Vid högt och kroniskt alkoholintag ökar halten av denna form. Från låga nivåer av totala transferrininnehållet kan andelen stiga till ca. 20 %. Ett stort antal studier har visat att mer än 90 % av de patienter som har förhöjda värden är alkoholmissbrukare. CDT koncentrationen stiger först efter ett par veckors tungt missbruk. Som tumregel gäller intag av 60 g alkohol/dygn (motsvarar en flaska vin/dygn) under några veckor leder till att 50 % av en population får förhöjda värden. Först vid nivåer över 100 g/dygn uppnås sensitivitetssiffror på över 90 %. Vid abstinens halveras CDT på 1-2 veckor. CDT-analysen används i olika rättsliga sammanhang, exempelvis i körkortsärenden, vid drogtestning i samband med nyanställningar och i vårdnadsärenden. Mätprincip Provet (transferrinet) järnmättas och lipoproteiner fälls ut med dextransulfat och magnesiumklorid. Kvantifieringen av CDT utförs med HPLC-teknik, där transferrinisomererna separeras på en stark anjonbytare med en saltgradient vid optimalt phvärde. Absorbansen mäts vid 460 nm.

5 5(40) Instrument och tillbehör Se Instrumentbeskrivning för Waters Alliance HPLC SYSTEM Beställningsinformation Tillbehör Artikelns Fabrikat Leverantör Kolonn: Source 15 Q 4.6/100 PE GE Healthcare VWR In-Line Filter Kit: Filter, PEEK, In-Line, 25.JR VICI AG Scantec Ti frit PEEK-encased 2µm International In-Line Filter: Frit, Ti, PEEK-encased 25.JR VICI AG 2µm, 5/paket 2P-5 International Hydrphylic Polypropylen Membran PALL VWR Filters 47mm 0,2µm 100/PK Centrifugrör, mikro, 1,5 ml, vidhängande lock Brand VWR Polypropylen-Short Thread-Vial 1,5 ml, La-Pha-Pack Genetec transparent 100/paket PP-Screw Cap, Natural rubber/tef La-Pha-Pack transparent, 100/paket 780 ph meter Metrohm Metrohm Ultraljudsbad Bandelin Sonorex Buch&Holm Likvärdiga tillbehör kan användas

6 6(40) Reagens Beställningsinformation Reagens Artikelnr Fabrikat Leverantör Bis-Tris, BioChemica, 99 % G-F Fluka Sigma-Aldrich Nitrilotriacetic acid Trisodium salt G Aldrich Monohydrate, 98,0 % Iron (III) Chloride Hexahydrate, G Aldrich Sigma-Aldrich 99 % Saltsyra, p.a., 37 % Merck VWR Salpetersyra, p.a., 65 % Magnesiumklorid-6-hydrat, p.a.> 99 % Natriumklorid 500g V BDH Natriumhydroxid, pastiller, p.a. > 99 % Dextransulfat, natriumsalt D G Aldrich Sigma-Aldrich Natriumazid BDH VWR Pepsin, 97 % L Ättiksyra, p.a.,> 98,8 % Merck Metanol, för kromatografi, > 99,7 % Isopropanol (2-propanol), för GC, > 99, % %CDT by HPLC, Control Set Bio-Rad Bio-Rad Kvantitets och beredningsbeskrivning Gradientbuffert A; Bis Tris 10 mmol/l, ph 6,20 Se Protokoll för reagens Gradientbuffert B; Bis Tris 10 mmol/l, natriumklorid 0,5 mol/l, 2 % metanol (v/v), ph 6,20 Se Protokoll för reagens Gradientbuffert C; Natriumklorid 2,0 mol/l Se Protokoll för reagens Tvättlösning Natriumazid 0,02 % Se Protokoll för reagens Nitrilotriacetic trisodium salt monohydrate10 mmol/l, järn(iii)klorid 10 mmol/l, Se Protokoll för reagens

7 7(40) ph 6,5 (FeNTA) Se Protokoll för reagens Dextransulfatlösning 2 % (w/v) Se Protokoll för reagens Magnesiumklorid 1 mol/l Se Protokoll för reagens Natriumklorid 1 mol/l Se Protokoll för reagens Natriumhydroxid 1 mol/l Se Protokoll för reagens Saltsyra 1 mol/l Se Protokoll för reagens Salpetersyra 2 % (w/v) Se Protokoll för reagens Pepsinlösning 0,1 g/l Se Protokoll för reagens Nåltvättlösning; Isopropanol (2-propanol) 20 % Se Protokoll för reagens Sealwash solution; Metanol 20 % Se Protokoll för reagens

