Huntingtons sjukdom och dess cellulära mekanismer

Transkript

1 Huntingtons sjukdom och dess cellulära mekanismer Petra Virtanen Independent Project in Biology Självständigt arbete i biologi, 15 hp, vårterminen 2014 Institutionen för biologisk grundutbildning, Uppsala universitet

2 Sammandrag Huntingtons sjukdom är en ärftlig, neurodegenerativ sjukdom som karaktäriseras av ofrivilliga, ryckiga rörelser samt att beteende och kognition påverkas. Sjukdomen bryter vanligen ut i vuxen ålder och leder till döden då det ännu inte finns något botemedel. Sjukdomen orsakas av en expansion av en CAG-triplett i huntingtingenen, men den exakta mekanismen är ännu oklar. I denna litteraturstudie behandlas teorier som berör förlust av huntingtinproteinets normala funktioner såväl som nya erhållna funktioner hos det muterade proteinet. Vildtypshuntingtin stimulerar den cellulära transporten av vesiklar, har en positiv effekt på synapsfunktionen och skyddar celler från apoptotiska stimuli. Förlust av dessa funktioner kan orsaka celldöd. Muterat huntingtin erhåller toxiska egenskaper. Muterade proteinet har visats ha en benägenhet att bilda intracellulära aggregat och har en negativ effekt på metabolismen och den cellulära transporten. Huntingtons sjukdom karaktäriseras initialt av en degeneration av striatum och cerebrala cortex. Den försämrade transporten av bone-derived neurotrophic factor (BDNF) till striatum och interaktionen mellan huntingtin-associated protein-1 (HAP1) och muterat huntingtin är två möjliga orsaker till denna selektiva celldöd men den ledande teorin idag berör rhesproteinet och dess interaktion med muterat huntingtin. Rhesproteinet har visats öka muterat huntingtins toxicitet genom att reducera dess benägenhet att bilda aggregat. Inledning Huntingtons sjukdom är en ärftlig neurodegenerativ sjukdom som främst klassas som en rörelsesjukdom men som även påverkar beteende och kognition. Ångest och lättretlighet är vanliga psykologiska komplikationer av sjukdomen (Paulsen et al. 2001). Hyperkinesi är det karaktäristiska symptomet vad gäller rörelsepåverkan och innebär att personer med Huntingtons sjukdom ofta drabbas av snabba, okontrollerbara rörelser. Denna motoriska överaktivitet är anledningen till att sjukdomen länge kallades för danssjukan. Huntingtons sjukdom nedärvs genom autosomal dominant nedärvning (MacDonald et al. 1993), vilket innebär att förändringen inte sitter på könskromosomerna och att det räcker att en av allelerna är drabbad för att man ska utveckla Huntingtons sjukdom. Det finns alltså en stor risk att bli drabbad om någon av ens föräldrar bär anlag för sjukdomen. Detta, tillsammans med att symptomen vanligtvis inte märks förrän vid 40 års ålder (Socialstyrelsen 2010), gör att sjukdomen ofta förs vidare till nästa generation; de med Huntingtons sjukdom hinner ofta skaffa barn innan de är medvetna om att de är drabbade. Uppskattningsvis drabbas 6-12 personer på av Huntingtons sjukdom i västvärlden (Socialstyrelsen 2010). Det är klarlagt att huntingtin är den påverkade genen i Huntingtons sjukdom men hur detta orsakar sjukdomsförloppet är ännu inte känt. Denna ovisshet utgör ett hinder för utvecklingen av ett botemedel, något som eftersträvas då sjukdomen leder till döden inom år efter att de första symptomen börjat visa sig. För att kunna utveckla ett botemedel mot Huntingtons sjukdom är det av stor betydelse att först klarlägga de cellulära mekanismerna som orsakar sjukdomen. 1

3 Denna litteraturstudie kommer att behandla den genetiska och cellulära grunden till Huntingtons sjukdom, med tonvikt på genen huntingtin och hur mutationer i denna kan leda till celldöd. Frågor som kommer att behandlas är: Vad har huntingtinproteinet för funktion i kroppen? Hur påverkas huntingtinproteinets egenskaper av mutationen och hur leder detta till celldöd? Hur kan mutationen leda till en selektiv celldöd av nervceller i striatum och cerebrala cortex? Frågeställningen sammanfattas som: Hur orsakar mutationer i huntingtinproteinet Huntingtons sjukdom? Påverkade hjärnstrukturer i Huntingtons sjukdom Personer med Huntingtons sjukdom drabbas av en degeneration främst av cerebrala cortex (hjärnbarken) och striatum, som är en del av basala ganglierna. Basala ganglierna är en ansamling av nervcellskroppar lokaliserade under cerebrala cortex i storhjärnan. Basala ganglierna är av stor betydelse för regleringen av rörelser, men har även en viktig funktion i kognition och beslutstagande (Guthrie et al. 2013). Basala ganglierna har två signaleringsbanor som innefattar rörelser: den direkta och den indirekta banan (se översiktsartikel av Alm 2004) och illustreras i Figur 1. Den direkta banan har som funktion att initiera frivilliga rörelser genom att sänka inhibitionen av talamus och därmed höja signaleringen till cerebrala cortex, medan den indirekta banans funktion är att hindra oönskade rörelser genom att öka inhibitionen. Detta medför att välkoordinerade rörelser kan erhållas. Avvikelser i den direkta eller indirekta banan i basala ganglierna kan ha stor påverkan på motorförmåga problem med den indirekta banan resulterar i en minskad inhibition av oönskade rörelser och resulterar därmed i återkommande ofrivilliga rörelser. Störningar i indirekta banan är orsaken till de motoriska problem som förekommer hos personer med Huntingtons sjukdom. 2