8 8(40) Provtagning 5 ml venblod från SST-rör, gul propp eller rör utan tillsats, röd propp Provet centrifugeras vid 1800 g under 10 minuter Minsta provvolym för analys är 0,5 ml serum Hållbarhet serum: kyl 7 dygn frys 6 månader Kalibrering Analysmetoden kalibreras ej CDT, disialo-koncentrationen kvantifieras genom normalisering, dvs bestämning av varje aktuell transferrinkomponents procentuella del beräknas av den totala transferrinarean Kontroller Intern kontroll Analysera nivå 1 och 2 före provet/proverna samt efter provet/proverna Materialkod CDL1 Lidnr CDTL1 1W1,1W2 CDL2 Lidnr CDTL2 1W1,1W2 Extern kontroll: Equalis Lid-nummer Beställare Personnr Analyskoder Registrera ett Lid-nummer från intern lidnummerserie 1Kontrol Skriv Equalis som födelsenummer och namn Beställ de analyser som skall analyseras Åtgärder när kontrollvärdets larmgränser under/överskrids, se Hantering av kontroller Utförande Integrering I Sverige skedde en nationell harmonisering för bestämning av CDT med HPLCteknik, som Equalis samordnade, där man bl.a. enades om en gemensam övre gräns (1,9 %) och integreringsförfarande Baslinjeintegrering utförs mellan disialo- och penta- /hexasialotransferrin enligt följande kromatogram:

9 9(40) Gradientinställningar Time Flow %A %B %C %D Curve

10 10(40) Provberedning Järnmättning och lipoproteinfällning av serum Tillsätt 100 L FeNTA Pipettera 500 L serumprov i 1,5 ml mikrocentrifugrör Tillsätt 33 L magnesiumklorid 1 mol/l och 33 L dextransulfat 2 % Magnesiumklorid och dextransulfat kan blandas i lämplig volym innan tillsats Tillsätt då 66 L av blandningen till varje prov Blanda rören noga på provrörsskak Låt stå minst 1 timme i kyl Vattenspädning Centrifugera proverna vid 8550 g under 10 minuter Pipettera 200 L av supernatanten i 1,5 ml vialer Tillsätt 800 L avjoniserat H 2 O Blanda rören noga på provrörsskak Låt stå minuter kyl Centrifugera provvialerna vid 2160 g under 10 minuter Injicera 150 L, se INSTRUMENTBESKRIVNING Waters Alliance HPLC SYSTEM & 2487 Dual Wavelength Absorbance Detector Hållbarhet vattenspädning kyl 2 dygn järnmättning och lipoproteinfällning kyl 1 vecka Kontrollberedning Låt kontrollerna, nivå 1 och 2, stå i rumstemperatur under 30 minuter Se till så att det inte finns något frystorkat material på respektive kontrollflaska genom att knacka botten av flaskorna mot exempelvis arbetsbänken Ta försiktigt av korkarna Tillsätt 1 ml avjoniserat H 2 O i vardera flaskan Snurra respektive flaska i handflatan några gånger Låt flaskorna stå mörkt i minst 10 minuter Skaka försiktigt då och då Blanda därefter kontrollösningarna genom att vända flaskorna upp och ned tills att homogena lösningar erhålls Pipettera 1000 L av kontrollen i 1,5 ml mikrocentrifugrör Tillsätt 200 L FeNTA lösning L magnesiumklorid 1 mol/l och dextransulfat 2 % blandning. Låt stå 1 timme i kyl Centrifugera proverna vid 8550 g under 10 minuter Gör vattenspädningar 1 flaska räcker till 5st kontroller låt stå minst en halv timme Centrifugera proverna vid 8550 g under 10 minuter

11 11(40) För över till vialer, frys kontrollerna Hållbarhet uppspädd i kyl uppspädd i frys 2 dygn 2 månader Märk med dagens datum och signatur Efter analys Efter avslutad körning stoppar man slang A,B,C i avjoniserat vatten gör en wet prime på 3 minuter med flöde 7,5 ml/min på varje kanal därefter ändra D kanalen (NatriumAzid lösning) till 100% och wet prima i 3 minuter seden köra med flöde 1,0 ml/min i ca 5-10 minuter. Kassera vialerna och stänga av instrumentet. Ett automatiskt program för detta finns under menyn Develop Methods på instrumentet. Markera CLEAN och tryck på Run och därefter Routine.

12 12(40) Empower-mjukvaruprogram Inloggning Starta datorn och Empower Om datorn är avslagen används användarnamn admin och lösenord Waters för åtkomst till mjukvara. Inloggning utförs med aktuella användarnamn (User Name) och lösenord (Password) enligt följande bild: OK nedanstående fönster syns: CDT-Inhouse (Jeppson 2012)_W1 för Instument 1 (1W1) och Water 1 CDT-Inhouse (Jeppson 2012)_W2 för Instument 2 (1W2) och Water 2 OK

13 13(40) QuickStart påbörjas: QuickStart-fönstret har följande utseende:

14 14(40) Jämviktning av kolonn Utföres precis före analysering öppnar fönstret Equilibrate/System Monitor CDT_separation Equilibrate/Monitor Låt systemet jämvikta under ca 15 minuter tills att baslinjen är stabil

15 15(40) Analysering av prov File New Sample Set Using Template

16 16(40) Provlista CDT_Water 1,2

17 17(40) Open Skriv in antal prover (ej kontroller) som ska analyseras i fältet Number of sample vials och från vilken vialposition som provsekvensen ska starta ifrån Positioner för slask och kontroller är förvalda, se bild nedan. Finish följande fönster syns: Registrera Lidnummer på rätt Vial position

18 18(40) öppnar fönstret Run Sample Set Namnge aktuell provsekvens enligt följande: Ex _672_W2 Förklaring _672 _W2 År månad dag löpnummer från Instrument 2 (1W2) Run and Report Continue on Fault i fältet Run Mode i fältet Suitability Mode Instrument shutdown method i fältet Shutdown Method Det innebär att efter avslutad CDT-metod aktiveras Instrument shutdown method, dvs en automatisk kolonntvätt utförs samt att pumpen och detektorlampan stängs av Run startar provsekvensen

19 19(40) Lägga till ett prov i provsekvensen under pågående analysering Högerklicka med musen på provlistan på skärmen Alter Running Samples gör det möjligt att göra ändringar i provlistan OK Högerklicka med musen på provlistan på skärmen Insert Row kopierar prov ovanför den rad som markeras Lägg till prov-id och vial nummer på det prov som skall läggas till

20 20(40) Add Row en rad läggs till på slutet Fönstret Run Sample Set syns på skärmen: startar om provsekvensen Run and Report Continue on Fault Instrument shutdown method i fältet Run Mode i fältet Suitability Mode i fältet Shutdown Method

21 21(40) Det innebär att efter avslutad CDT-metod aktiveras Instrument shutdown method, dvs en automatisk kolonntvätt utförs samt att pump och detektorlampa stängs av Run startar provsekvensen Avbryta en provsekvens avbryter en provsekvens följande fönster syns: Abort Now! avbryter omedelbart analysering Det betyder att kolonnen måste jämviktas före start av nästa provsekvens Abort after Vial is completed Abort after Injection is completed avbryter efter att samtliga injektioner på samma vialposition har avslutats avbryter efter pågående injektion Abort run and continue on next line skall ej användas

22 22(40) Process-omintegrering och bearbetning av kromatogram för enstaka prov View Browse Project Välj fliken Injections Markera raden på det du vill granska och högerklicka välj Review

23 23(40) Yes För att zooma in ett kromatogram håll nere vänster mus tangent och markera området du vill förstora

24 24(40) För att komma tillbaka höger klicka på musen FullView Dra om baslinjen med hjälp av baslinjemarkeringarna (trianglar) Markera triangeln med muspekaren och håll nere vänster musknapp Flytta trianglarna tills en optimal integrering uppnåtts Även dropp linje (Romber) kan ändras on den inte är centrerade mellan topparna alternativt Quantitate för att namnge topparna igen

25 25(40) File Save Result för att spara omintegrering Browse Project till vänster i marginalen Results Update visar det omintegrerade resultatet Utskrift med förhandsgranskning Markera vilket resultat du vill ha en utskift på Tools

26 26(40) Preview Yes Välj Report Method CDT_1 (Instrument 1), eller CDT_2 (Instrument 2) OK

27 27(40) En förhandsgranskning av kromatogrammet kommer upp utskrift skrivs ut Utskrift utan förhandsgranskning Markera vilket kromatogram du vill ha utskrivet

28 28(40) Tools Print OK OBS! Process ska ej vara i bockat endast Print.