4 Figur 1. En sammanställning av basala gangliernas kommunikation som visar inhibitoriska signalvägar med GABA i blått, excitatoriska signalvägar med glutamat i rött och signalvägar med dopamin som neurotransmittor i gult. Den direkta banan går från striatum via GPi/SNr till talamus. Den indirekta banan går istället via GPe och NST till GPi och vidare till talamus. Figuren är baserad på data från Alm (2004). Upptäckten av Huntingtin 1983 lyckades Gusella med kollegor ange lokaliseringen för genen, kallad IT15 (Interesting Transcription 15), som orsakar Huntingtons sjukdom i det mänskliga genomet. Med hjälp av familjestudier kunde man identifiera en genetisk markör för Huntingtongenen (Gusella et al. 1983). Defekten hos personer med Huntingtons sjukdom är lokaliserad på den korta armen på kromosom 4 i en position som anges med 4p16.3 (MacDonald et al. 1989), där 4p indikerar att genen sitter på kromosom 4 korta arm och 16.3 är den exakta positionen. MacDonald och kollegor (1993) identifierade och namngav genen som huntingtin. Man fann att huntingtin innehåller repetitioner av en CAG-triplett vid 5'-änden av den kodande sekvensen. CAGtripletten kodar för aminosyran glutamin och det erhållna proteinet innehåller således en polyglutaminkedja (polyq) nära sin N-terminal. Man upptäckte att hos personer med Huntingtons sjukdom är antalet repetitioner fler än hos friska personer (MacDonald et al. 1993). Hos friska människor innehåller huntingtin 6 till 34 repetitioner av CAG-tripletten (Persichetti et al. 1995). Hos personer med Huntingtons sjukdom varierar antalet repetitioner från 37 till mer än 120 enheter (Persichetti et al. 1995). Antalet CAG-repetitioner påverkar ålder för insjuknande och individer med mer än 60 repeterade enheter drabbas ofta av den juvenila formen av Huntingtons sjukdom (Persichetti et al. 1995). Den juvenila formen av Huntington sjukdom kommer till uttryck innan 20 års ålder och drabbar omkring 5 % av alla med Huntingtons sjukdom i Europa och Nordamerika (Quarrell et al. 2012). 3

5 Huntingtin och dess naturliga funktion För att förstå sjukdomsförloppet och för att eventuellt kunna finna ett botemedel mot Huntingtons sjukdom är det av stort intresse att klargöra huntingtinproteinets naturliga funktion. Detta för att kunna avgöra om sjukdomen beror på att den naturliga funktionen hos proteinet går förlorad hos personer drabbade av Huntingtons sjukdom. Struktur Huntingtinproteinet har en molekylmassa på 348 kda (innehållande en polyglutaminkedja med 21 enheter) och uttrycks främst i nervceller i storhjärnans cortex som står i kontakt med striatum och i striatum (Fusco et al. 1999), men återfinns även i andra delar av hjärnan såsom i cerebellum (lillhjärnan) (Strong et al. 1993). Dessutom uttrycks proteinet utanför nervsystemet, till exempel i levern, bukspottkörteln och tjocktarmen (Strong et al. 1993). Huntingtin är således ett allmänt spritt protein som förekommer i hela kroppen. Proteinet består till stor del av så kallade HEAT-repetitioner (uppkallade efter de protein där de hittats: Huntingtin, elongeringsfaktor-3 (EF3), proteinfosfatas-2a (PP2A) och jästkinaset TOR1) (Li et al. 2006). HEAT-repetitionerna består av två antiparallella α-helixar som tillsammans bildar en så kallad hårnålsstruktur (Figur 2) (Li et al. 2006). HEAT-repetitionerna har visats ha en roll i huntingtins protein-proteininteraktioner (Andrade & Bork 1995). Figur 2. Molekylära strukturen för en HEAT-repetition, som är en stor komponent i huntingtinproteinet, med den karaktäristiska hårnålsstrukturen. Helixarna (blå) såväl som länken (röd) som binder dem tillsammans kan variera i längd. Från Li et al. (2006), med tillstånd från upphovsrättsinnehavaren. Funktion Med hjälp av immunhistokemi, en teknik där antikroppar används för att påvisa lokaliseringen av ett specifikt protein i en vävnad, har en interaktion mellan huntingtinproteinet och vesiklar i neuroner kunnat påvisas (DiFiglia et al. 1995). Huntingtin tycks därmed ha en roll i vesikulära transporter (DiFiglia et al. 1995), det vill säga cellulär transport av vesiklar innehållande olika materia (partiklar eller vätskor). Velier et al. (1998) styrker detta i sin studie där en association mellan huntingtin och klatrinbeklädda vesiklar och mellan huntingtin och icke-beklädda endosomala vesiklar har påvisats. Huntingtin och dess funktion i vesikeltransport kommer att diskuteras vidare nedan och effekten av att proteinet är muterat kommer att tas upp. Funktionen hos vildtypshuntingtin och muterat huntingtin samt deras egenskaper och påverkan på olika cellulära processer sammanfattas i Tabell 1 och diskuteras mer ingående nedan. 4

6 Tabell 1. Sammanställning av huntingtinproteinets egenskaper och funktioner i olika processer Processer Vildtypshuntingtin Muterat huntingtin Embryoutvecklingen Positiv effekt 1 Positiv effekt 1 Bildar intracellulära ansamlingar Nej Metabolism Ingen påverkan Negativ påverkan (mitokondriell dysfunktion och minskad glukosmetabolism) Vesikeltransport Stimulerar cellulära transporten Ja Hämmar cellulära transporten Synapsfunktion Ingen känd effekt Negativ effekt (färre synaptiska vesiklar i axonterminalen och minskad frisättning av neurotransmittorer) Apoptos Ökad cellöverlevnad Ökad känslighet mot excitotoxicitet 1 Embryoutvecklingen är beroende av huntingtin men påverkas inte om proteinet är muterat eller inte. Huntingtin och den tidiga embryoutvecklingen Huntingtinproteinet är livsviktig under embryogenesen (utvecklingen av det befruktade ägget mellan fjärde och tionde veckan). Total förlust av huntingtin (huntingtinknockout) hos möss har visats leda till embryonal död; i en studie med 225 homozygoter för huntingtinknockout dog alla under embryoutvecklingen (Nasir et al. 1995). Denna embryonala död sker dock inte i närvaro av huntingtin, oberoende av om huntintin har en expanderad polyglutaminsekvens (om proteinet är muterat eller inte) (Wexler et al. 1987). Ett tydligt bevis för detta är att vuxna människor med homozygot huntingtinmutation existerar (Wexler et al. 1987). Huntingtins roll i embryoutvecklingen styrks i en studie av Nguyen et al. (2013), där huntingtins påverkan på embryonala stamceller in vitro studerats och vars resultat presenteras i Figur 3. Man visade att huntingtinknockout har stor negativ inverkan på utvecklingen av nervstamceller bland annat genom en ökad celldöd, se Figur 3A (Nguyen et al. 2013). Muterat huntingtin visades dock stimulera utvecklingen av nervstamceller i en högre grad än vildtypsproteinet och ökar antalet och storleken på neurosfärer, ansamlingar av stamceller från hjärnan som växer in vitro, i jämförelse med vildtypen (Nguyen et al. 2013). I Figur 3B kan en signifikant skillnad ses i både storlek och antal neurosfärer mellan muterat (Q111) och normalt (Q18) huntingtin (Nguyen et al. 2013). Figur 3C visar att storleken på neurosfärerna är mindre hos huntingtinknockouts jämfört med kontrollen. 5

7 Figur 3. Huntingtinproteinets funktion i utvecklingen av nervstamceller in vitro. A. Jämförelse av antal och storlek på neurosfärer mellan vildtypshuntingtin (kontroll) och huntingtinknockout (knockout). B. Jämförelse av antal och storlek på neurosfärer mellan stamceller innehållande 18 respektive 111 repetitioner av CAG i huntingtingenen. C. Immunofluorescensmikroskopi som visar storleken på neurosfärerna hos kontroll och knockout och andelen celler i G2/M-fasen och delande celler, gröna respektive röda. Skalan är densamma i båda bilderna. Omritad efter Nguyen et al. (2013), med tillstånd från upphovsrättsinnehavaren. Muterat huntingtin bildar intracellulära ansamlingar Felveckning av protein kan leda till att proteinaggregat bildas. Varför proteinaggregaten erhåller toxiska egenskaper och kan leda till celldöd är ännu under stor debatt. En hypotes är att aggregationen resulterar i att proteinet blir otillgänglig att utföra sin naturliga funktion och om dessa funktioner är vitala för cellen kan detta leda till celldöd. Muterat huntingtin har visat ha en benägenhet att bilda ansamlingar, något som vildtypen saknar (DiFiglia et al. 1997). Ansamlingarna har påvisats in vivo såväl som in vitro (Scherzinger et al. 1997) och återfinns intracellulärt i kärnan, cellkroppen, axoner och dendriter (DiFiglia et al. 1997). Två transgena stammar av bananfluga (Drosophila melanogaster), där en uttryckte muterat humant huntingtin (Q138) och den andra uttryckte vildtypshuntingtin (Q15), jämfördes i en studie av Weiss et al. (2012) och visade samma tydliga skillnad i aggregatbildning, se Figur 4 där tydliga aggregat kan återses i den cell som uttrycker muterat huntingtin medan inga sådana aggregat återfinns i cellen med vildtypsproteinet. 6