29 29(40) Inställning av gemensamma integreringsparametrar Förvälj det prov du vill integrera om se avsnittet Process-omintegrering och bearbetning av kromatogram för enstaka prov. Inställningarna påverkar alla prover och utskrifter som görs efter inställningen Inställning av analys område (Show Events) Området före och efter räknas inte in i den totala ytan Välj Options Show Events eller För muspekaren till den linjen som markerar området före och efter analysområdet muspekaren ändras till en hand håll nere vänster musknapp och dra och släpp till önskat plats.

30 30(40) Ställa in toppidentiteten (Show Components) Ställer in identiteten på topparna så komponenterna kommer på rätt plats Välj Options Show Components eller

31 31(40) För muspekaren så den ändras till en hand över den komponent du vill ställa in. Håll nere vänster musknapp och dra och släpp i centrum av toppen fortsätt tills alla komponenter är rätt inställda. Spara inställningar Det går inte att spara inställningarna en felaktighet i programvaran om man inte drar om kromatogrammet enligt avsnittet Process-omintegrering och bearbetning av kromatogram för enstaka prov Räcket att man flyttar en integrerings markör lite Sedan kan man välja File Save All

32 32(40)

33 33(40) För att skriva och processa om resultat från hela provlistan Om analys område och toppidentiteten var felaktiga vid körningen och man måste ändra dessa kan man skriva ut hela Prov setet (Sample Sets) Alternativt View Browse Project Browse Project till vänster i marginalen Result Sets Välj den provlista som skall skrivas ut genom att markera raden. Om den inte kommer upp

34 34(40) Update Tools Process Välj följande inställningar

35 35(40)

36 36(40) Gränser för retentionstider Åsatta gränsvärden för retentionstider i Empower: ±15 % När åsatta värden överskrids kan ej mjukvaran identifiera eller kvantifiera CDT-varianterna Åtgärder utföres av process- eller metodansvarig

37 37(40) Underhåll Underhåll dokumenteras i loggbok eller i aktuella underhållsprotokoll. Pumpen får ej lämnas med saltbuffert i systemet. Har saltbuffert använts skall den sköljas ur med avjoniserat vatten. Skölj ur alla ingående kanaler med 70 % metanol för att undvika bakterieväxt i slangar om systemet inte ska användas under en längre tid. Tryck ström brytaren på position 0. Tid och datum för avstängningen kommer att registreras i logfilen. Systemtvätt Systemtvätten ska utföras var 14:e dag eller när t ex svansade och frontade toppar uppstår. Börja med att ta bort kolonnen och ersätt den med en kolonnblank. Placera sedan slangarna A, B, och C i 2 % salpetersyra och tvätta instrumentet enligt följande: Kanal V (ml) Flöde (ml/min) Tid (min) Lösning a) Salpetersyra 2 % b) Salpetersyra 2 % c) Salpetersyra 2 % Placera därefter slangara i avjoniserat vatten och tvätta enligt följande: Kanal V (ml) Flöde (ml/min) Tid (min) Lösning a) Avjoniserat vatten b) Avjoniserat vatten c) Avjoniserat vatten Kanal V (ml) Flöde (ml/min) Tid (min) Lösning d) Natriumazid 0,02 % Två automatiska program finns för systemtvätten under Develop Methods på instrumentet. För tvätten med salpetersyra heter programmet SYRA VECKO och för tvätten med avjoniserat vatten och natriumazid heter programmet VATTEN VECKO. Placera slangarna A, B och C i salpetersyra eller avjoniserat vatten och markera önskat program, tryck på Run och därefter Routine.