8 Figur 4. Konfokal mikroskopibild över den cytoplasmatiska fördelningen av huntingtin i celler från bananfluga (Drosophila melanogaster). A. Cell med vildtypsvarianten av huntingtin (15 glutaminrepetitioner). Proteinet är diffust fördelad i cytoplasman. B. Cell som uttrycker muterat huntingtin med 138 repetitioner av glutamin. Tydliga proteinansamlingar syns. Från Weiss et al. (2012), med tillstånd från upphovsrättsinnehavaren. DiFiglia et al. (1997) testade hypotesen att ansamlingarna i synnerhet bildas i de strukturer som är påverkade hos personer med Huntingtons sjukdom, det vill säga i striatum och cerebrala cortex. Man använde immunohistokemi och fann stora, intracellulära ansamlingar av huntingtin i cortex och striatum hos personer med Huntingtons sjukdom. Man fann inga sådana ansamlingar i de andra delarna av basala ganglierna eller i cerebellum och man fann inte heller några ansamlingar i hjärnor från friska personer (DiFiglia et al. 1997). Studien visade även att det muterade huntingtin som byggde upp ansamlingarna var ubiquitinerat och att det är ett N-terminalfragment (innehållande polyglutaminkedjan) som bildar ansamlingarna (DiFiglia et al. 1997). Ubiquitin är ett protein som används för att märka andra intracellulära protein som ska brytas ner och hypotesen att det sker en ofullständig ubiquitinberoende proteolys av huntingtin presenterades i DiFiglia et al. (1997) studie. Senare visades att det muterade huntingtin som först bildar ansamlingarna inte är ubiquitinerat (Gong et al. 2012). Ubiquitineringen av huntingtinproteinet sker därmed efter att aggregaten bildats, alternativt bygger ubiquitinerat huntingtin på de redan bildade aggregaten (Gong et al. 2012). Det är fortfarande oklart om sjukdomsfenotypen beror på ansamlingarna eller på mer lösliga former av det muterade proteinet. Ansamlingar av muterat huntingtin har visats att inte vara ett krav för att sjukdomen ska initieras då Hodgson et al. (1999) i sin studie visat Huntingtonsmöss med degeneration av striatum utan synliga huntingtinaggregat. Denna studie antyder att ansamlingar av muterat huntingtin inte påverkar att sjukdomen bryter ut, men utesluter inte att aggregaten skulle ha en toxisk effekt i ett senare stadium av sjukdomen. På senare tid har forskare emellertid alltmer gått över till teorin att mer lösliga former av huntingtinproteinet är orsaken till Huntingtons sjukdom (Kim et al. 2010, Wang et al. 2012). Huntingtins påverkan på metabolismen Mitokondrier är viktiga för cellens energiomsättning då de är ansvariga för det mesta av cellens ATP-produktion. Felaktigt fungerande mitokondrier kan resultera i celldöd på grund av energibrist. Om muterat huntingtin reducerar cellens förmåga att utvinna energi kan vi, i form av detta, ha en möjlig förklaring till celldöden. 7

9 Personer med Huntingtons sjukdom har visats ha färre och till storlek mindre mitokondrier i striatum jämfört med friska personer (Kim et al. 2010). Flera faktorer, bland annat mitokondriell transkriptionsfaktor A (eng: mitochondrial transcription factor A), som är viktiga för mitokondriens funktion återfinns i en lägre koncentration hos drabbade personer jämfört med friska (Kim et al. 2010). Muterat huntingtins påverkan på metabolismen har studerats av Ciarmiello et al. (2006) som med hjälp av positronemissionstomografi (PET), en avbildningsteknik som använder radioaktiva markörer för att skapa tredimensionella bilder av biologiska processer, visade att personer med Huntingtons sjukdom har ett minskat upptag av glukos i striatum och cerebrala cortex. Dessa studier visar att muterat huntingtin påverkar metabolismen negativt och slutsatsen är att metabol dysfunktion kan ha en avgörande roll i uppkomsten av Huntingtons sjukdom. Huntingtins inverkan på vesikeltransporten och synapsfunktionen Anledningen till att den cellulära transporten och synapsfunktionen är av intresse i sammanhanget med Huntingtons sjukdom är att synapser och nervceller som inte används (där inga signaler skickas) elimineras. Muterat huntingtin påverkar synapsfunktionen negativt och kan därmed orsaka celldöd genom att cellen blir för inaktiv. Det har tidigare klargjorts att huntingtinproteinet associerats med vesikelmembran och man har nu visat att huntingtin har en roll i transporten av vesiklar längs cytoskelettet. Detta görs genom att huntingtin interagerar med proteinet HAP1 (huntingtin-associated protein-1) och tillsammans bildar de komplex med motorprotein och vesiklar (Li et al. 1995). Affiniteten för bindningen mellan huntingtin och HAP1 är proportionell mot längden på polyglutaminkedjan hos huntingtinproteinet, med andra ord binder muterat huntingtin hårdare till HAP1 jämfört med vildtypen (Li et al. 1995). Senare har det visats att muterat huntingtin reducerar bindningen mellan HAP1 och synaptiska vesiklar, och utövar därigenom en negativ effekt på vesikeltransporten (Li et al. 2003). HAP1 uttrycks enbart i hjärnan, främst i striatum och cerebrala cortex, vilket öppnar upp frågan om HAP1 och dess interaktion med huntingtin har en roll i det selektiva sjukdomsförloppet för Huntingtons sjukdom (Li et al. 1995). Kan interaktionen mellan HAP1 och muterat huntingtin tillsammans med den specifika förekomsten av HAP1 förklara degenerationen av striatum och cerebrala cortex? Denna fråga är ännu obesvarad. Muterat huntingtin har påvisats reducera kommunikationen mellan nervceller genom att ha en negativ effekt på synapsfunktionen. I studier av mösshjärnor har man klarlagt att axonterminaler, slutet av en axon som är en del av synapsen, innehållande aggregationer av huntingtin ofta har färre synaptiska vesiklar jämfört med axonterminaler utan sådana ansamlingar (Li et al. 2003). Muterat huntingtin binder även hårdare till synaptiska vesiklar än vildtypshuntingtin och minskar frisättningen av neurotransmittorn glutamat (Li et al. 2003). Vildtypshuntingtin är dock inte nödvändig för en normal utveckling av synapser (Metzler et al. 1999). Nervceller som inte används kommer normalt att elimineras. Hjärnan tolkar den sänkta kommunikationen orsakad av muterat huntingtin som att nervcellerna inte används och dessa kommer därför att elimineras. Detta besvarar dock inte frågan varför striatum och cerebrala cortex är de främst påverkade områdena i Huntingtons sjukdom, men 8

10 kan eventuellt förklara den mer generella celldöden i sjukdomens senare stadier. Det kvarstår dock att utreda om muterat huntingtins negativa effekt på synapsfunktionen erfordrar en närvaro av HAP1, om så är fallet kan detta vara en förklaring till den selektiva celldöden hos personer med Huntingtons sjukdom. Huntingtin påverkar den vesikulära transporten av BDNF Bone-derived neurotrophic factor (BDNF) är ett signalprotein som ökar överlevnaden hos vissa nervceller och som stimulerar tillväxt och differentiering av nya nervceller såväl som synapser (se översiktsartikel av Huang & Reichardt 2001). Intressant i det här sammanhanget är att BDNF som produceras i cerebrala cortex är viktig för överlevnaden av cellerna i striatum (Nakao et al. 1995). Muterat huntingtin har visats ha en negativ effekt på den cellulära transporten och en försämrad transport av BDNF skulle kunna vara en anledning till den selektiva degenerationen av striatum hos personer med Huntingtons sjukdom. Vildtypshuntingtin stimulerar transporten av BDNF längs mikrotubuli (Gauthier et al. 2004). Detta sker via HAP1 som interagerar med p150-subenheten av dynactin, ett protein som genom att koppla motorprotein (exempelvis dynein) till det som ska transporteras är väsentlig för cellulär transport (Gauthier et al. 2004). Muterat huntingtin reducerar den cellulära transporten av BDNF (Gauthier et al. 2004, Wang et al. 2012). Gauthier et al. (2004) använde nervceller från genmodifierade möss för att visa effekten av muterat huntingtin på BDNF-transporten. En CAG-expansion lades in i mössens endogena huntingtingen, detta för att på bästa sätt efterlikna den naturliga sjukdomen då den endogena genen kom att uttryckas på en normal nivå i muscellerna (Gauthier et al. 2004). Tre olika cellinjer användes: den första var vildtypshomozygot (+/+), den andra var heterozygot (+/109Q) och den tredje hade två kopior av den muterade allelen (109Q/109Q). Delar av studiens resultat presenteras i Figur 5. Förekomsten av muterat huntingtin sänkte tydligt transporthastigheten av BDNF men man fann ingen signifikant skillnad mellan cellinjerna med en respektive två muterade alleler (Gauthier et al. 2004). Detta styrker den genetiska dominansen i Huntingtons sjukdom, det vill säga att det räcker med en muterad allel för att utveckla sjukdomen. Dessa studier fastställer att muterat huntingtin har en negativ effekt på transporten av BDNF. Detta kan vara en bidragande faktor till sjukdomsförloppet för Huntingtons sjukdom då BDNF stimulerar överlevnaden av striatumceller, och en försämrad transport av BDNF skulle innebära en ökad i degeneration av striatumceller. Hur stor inverkan den försämrade BDNFtransporten har på sjukdomsförloppet är dessvärre ännu oklart. 9

11 Figur 5. Huntingtinproteinets påverkan på hastigheten av vesikeltransporten av BDNF. Tydlig påverkan ses hos de cellinjer med minst en mutant huntingtinallel i jämförelse med vildtypen, men ingen skillnad kan ses mellan homozygota och heterozygota mutanter. 109Q innebär att man använts sig av alleler med 109 stycken CAGrepetitioner. Omritad efter Gauthier et al. (2004). Huntingtin som en överlevnadsmolekyl Som tidigare nämnts är det fortfarande oklart om sjukdomen beror på de nya egenskaper som muterat huntingtin erhåller eller på förlust av proteinets naturliga funktioner. Celldöden hos personer med Huntingtons sjukdom kan ha en förklaring i det faktum att vildtypshuntingtin fungerar beskyddande för cellen medan muterat huntingtin saknar denna egenskap. Celler med muterat huntingtin tenderar alltså att vara mer känsliga för signaler som orsakar celldöd, så kallad apoptotisk stimuli, och sjukdomen skulle därmed kunna orsakas av en förlust av proteinets naturliga funktion. In vitro-studier har visat att vildtypshuntingtin skyddar nervceller i det centrala nervsystemet från apoptotisk stimuli, till exempel från dödsreceptorer (Rigamonti et al. 2000). Detta sker genom inhibition av kaspas-3, ett proteas som har en viktig funktion i programmerad celldöd (Rigamonti et al. 2000, Zhang et al. 2006). Genom att använda loxp-cre rekombineringsssystemet kunde Dragatsis et al. (2000) erhålla en konditionell knockout med avseende på huntingtin i framhjärnan och testiklarna (strukturer med höga nivåer av huntingtin) hos möss. Man kunde på så vis studera vildtypshuntingtins funktion i dessa vävnader in vivo och fann att huntingtin är nödvändig för nervcellers överlevnad och funktion (Dragatsis et al. 2000). En konditionell knockout innebär i detta fall att man stänger av en specifik gen i en viss vävnad, jämfört med vanlig knockout då man 10