38 38(40) Kolonntvätt För att behålla kolonnens kromatografiska egenskaper samt förlänga livslängden ska kolonnen tvättas efter ca 14 dagar. Anslut kolonnen till Waters 515 pump och skölj med pepsinlösning enligt nedan: Volym (ml) Flöde (ml/min) Tid (min) Lösning Kolonnriktning 10 1,0 10 Pepsinlösning 0,1 g/l Normal Lägg därefter kolonnen, med ändskruvar på i ett värmeskåp 37 C under 1 timme. Anslut därefter kolonnen till Waters 515 pump och tvätta kolonnen enligt: Sekvens V (ml) Flöde (ml/min) Tid (min) Lösning Kolonnriktning a) 7 0,2 35 NaCl,1 M Vänd b) 3 0,2 15 Avjoniserat Vänd H 2 O c) 7 0,2 35 NaOH, 1 M Vänd d) 3 0,2 15 Avjoniserat Vänd H 2 O e) 7 0,2 35 HCl, 1 M Vänd f) 3 0,2 15 Avjoniserat Vänd H 2 O g) 7 0,2 35 NaCl, 1 M Vänd h) 3 0,2 15 Natriumazid 0,02% Vänd Förkolon Byt filter i förkolonnen 1 gång/månad eller vid ökat mottryck. Kolonn Kolonndata, Source 15 Q 4.6/100 PE Arbetstemperatur Förvaringstemperatur Maxtryck över kolonnen Flöde, rekommenderat Flöde, max + 4 till + 40 C + 4 till + 30 C 4 MPa, 40 bar, 580 psi 0,5-2,5 ml/min 5 ml/min Kolonnidentitet Namnge och märk kolonner, med Dymo-tejp eller liknande märkningstejp, enligt följande: CDT-XX -Lotnummer Förklaring: XX = löpnummer från 01-99_W1,W2 (Instrument)

39 39(40) Ny kolonn Första gången när en ny kolonn tas i bruk eller när kolonnen inte har använts under en lång tid skall den jämviktas enligt följande: Sekvens V (ml) Flöde (ml/min) Tid (min) Lösning a) Gradient A b) 5 2 2,5 Gradient B c) 5 2 2,5 Gradient A Svarsrutiner Samtliga resultat och kromatogram skall granskas av två personer, dvs den som har analyserat aktuell sekvens samt ytterligare en behörig person Vid inläggning av resultat i CGM Analytix sätts resultaten i vilolägen, vilka sedan granskas av den andra behöriga personen Referensintervall < 2,0 % (män och kvinnor) Verifiering Imprecision Inomserie: Mätningen utförd: Provmaterial Nivå Antal mätningar SD CV % Poolat serum Medelvärde = 1,56 % 20 0,094 6,02 Poolat serum Medelvärde = 3,59 % 20 0,134 3,72 Inomserieimprecision beräknad på seriebestämningar enligt formel CV = s x 100 x s ( x x) 2 n 1 Mellanserie: Mätningarna gjorda mellan: Provmaterial Lot nr Nivå Antal mätningar SD CV % BIO-RAD; %CDT Låg:1,04 % 24 0,070 6,74 BIO-RAD; %CDT Hög:4,56 % 24 0,136 2,96 Riktighet CDT, disialo (HPLC) ingår i Equalis nationella kvalitetssäkringsprogram Resultaten rapporteras in till Equalis som sammanställer resultaten från de aktuella deltagande laboratorierna och rapporterar utfallet tillbaka Rapporterna arkiveras i pärm märkt Equalis CDT, disialo (HPLC)

40 40(40) Mätområde 0,5 20,0 % CDT Angiven mätosäkerhet Se dokumentet Ackrediteringens omfattning Klinisk Kemi Interferens och felkällor Genetiska transferrinvarianter Genetisk defekt i leverns sialiniseringsförmåga samt vissa fall av leversjukdom kan leda till ökat S-CDT (se medicinsk bakgrund i metodbeskrivning) Metoden tillåter identifiering av dessa EDTA-plasma kan ej användas Hemolys kan medföra baslinjedrift vid analys Huruvida svar kan lämnas ut eller ej bedöms från fall till fall Revideringar Datum Revisionsnr Orsak Ändrat till angiven mätosäkerhet och i sidhuvud Ändrat beställningsinformation, ändrat provberedning, ändrat kontrollberedning, ändrat analysering av prov, bytt ut bilder Ändrat, lagt till inställning av gemensamma integreringsparametrar, Bytt ut bilder, tagit bort om integrering av batch Tagit bort utskrift av provsekvens (Sample Set) Lagt till NPU kod, lagt till beskriving vad man gör efter körning Bytt logotype Ändrat g-tal för centrifugering Infört kolonntvätt och systemtvätt var 14:e dag. Rensat upp sådant som vi inte längre gör. Förtydligat efter analys Uppdaterat imprecision, ändrat under underhåll.