12 stänger av genen i hela kroppen. Det är nödvändigt att använda denna teknik för in vivostudier då det tidigare klargjorts att vildtypshuntingtin är vital under den tidiga utvecklingen (se Huntingtin och den tidiga utveckligen) och att vanlig knockout skulle innebär embryonal död (Nasir et al. 1995). Praktiska utförandet av Cre-lox-rekombination presenteras översiktligt i Figur 6, men en kritiskt punkt är att enzymet Cre-rekombinas enbart ska uttryckas i de vävnader där man vill stänga av genen. Detta utförs genom att låta Cre-genen styras av en vävnadsspecifik promotor. Figur 6. LoxP-Cre rekombineringsssystemet är en teknik som kan användas för att framkalla konditionella knockouts. DNA flankerat av loxp-sekvenser kommer att spjälkas bort av enzymet Cre-rekombinas och bilda en plasmid som sedan bryts ner. På så vis kommer den påverkade genen att stängas av i alla celler där Cre uttrycks, vilket man kan påverka genom att låta denna styras av en celltypsspecifik promotor. Figuren är baserad på data från Hoa et al. (2002). Leavitt et al. styrker vildtypshuntingtins anti-apoptotiska egenskap i sin studie från Man visade att striatumceller från möss som uttrycker vildtypen har en högre överlevnad och skydd mot apoptos jämfört med striatumceller som uttrycker muterat humant huntingtin (Leavitt et al. 2006). Muterat huntingtin visades öka känsligheten för excitotoxicitet, orsakad av höga intracellulära halter av kalciumjoner (Ca 2+ ) på grund av långvariga excitatoriska stimuli, jämfört med vildtypen (Leavitt et al. 2006). Rhesproteinet kärnan till den selektiva celldöden? Den selektiva celldöden sedd hos personer med Huntingtons sjukdom är fortfarande en olöst gåta för dagens Huntingtonsforskare. Hur kan mutationer i ett protein med en så omfattande utbredning i kroppen så specifikt påverka striatum och cerebrala cortex? Troligtvis beror det på flertalet anledningar, där HAP1 som beskrivits ovan kan vara en, men den idag ledande teorin berör rhesproteinet och dess interaktioner med muterat huntingtin. 11

13 Rhes (Ras homolog enriched in striatum, sv: Rashomolog anrikad i striatum) är ett G-protein som fungerar som ett GTPas och uttrycks nästan helt selektivt i striatum (Subramaniam et al. 2009). Rhes binder till muterat huntingtin och främjar dess toxiska egenskap genom att hindra bildandet av ansamlingar (Subramaniam et al. 2009). Detta görs genom att rhes stimulerar SUMOylationen av muterat huntigntin (Subramaniam et al. 2009). SUMOylation är en posttranslationell modifikation som sker genom att SUMO-protein (small ubiquitin-like modifier) kovalent binder till proteinet (Subramaniam et al. 2009), vilket reducerar huntingtins benägenhet att bilda aggregat. Det faktum att rhes enbart uttrycks i stora mängder i striatum och interagerar med muterat huntingtin och höjer dennas toxicitet är ett argument för att rhes skulle kunna vara förklaringen till den selektiva celldöden hos personer med Huntingtons sjukdom. Möjligheten att utveckla mediciner som inhiberar rhes eller som hämmar interaktionen mellan rhes och huntingtin har därför börjat studeras. En sådan medicin skulle eventuellt kunna skjuta upp eller helt hindra utbrottet av sjukdomen. Djurmodeller har visat på stora framgångar inom detta område då man visat att utraderande av rhes hos artificiellt Huntingtonssjuka möss tydligt fungerar beskyddande för striatum (Mealer et al. 2013). I studien användes dock en modell med 3-NP (3-nitropropionic acid), en mitokondrieinhibitor, för att framkalla Huntingtonslika symptom. Man kan därför ifrågasätta om studiens resultat är helt applicerbara på Huntingtons sjukdom då mössen inte var verkligt Huntingtonssjuka. Diskussion Man har länge diskuterat om Huntingtons sjukdom beror på att det muterade huntingtinproteinet erhåller toxiska egenskaper (en gain-of-function -mutation) eller om sjukdomen helt enkelt beror på den förlorade funktionen hos vildtypshuntingtin. I denna litteraturstudie har flera exempel lagts fram som argumenterar för att Huntingtons sjukdom beror på båda typerna; vildtypshuntingtin har en essentiell effekt i cellerna och muterat huntingtin verkar toxiskt (Li et al. 2003, Nguyen et al. 2013). Huntingtinproteinets funktion i kroppen har presenterats. Vildtypshuntingtin är absolut nödvändigt under embryoutvecklingen, har en stimulerande effekt på vesikeltransport och skyddar nervceller mot olika apoptotiska stimuli (Li et al. 1995, Leavitt et al. 2006). Metabol dysfunktion samt försämrad vesikeltransport och synapsfunktion förekommer hos personer med Huntingtons sjukdom och skulle kunna orsaka celldöd (Li et al. 2003, Kim et al. 2010). Muterat huntingtin har även en benägenhet att bilda intracellulära ansamlingar (DiFiglia et al. 1997, Weiss et al. 2012), men rollen för dessa i sjukdomsförloppet är ännu inte klart och man har på senare tid börjat fokusera på mer lösliga former av huntingtinproteinet som orsak till sjukdomen (Kim et al. 2010, Wang et al. 2012). Vildtypshuntingtin stimulerar transporten av BDNF medan muterat huntingtin reducerar transporten. Då BDNF stimulerar överlevnaden av striatumceller kan den försämrade transporten vara en förklaring till del selektiva degenerationen av striatum hos personer med Huntingtons sjukdom. 12

14 Vad som orsakar sjukdomsförloppet är ännu oklart, detta trots att den berörda genen identifierades för över 20 år sedan (MacDonald et al. 1989). Bevisligen rör det sig om ett väldigt komplext cellulärt händelseförlopp och delar av patofysiologin börjar sakta uppdagas. Detta återupplivar hoppet att kunna finna ett effektivt botemedel mot Huntingtons sjukdom. Men kan vi med hjälp av en ökad förståelse av de cellulära mekanismer som orsakar Huntingtons sjukdom i framtiden hitta ett botemedel? Att försöka sänka nivåerna av muterat huntingtin har länge varit ett ledande förslag till en möjlig medicin och har även erhållit lovande resultat bland annat från Kordasiewicz et al. (2012). Där visades att nedbrytning av huntingtin-mrna leder till minskade symptom hos möss med Huntingtons sjukdom (Kordasiewicz et al. 2012). Problemet med detta angreppssätt är att huntingtin inte bara uttrycks i de områden som är påverkade i Huntingtons sjukdom utan uttrycks i hela kroppen. En sänkning av huntingtinnivån skulle kunna ha ödesdigra effekter som man ännu inte känner till. För att ta reda på om det är möjligt att använda substanser som sänker huntingtinnivån som en behandling mot Huntingtons sjukdom krävs därför först att vi utökar vår förståelse för huntingtins funktion utanför de områden som är påverkade i Huntingtons sjukdom. Detta problem kringgås dock vid användandet av en rhesinhibitor, då rhes nästan uteslutande uttrycks i striatum. Rhes ökar toxiciteten hos muterat huntingtin och skulle därför vara ett möjligt angreppsmål för en medicin mot Huntingtons sjukdom. Även denna teori kräver mera studier då det ännu är oklart vad rhes har för funktioner utöver dess interaktion med huntingtin. För att vara säker på att inga allvarliga bieffekter erhålls vid hämning av rhes interaktion med huntingtin måste dessa funktioner först klargöras. Slutsats I denna litteraturstudie har olika funktioner hos huntingtin, vildtypsproteinet såväl som den muterade versionen, diskuterats och hur mutationen kan orsaka Huntingtons sjukdom har behandlats. Vad som orsaker sjukdomen är fortfarande oklart, men man har klargjort för flera funktioner hos vildtypsproteinet såväl som det muterade proteinet som kan vara en del av förklaringen. Forskning pågår nu för att finna ett botemedel mot Huntingtons sjukdom. Mealer et al. (2013) har visat att utraderande av rhesproteinet tydligt lindrar sjukdomens symptom hos möss och att detta möjligen skulle kunna användas som medicin mot Huntingtons sjukdom. Tack Jag vill tacka mina medstudenter Jerker Melin och Caroline Engbom för deras återkoppling och förbättringsförlag på arbetet. Stort tack även till min handledare Lage Cerenius för värdefulla råd och stöd. Till sist vill jag tacka Macaully Muir för ett stort tålamod och engagemang i mitt arbete. 13

15 Referenser Alm PA Stuttering and the basal ganglia circuits: a critical review of possible relations. Journal of Communication Disorders 37: Andrade MA, Bork P HEAT repeats in the Huntington s disease protein. Nature Genetics 11: Ciarmiello A, Cannella M, Lastoria S, Simonelli M, Frati L, Rubinsztein DC, Squitieri F Brain white-matter volume loss and glucose hypometabolism precede the clinical symptoms of Huntington s disease. Journal of Nuclear Medicine 47: DiFiglia M, Sapp E, Chase K, Schwarz C, Meloni A, Young C, Martin E, Vonsattel JP, Carraway R, Reeves SA, Boyce FM, Aronin N Huntingtin is a cytoplasmic protein associated with vesicles in human and rat brain neurons. Neuron 14: DiFiglia M, Sapp E, Chase KO, Davies SW, Bates GP, Vonsattel JP, Aronin N Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science 277: Dragatsis I, Levine MS, Zeitlin S Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice. Nature Genetics 26: Fusco FR, Chen Q, Lamoreaux WJ, Figueredo-Cardenas G, Jiao Y, Coffman JA, Surmeier DJ, Honig MG, Carlock LR, Reiner A Cellular localization of huntingtin in striatal and cortical neurons in rats: Lack of correlation with neuronal vulnerability in Huntington s disease. Journal of Neuroscience 19: Gauthier LR, Charrin BC, Borrell-Pagès M, Dompierre JP, Rangone H, Cordelières FP, De Mey J, MacDonald ME, Leßmann V, Humbert S, Saudou F Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell 118: Gong B, Kielar C, Morton AJ Temporal separation of aggregation and ubiquitination during early inclusion formation in transgenic mice carrying the Huntington s disease mutation. PLOS ONE 7: e Gusella JF, Wexler NS, Conneally PM, Naylor SL, Anderson MA, Tanzi RE, Watkins PC, Ottina K, Wallace MR, Sakaguchi AY, Young AB, Shoulson I, Bonilla E, Martin JB A polymorphic DNA marker genetically linked to Huntington s disease. Nature 306: Guthrie M, Leblois A, Garenne A, Boraud T Interaction between cognitive and motor cortico-basal ganglia loops during decision making: a computational study. Journal of Neurophysiology 109: Hoa TTC, Bong BB, Huq E, Hodges TK Cre/lox site-specific recombination controls the excision of a transgene from the rice genome. Theoretical and Applied Genetics 104:

16 Hodgson JG, Agopyan N, Gutekunst CA, Leavitt BR, LePiane F, Singaraja R, Smith DJ, Bissada N, McCutcheon K, Nasir J, Jamot L, Li XJ, Stevens ME, Rosemond E, Roder JC, Phillips AG, Rubin EM, Hersch SM, Hayden MR A YAC mouse model for Huntington s disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity and selective striatal neurodegeneration. Neuron 23: Huang EJ, Reichardt LF Neurotrophins: Roles in neuronal development and function. Annual Review of Neuroscience 24: Kim J, Moody JP, Edgerly CK, Bordiuk OL, Cormier K, Smith K, Beal MF, Ferrante RJ Mitochondrial loss, dysfunction and altered dynamics in Huntington s disease. Human Molecular Genetics 19: Kordasiewicz HB, Stanek LM, Wancewicz EV, Mazur C, McAlonis MM, Pytel KA, Artates JW, Weiss A, Cheng SH, Shihabuddin LS, Hung G, Bennett CF, Cleveland DW Sustained therapeutic reversal of Huntington s disease by transient repression of huntingtin synthesis. Neuron 74: Leavitt BR, van Raamsdonk JM, Shehadeh J, Fernandes H, Murphy Z, Graham RK, Wellington CL, Hayden MR Wild-type huntingtin protects neurons from excitotoxicity. Journal of Neurochemistry 96: Li XJ, Li SH, Sharp AH, Nucifora FC, Schilling G, Lanahan A, Worley P, Snyder SH, Ross CA A huntingtin-associated protein enriched in brain with implications for pathology. Nature 378: Li H, Wyman T, Yu ZX, Li SH, Li XJ Abnormal association of mutant huntingtin with synaptic vesicles inhibits glutamate release. Human Molecular Genetics 12: Li W, Serpell LC, Carter WJ, Rubinsztein DC, Huntington JA Expression and characterization of full-length human huntingtin, an elongated HEAT repeat protein. Journal of Biological Chemistry 281: MacDonald ME, Haines JL, Zimmer M, Cheng SV, Youngman S, Whaley WL, Wexler N, Bucan M, Allitto BA, Smith B, Leavitt J, Poustka A, Harper P, Lehrach H, Wasmuth JJ, Frischauf AM, Gusella JF Recombination events suggest potential sites for the Huntington s disease gene. Neuron 3: MacDonald ME, Ambrose CM, Duyao MP, Myers RH, Lin C, Srinidhi L, Barnes G, Taylor SA, James M, Groot N et al A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington s disease chromosomes. Cell 72: Mealer RG, Subramaniam S, Snyder SH Rhes deletion is neuroprotective in the 3- nitropropionic acid model of Huntington s disease. Journal of Neuroscience. 33:

17 Metzler M, Chen N, Helgason CD, Graham RK, Nichol K, McCutcheon K, Nasir J, Humphries RK, Raymond LA, Hayden MR Life without huntingtin. Journal of Neurochemistry 72: Nakao N, Brundin P, Funa K, Lindvall O, Odin P Trophic and protective actions of brain-derived neurotrophic factor on striatal DARPP-32-containing neurons in vitro. Developmental Brain Research 90: Nasir J, Floresco SB, O Kusky JR, Diewert VM, Richman JM, Zeisler J, Borowski A, Marth JD, Phillips AG, Hayden MR Targeted disruption of the Huntington s disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes. Cell 81: Nguyen GD, Gokhan S, Molero AE, Mehler MF Selective roles of normal and mutant huntingtin in neural induction and early neurogenesis. PLOS ONE 8: e Paulsen JS, Ready RE, Hamilton JM, Mega MS, Cummings JL Neuropsychiatric aspects of Huntington s disease. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry 71: Persichetti F, Ambrose CM, Ge P, McNeil SM, Srinidhi J, Anderson MA, Jenkins B, Barnes GT, Duyao MP, Kanaley L, Al E Normal and expanded Huntington s disease gene alleles produce distinguishable proteins due to translation across the CAG repeat. Molecular Medicine 1: Quarrell O, O Donovan KL, Bandmann O, Strong M The prevalence of juvenile Huntington s disease: A review of the literature and meta-analysis. PLOS Currents 4: e4f8606b742ef3 Rigamonti D, Bauer JH, De-Fraja C, Conti L, Sipione S, Sciorati C, Clementi E, Hackam A, Hayden MR, Li Y, Cooper JK, Ross CA, Govoni S, Vincenz C, Cattaneo E Wildtype huntingtin protects from apoptosis upstream of caspase-3. Journal of Neuroscience 20: Scherzinger E, Lurz R, Turmaine M, Mangiarini L, Hollenbach B, Hasenbank R, Bates GP, Davies SW, Lehrach H, Wanker EE Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell 90: Socialstyrelsen. Huntingtons sjukdom. WWW-dokument : Hämtad: Strong TV, Tagle DA, Valdes JM, Elmer LW, Boehm K, Swaroop M, Kaatz KW, Collins FS, Albin RL Widespread expression of the human and rat Huntington s disease gene in brain and nonneural tissues. Nature Genetics 5: Subramaniam S, Sixt KM, Barrow R, Snyder SH Rhes, a striatal specific protein, mediates mutant-huntingtin cytotoxicity. Science 324:

18 Velier J, Kim M, Schwarz C, Kim TW, Sapp E, Chase K, Aronin N, DiFiglia M Wildtype and mutant huntingtins function in vesicle trafficking in the secretory and endocytic pathways. Experimental Neurology 152: Wang L, Lin F, Wang J, Wu J, Han R, Zhu L, DiFiglia M, Qin Z Expression of mutant N-terminal huntingtin fragment (htt q) in astrocytes suppresses the secretion of BDNF. Brain Research 1449: Weiss KR, Kimura Y, Lee WCM, Littleton JT Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington s disease model. Genetics 190: Wexler NS, Young AB, Tanzi RE, Travers H, Starosta-Rubinstein S, Penney JB, Snodgrass SR, Shoulson I, Gomez F, Arroyo MAR, Penchaszadeh GK, Moreno H, Gibbons K, Faryniarz A, Hobbs W, Anderson MA, Bonilla E, Conneally PM, Gusella JF Homozygotes for Huntington s disease. Nature 326: Zhang Y, Leavitt BR, van Raamsdonk JM, Dragatsis I, Goldowitz D, MacDonald ME, Hayden MR, Friedlander RM Huntingtin inhibits caspase-3 activation. The EMBO Journal 25: