CORRELATION BETWEEN ENDOMETRIAL MARKERS AND PREGNANCY OUTCOME IN WOMEN WITH UNEXPLAINED INFERTILITY Liselotte Runesson

Transkript

1 Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete, 15 högskolepoäng CORRELATION BETWEEN ENDOMETRIAL MARKERS AND PREGNANCY OUTCOME IN WOMEN WITH UNEXPLAINED INFERTILITY Liselotte Runesson Handledare: Anneli Stavreus-Evers Institutionen för kvinnors och barns hälsa Akademiska sjukhuset Uppsala

2 ABSTRACT A defect implantation process is the major reason for unexplained infertility. Estrogen and progesterone are steroid hormones preparing the endometrium for implantation. They mediate their effect through their receptors: estrogen receptor alpha and beta and progesterone receptor A and B, respectively. Leukemia inhibitory factor (LIF), which is also important for implantation, mediates its effect through LIF receptor and the coreceptor, gp130, and is down regulated by suppressors of cytokine signaling 1. The aim of the study was to compare the levels of the steroid hormone receptors and LIF related factors in the endometrium of two groups of women with the diagnosis unexplained infertility: one that became pregnant after assisted reproduction and one that did not become pregnant. Before treatment of these women, endometrial mrna was collected during the window of implantation in the menstrual cycle. The levels of specific mrnas were measured with real-time PCR. Women who had become pregnant had a significantly higher level of steroid hormone receptors. Thus, these proteins seem to be important for a pregnancy and may be suitable as receptivity markers. KEYWORDS Leukemia inhibitory factor (LIF), endometrial receptivity markers, blastocyst endometrial communication, real time PCR SYBR-green, window of implantation. INTRODUKTION Ungefär 15 % av alla par i världen är infertila. Det finns flera olika orsaker till infertilitet, såsom polycystiskt ovariesyndrom (PCOS), endometrios, äggledarskada och defekta spermier [1]. Av alla infertila par uppskattas cirka 30 % vara oförklarat infertila [2]. Den vanligaste anledningen till oförklarad infertilitet hos annars friska kvinnor är defekt implantationsprocess [3]. Forskning inom området är viktig för att öka möjligheten för barnlösa par att få barn. Effektivare och skonsammare metoder skulle kunna minska både det psykiska och fysiska lidandet för dessa par. Det kan även vara av ekonomiskt intresse för samhället att få effektivare metoder. Under de senaste åren har många framsteg gjorts inom fertilitetsforskning men trots detta är antalet graviditeter hos in vitro fertiliserade infertila kvinnor fortfarande lågt [4]. En kvinna som sökt hjälp för barnlöshet och visas ha normal menstruationscykel räknas som oförklarat infertil om hon har normala hormonnivåer, saknar patologiska defekter på livmodern och har en man vars sädesvätska är normal [2]. Ovarialcykeln består av två och menstruationscykeln av tre faser. Ovarialcykelns faser är follikelfas och lutealfas. Under follikelfasen inträffar menstruationscykelns menstruationsfas och proliferationsfas. Ägglossning sker mellan follikel- och lutealfas. Under lutealfasen inträffar menstruationscykelns sekretionsfas. Första dagen på menstruationen markerar övergången från en cykel till nästa och nivån av follikelstimulerande hormon (FSH) är då hög. FSH stimulerar ett antal folliklar att börja utvecklas i äggstocken. Efter en tid fortsätter bara en av folliklarna att växa medan de andra bryts ner. Allt eftersom den kvarvarande follikeln börjar växa sig större, börjar den producera större mängder östrogen, vilket får livmoderslemhinnan att börja växa till. Detta sker i början av proliferationsfasen och fortgår under hela fasen. Vid ägglossning dominerar hormonerna östrogen och luteiniserande hormon (LH). De höga östrogennivåerna signalerar till hypotalamus att ägget är fullt utmognat och hypothalamus skickar då en signal till hypofysen att frisätta LH. LH-nivåerna stiger snabbt och kraftigt och utlöser själva ägglossningen. Ägglossningen är när ägget bryter sig ut från follikeln och börjar vandra mot livmodern. Den kvarvarande follikeln bildar en gulkropp som

3 producerar östrogen och stora mängder progesteron. Under sekretionsfasen sjunker östrogennivåerna något och progesteron ökar kraftigt. Samtidigt förbereds livmodern för en eventuell implantation genom att den växer till och differentierar. Progesteron dämpar även nivåerna av FSH och LH. Livmoderslemhinnan utvecklas som en effekt av östrogen och progesteron. Östrogen får livmoderslemhinnan att växa medan progesteron står för differentieringen. Om ägget inte skulle befruktas, tillbakabildas gulkroppen och nivåerna av östrogen och progesteron sjunker, vilket leder till att artärerna till livmoderslemhinnan stryps av och att nedbrytande enzym frisätts. Detta gör att livmoderslemhinnans ytskikt bryts ner och dör och vi får en menstruation. Skulle däremot en befruktning ske, tillbakabildas inte gulkroppen utan fortsätter att producera östrogen och progesteron. Detta hindrar LH och FSHnivåerna från att stiga och därmed hindras även en ny menstruationscykel. Vid en befruktning är det viktigt att livmoderslemhinnan utvecklas på rätt sätt för att embryot ska kunna fästa och penetrera livmoderslemhinnan. Det är också viktigt att utvecklingen av livmoderslemhinnan är synkroniserad med utvecklingen av embryot. En eventuell befruktning sker i den yttersta tredjedelen av äggledaren. Därefter tar det ca 2-4 dagar för det befruktade ägget att nå livmodern. Under implantationsprocessen av ett befruktat ägg sker en apposition, en adhesion och en penetration. Apposition betyder att blastocysten kommer nära intill endometrieepitelet. Adhesionen är när embryot kommer i kontakt med och fäster till endometriet och under penetrationen tar det befruktade ägget sig in i livmoderslemhinnan [5]. För att dessa steg ska ske krävs ett synkroniserat och väl reglerat samarbete mellan embryots utveckling och livmoderns utmognad. Östrogen och progesteron styr även flera lokala faktorer som är viktiga för implantationsprocessen. En av dessa faktorer är leukemia inhibitory factor (LIF) [6]. LIF är en cytokin som är medlem i interleukin (IL)-6 familjen [6]. Denna cytokin är ett glykoprotein med flera funktioner i kroppen: bland annat stimulerar den proliferation, differentiering, cellöverlevnad och inducerar uttryck av andra cytokiner och reglerande molekyler [7]. LIF verkar genom att binda till LIF-receptor (LIFR). Kopplat till LIFR sitter receptor-subenheten gp130. När LIF binder till receptorkomplexet omvandlas det till ett högaffinitets receptorkomplex som kan aktivera olika intracellulära signaleringsvägar, bland annat janus kinase (JAK)/signal transducers and activators of transcription protein (STAT) och mitogen-activated protein kinase (MAPK) [7]. JAK/STAT-vägen orsakar DNAtranskription och cellaktivitet, MAPK reglerar cellaktiviteter som genuttryck, mitos och differentiering. LIF nedregleras av suppressors of cytokine signaling 1 (SOCS1). Det tycks finnas ett samband mellan LIFR, gp130 och SOCS1 hos fertila kvinnor: när LIFR och gp130 nivåerna är höga verkar nivåerna av SOCS1 vara låga. Detta samspel verkar saknas hos vissa oförklarat infertila kvinnor [2]. Det har även visats att hos kvinnor med bevisad fertilitet uttrycks LIF och LIFR-mRNA under hela menstruationscykeln och ökar sedan under mitten och i slutet av sekretionsfasen samt i början av graviditeten [7]. Vävnadsprover från infertila kvinnor har vid cellodling visats producera mindre mängd LIF än prover från fertila kvinnor [7]. Att LIF är viktigt vid implantation visades först på möss. Hos honor som inte har någon fungerande LIF-gen varken fäster eller mognar blastocysten. Förs däremot blastocysten över till en hona med fungerande LIF-gen lyckas implantationen och blastocysten utvecklas [8]. Detta innebär att honor som är LIF-negativa faktiskt är fertila och ett embryo kan bildas, men att det är själva implantationen som inte fungerar, inte ens om embryot uttrycker LIF kan det fästa [9].

4 Hos människor sker implantation endast under tiden för implantationsfönstret, som är i mitten av den sekretoriska fasen [10] - ungefär dag i menstruationscykeln [11]. Det är under implantationsfönstret som livmodern är som mest mottaglig för ett embryo [11]. Men interaktionen mellan embryo och endometrium startar innan embryot har fäst till endometrieepitelytan. Embryot skickar ut olika ligander till receptorer som finns på det luminala epitelet och på körtelepitelet [10]. Det är även under denna period som LIF når de högsta uttrycksnivåerna - när endometriet är under påverkan av progesteron. Det finns en studie som visar att LIF även finns i pinopoder [12]. Pinopoder, som är utskjutande endometrieepitelceller, växer upp som små svampar under tiden för implantationsfönstret [2]. Den främsta strukturella markören för en mottaglig livmoder är närvaron av pinopoder. Fullt utmognade pinopoder är synliga under endast 48 timmar. Hur länge de syns varierar från person till person men överstiger aldrig 48 timmar [11]. Pinopoder är beroende av progesteron och ökar när mängden progesteron ökar, vilket sker under sekretionsfasen [7]. När progesteronnivåerna ökar, ökar också mognaden för pinopoderna och progesteronnivåerna är som högst under implantationsfönstret. Pinopoderna är då även fullt utvecklade. När progesteronnivåerna sedan sjunker försvinner pinopoderna [13]. Ett högt LIFuttryck är en kemisk markör för mottagligt endometrium hos fertila kvinnor [10]. LIF, LIFR och pinopoder uttrycks samtidigt och bekräftar en mottaglig livmoder [7]. För att embryot ska kunna fästa till endometriet under implantationen, krävs att endometriet uttrycker en ökad mängd oligosackarider och att embryot producerar dess ligand L-selectin. LIF uppreglerar uttrycket av dessa. LIF har även visats spela en roll i både den adhesiva och invasiva fasen av implantationen genom att det har effekt på trofoblasterna och att det reglerar trofoblastdifferentieringen [10]. Trofoblasterna är de yttersta cellerna på blastocysten, som under implantationsprocessen skickar ut enzymer som bryter ner livmoderslemhinnan så att blastocysten kan ta sig in. Trofoblasterna bildar även placenta. LIF har även förmågan att reglera migrationen av gonadotropin-releasing-hormone neuroner under fosterutvecklingen, denna process är grundläggande för att utveckla normal reproduktionsfunktion [10]. Östrogen och progesteron utövar sin effekt via sina respektive receptorer. Receptorerna är progesteronreceptor-a (PRA+B) och -B (PRB), östrogenreceptor-α (ER-α) och β (ER β). Nivåerna av progesteronreceptor-a och -B i stromat är högt under proliferationsfas och sekretionsfas. I endometrieepitelet sjunker däremot nivåerna under sekretionsfas. Östrogenreceptor-α uttrycks mycket i både körtelepitel och stromaceller under proliferationsfas och minskar under sekretionsfas. Östrogenreceptor β uttrycks främst i körtelepitelet men nivåerna av denna receptor är dock låg genom hela cykeln [13]. Syftet med denna studie var att mäta mrna nivåerna av LIF, LIFR, gp130, SOCS1, ERα, ERβ, PRA+B och PRB hos kvinnor som har diagnosen oförklarad infertilitet. Kvinnorna behandlades efter provtagning med in vitro fertilisering (IVF) och en jämförelse gjordes mellan de som blivit gravida och de som inte blivit det. De studerade faktorerna påverkar livmoderslemhinnans receptivitet för att ta emot ett befruktat ägg. MATERIAL OCH METOD Biopsier Biopsier på endometrium från 29 oförklarat infertila kvinnor (27,5 ± 7,5 år) samlades in under Biopsierna togs mellan LH+5 till LH+9 i menstruationscykeln. Biopsierna låg i ett stabiliseringsreagens, RNA-later (Qiagen, Hilden, Tyskland). Efter att biopsierna tagits behandlades samtliga kvinnor med in vitro fertilisering (IVF) vilket resulterade i att 11 av dem blev gravida.

5 Tillstånd för Studier av livmoderslemhinnan hos fertila kvinnor och kvinnor som skall behandlas med assisterad befruktning för barnlöshet, diarienummer 78/03, hade erhållits från Forskningsetikkommittén syd på Huddinge sjukhus (Stockholm, Sverige). Mätning av RNA Efter förvaring i -20ºC i några månader utvanns RNA (RNeasy Mini Kit; Qiagen, Maryland, USA) från biopsiproverna. Dess renhet och koncentration mättes med en gelbaserad metod (Agilent RNA 6000 Pico Kit; Agilent technologies, Waldbronn, Tyskland). RNA mättes också med en fluorescensbaserad metod (Quant it RNA Assay kit; Invitrogen, Eugene, OR, USA) i Qubit fluorometer (Invitrogen, Eugene, OR, USA). Syntetisering av cdna Från det isolerade RNA:t syntetiserades cdna med hjälp av ett reaktionskit: Superscript III (Invitrogen, Carlsbad CA, USA). Till varje rör sattes 1μL 250ng/μL Random Primers, 1μL 10mM dntp mix och 3μL RNase/DNase fritt H 2 O. Därefter tillsattes 8μL RNA från varje prov till respektive rör. Rören värmdes i 65ºC i 5 min varefter de inkuberades på is i 1 min. Efter en kort centrifugering tillsattes 4μL 5X First-Strand Buffer, 1μL 0,1M DTT, 1μL 40units/μL RNase OUT och 1μL 200units/μL SuperScript III RT. Rören placerades sedan i en PCR-maskin som inkuberade rören i 5min vid 25ºC, i 45 min vid 50ºC samt slutligen i 15 min vid 70ºC. Mätning av cdna-koncentration Koncentrationen av det bildade cdna:t bestämdes med hjälp av en fluorescensbaserad metod: Quant-iT dsdna HS Assay Kit, (Invitrogen, Eugene OR, USA). Realtids-PCR Proven späddes inför analysen till 2ng/μL. Ett prov med hög cdna-koncentration användes för en standardkurva i PCR-reaktionen. En seriespädning 1:2 gjordes på provet från koncentrationen 4ng/μL till 0,0625ng/μL, vilket gav mängden 8 till 0,125ng cdna i standardbrunnarna på PCR-plattan. Samtliga spädningar gjordes i RNase/DNase fritt H 2 O. Till LIF fick även en standard med högre koncentration göras, från 8 till 0,125ng/μL, vilket gav mängden 16 till 0,25ng cdna i standardbrunnarna. Sedan fick även en kombinerad standard med 4 olika prover tillsammans göras, med samma högre koncentration. 2μL prov och 13μL mastermix sattes i varje brunn på en 96-håls PCR-platta. Prov och standard sattes som dubbelprover och negativ kontroll var RNase/DNase fritt H 2 O. Mastermixen innehöll SYBR Green Mix 7,5 μl/brunn, 5μM primermix med forward och reverse primer, 1,6μL/brunn och RNase/DNase fritt H 2 O 3,9μL/brunn. Amplifierat cdna detekterades med SYBR Green. Primers som användes var glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH), leukemia inhibitory factor (LIF), LIF-receptor (LIFR), glycoprotein 130 (gp130) och supressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). När proverna och mastermix blandats centrifugerades plattan i 2 min i 220xg. PCR utfördes i PCR, Real-Time PCR System, AB Applied Biosystems Step One Plus, (P/N: ). Maskinen programmerades för att inkubera plattan i 95ºC i 10 min. Sedan kördes 40 cykler, 95ºC i 15s och 60ºC i 1 min. Slutligen gjordes en smältkurva: vid 95ºC i 15 min, 60ºC i 1 min och 95ºC i 15 s, för att avslöja kontamination, om primers bundit fel eller andra artefakter [2]. Smältkurvorna visade att det inte var någon kontamination och att reaktionerna fungerat. Följande primers användes: GAPDH: forward 5 -GAA GGT GAA GGT CGG AGT CAA C- 3, reverse 5 -CAG AGT TAA AAG CAG CCC TGG T-3, LIF: forward 5 -TGA ACC AGA TCA GGA GCC AAC T-3, reverse 5 -CCA CAT AGC TTG TCC AGG TTG TT-3, LIFR:

6 forward 5 -GTG GCA GTG GCT GTC ATT GTT GGA GTG GT-3, reverse 5 -TCA TCT GCG GCT GGG TTT GGT ATT TCT TC-3, gp130: forward 5 -CTG TAT CAC AGA CTG GCA ACA AG-3, reverse 5 -GCA TTT GCT CTC TGC TAA GTT CC-3, SOCS1: forward 5 -GTG GCA GCC GAC AAT GCA GT-3, reverse 5 CGA GGC CAT CTT CAC GCT AAG G-3, Erα: forward 5 -CCA CCA ACC AGT GCA CCA TT-3, reverse 5 -GGT CTT TTC GTA TCC CAC CTT TC-3, Erβ: forward 5 -AGA GTC CCT GGT GTG AAG CAA- 3, reverse 5 -GAC AGC GCA GAA GTG AGC ATC-3, PRA+B: forward 5 -AGA GCA CTG GAT GCT GTT GCT-3, reverse 5 -TGG CTT AGG GCT TGG CTT T-3 och PRB: forward 5 -GAG GGG GCA GTG GAA CTC AG-3, reverse 5 -AGG GGA ACT GTG GCT GTC GT-3. Analyser utfördes genom Statistical Package for Social Science(SPSS v.18,0 för Macintosh SPSS Inc., Chicago IL). Skillnaderna mellan de som blev gravida samt de som inte blev det räknades ut med Oneway ANOVA. Signifikans accepterades vid p-värde 0,05. RESULTAT Bestämning av RNA med två olika metoder Medelvärdet för den gelbaserade metoden (Agilent RNA 6000 Pico Kit; Agilent technologies, Waldbronn, Tyskland) blev 0,030μg/μL och 0,18μg/μL för den fluorescensbaserade metoden (Quant it RNA Assay kit; Invitrogen, Eugene, OR, USA) i Qubit fluorometer (Invitrogen, Eugene, OR, USA). Utbyte av cdna-syntes Vid cdna-syntes omvandlades 15 % av RNA:t till cdna. RT-PCR data för ERα, Erβ, PRA+B och PRB mrna-nivåerna för icke-gravida respektive gravida kvinnor var för ERα 1,08 ± 0,53 resp. 1,75 ± 0,98 (p=0,024), PRA+B 0,49 ± 0,18 resp. 1,10 ± 1,05 (p=0,021) och PRB 0,75 ± 0,31 resp. 1,28 ± 0,81 (p=0,018). Det betyder att det var lägre nivåer för de som inte blivit gravida jämfört med dem som blivit det. Det var dock ingen signifikant skillnad för Erβ-mRNA:0,63 ± 0,64 resp. 0,98 ± 1,09 (p=0,27) (Figur 1). RT-PCR data för LIF, LIFR, gp130 och SOCS1 mrna-nivåerna för icke-gravida respektive gravida kvinnor var för LIF 0,40 ± 0,49 resp. 0,40 ± 0,53 (p=0,98), LIFR 0,86 ± 0,39 resp. 1,08 ± 0,45 (p=0,19), gp130 3,56 ± 2,96 resp. 3,25 ± 3,16 (p=0,79), SOCS1 2,74 ± 2,86 resp. 2,40 ± 1,22 (p=0,71). Det fanns således ingen signifikant skillnad mellan gruppen icke-gravida jämfört med gravida för LIF-mRNA, LIFRmRNA, gp130-mrna och SOCS1-mRNA (Figur 2).

7 A) B) C) D) Fig. 1. Relativ mängd mrna för östrogenreceptor α (A), östrogenreceptor β (B), progesteronreceptor A (C) och progesteronreceptor B (D) i humant endometrium från oförklarat infertila kvinnor genom realtids-pcr. En jämförelse mellan de kvinnor som inte blivit gravida (till vänster) och de kvinnor som blivit gravida (till höger). Det horisontella markerade strecket är medianvärdet, boxen visar spridningen percentilen. Det vertikala strecket är de värden inom 95 percentilen. Punkterna är outliners.

8 A) B) C) D) Fig. 2. Relativ mängd mrna för leukemia inhibitory factor (A), LIF receptor (B), gp130 (C), suppressor of cytokine signaling 1 (D) i humant endometrium från oförklarat infertila kvinnor genom realtids-pcr. En jämförelse mellan de kvinnor som inte blivit gravida (till vänster) och de kvinnor som blivit gravida (till höger). Det horisontella markerade strecket är medianvärdet, boxen visar spridningen percentilen. Det vertikala strecket är de värden inom 95 percentilen. Punkterna är outliners. DISKUSSION Våra mätningar av olika markörer i livmoderslemhinnan hos en grupp oförklarat infertila kvinnor, visade att det inte fanns någon signifikant skillnad för ERβ mellan de kvinnor som blivit gravida efter in vitro fertilisering och de som inte blivit det. ERβ uttrycks normalt svagt och på en jämn nivå i körtelepitelet under hela menstruationscykeln [13]. Uttrycket av östrogenreceptor alpha (ERα), progesteronreceptor A (PRA+B) och progesteronreceptor B (PRB) var signifikant högre hos de som blev gravida än hos de som inte blev det. Som nämndes i introduktionen måste receptorerna för steroidhormonerna östrogen och progesteron uttryckas för att dessa hormon ska kunna mediera sin effekt [13]. Att uttrycket av receptorerna hos de som inte lyckats bli gravida var lägre skulle kunna tyda på att livmoderslemhinnan inte växer till och differentierar på rätt sätt. Detta i sin tur skulle kunna leda till att mottagligheten för ett embryo blir lägre. Det har också föreslagits att uttrycket av pinopoder kan spela en viktig roll vid implantationen och att pinopodtillväxten regleras av progesteron. Om inte progesteron kan mediera sin effekt, kanske pinopoderna inte uttrycks som de ska [14]. För LIF, LIFR, gp130 och SOCS1 fann vi ingen signifikant skillnad mellan de kvinnor som blivit gravida och de som inte blivit det. Tidigare studier har visat att under sekretionsfasen är LIF mest uttryckt i körtlarna och det luminala epitelet. LIFR uttrycks framförallt i det

9 luminala epitelet medan gp130 uttrycks i både det luminala epitelet och körtelepitelet [15]. SOCS1 uttrycks i endometrieepitelcellerna [2]. Vårt resultat tyder på att LIF inte är lika viktigt för implantation för människor som för möss [8]. Vid koncentrationsmätningen av RNA sågs stora skillnader mellan den gel- och fluorescensbaserade metoden. En gelbaserad metod är svårare att hantera, för mycket prov som tillsätts i en brunn kan rinna över i brunnen bredvid, vilket kan ge fel värden. Det kan också bero på att ett pico kit användes istället för ett nano kit, så att nivåerna inte riktigt var anpassade för kitet. Skillnaden i koncentration före och efter cdna-syntes var också markant och kunskapen om att RNA är ytterst känsligt att hantera och lätt skadas och förstörs är allmänt känd. Det är möjligt att en stor del av RNA:t har skadats och att inte allt omvandlats komplett. Då RNA är väldigt känsligt är det viktigt att det hanteras på minsta möjliga skadliga sätt, vilket bland annat innebär nedfrysning och upptining i minsta möjliga mån. De två metoder som numera oftast används för att mäta genuttryck genom RNA är realtids- PCR (RT-PCR) och microarrays. Med RT-PCR kan man analysera ett mindre antal gener i många prover. Det är en robust metod med god reproducerbarhet. Med microarray kan man analysera tusentals gener och t.ex. jämföra två olika RNA populationer. De två populationerna märks in med olika fluoroforer, sätts till en platta med en ordnad serie av mikroskopiska prickar som alla innehåller olika prober. Därefter tvättas överskottet som inte fäst till någon probe bort. Det RNA som fäst till de olika proberna avger fluorescens i proportion till hur mycket som bundit [16]. Båda dessa tekniker är snabba, har hög produktionskapacitet och är till stor del automatiserade vilket underlättar och sparar tid [17]. I vår studie skulle många prover med få gener undersökas varför vi valde RT-PCR. Att det inte syntes några signifikanta skillnader på vissa av generna i vår studie skulle kunna bero på att vävnaden i biopsin var heterogen och innehöll en blandning av olika vävnadstyper och celler. Det kom exempelvis med mycket stroma som inte brukar visa något stort uttryck av de LIF-relaterade gener som eftersöktes i den här studien. Dessutom innehåller endometriet endotelceller runt kärl och leukocyter, vilka alla uttrycker olika mängd av generna. Detta visar att det endast är i vissa delar som dessa markörer uttrycks. För att avhjälpa denna brist skulle en mikrodissektion kunna vara till hjälp. Då görs tunna vävnadssnitt och ett intressant område, som bara innehåller en viss celltyp, markeras. Detta område skrapas sedan ur med en glasspets och de lösskrapade cellerna förs över till ett rör och en DNA-extraktion utförs. Därefter kan man gå vidare med en realtids PCR och mäta genuttrycket i en homogen cellblandning [18]. För att verifiera resultaten från RT-PCR, skulle proteinuttrycket kunna mätas med hjälp av immunohistokemi (IHC) eller western blot. I den här studien är det mest relevant att titta på uttrycket i vävnaden, varför IHC vore lämpligast. I RT-PCR metoden användes primers för GAPDH för att mäta och jämföra mängden RNA som tillsats från total-rna. GAPDH är en housekeeping gen som finns i kroppens alla celler i liknande nivåer. Att genen användes i metoden beror på att den kan användas för att mäta relativt uttryck av en viss gen och ge en bättre jämförelse mellan olika prover. Den gen som eftersöktes mättes i förhållande till GAPDH, vilket gjorde att prover med olika nivåer av RNA kunde mätas och jämföras. Att mäta och jämföra mängden RNA som tillsätts från total- RNA i varje reaktion är tidskrävande och kräver exakt kvantifiering av RNA, vilket försvåras av många felkällor. Housekeeping gener avhjälper detta genom att normalisera mellan proverna. En studie som jämfört olika housekeeping gener, visade att GAPDH inte är idealisk, då uttrycket påverkades av stressade celler eftersom GAPDH är involverat i andra funktioner förutom basal cellmetabolism. Risk för stressade celler finns hos gravida kvinnor

10 [19]. Då biopsierna var tagna under ungefär samma tidpunkt i cykeln och bestod av samma vävnad och ingen av kvinnorna var gravid vid provtagning valdes GAPDH. Vi har i denna studie av en grupp av oförklarat infertila kvinnor visat skillnader i genuttryck mellan kvinnor som lyckats, respektive inte lyckats, bli gravida efter in vitro fertilisering. mrna-uttrycket av ERα, PRA+B och PRB var alla högre hos de kvinnorna som blivit gravida. Detta visar att uttryck av steroidhormonreceptorer är viktigt för att det ska bli en graviditet. För LIF, LIFR, gp130 och SOCS1 syntes däremot ingen signifikant skillnad, vilket visar att dessa inte kan användas som markörer för att detektera ett receptivt endometrium. Dessa mätningar har gett vidare underlag i jakten på att hitta förklaringen till varför vissa kvinnor har svårare att bli gravida än andra. Förhoppningsvis kommer denna ledtråd tillsammans med många andra att leda till att metoder utvecklas som leder till att fler oförklarat infertila kvinnor kan bli gravida. Kunskap om genuttrycket skulle även kunna användas som prognostiska faktorer för att förutse om en kvinna skulle kunna bli gravid eller ej. ACKNOWLEDGEMENT Ett stort tack till Anneli Stavreus-Evers, Signe Altmäe och Theodora Kallak för deras otroliga engagemang, stöd och hjälp. REFERENSER [1] Kamel, RM Management of the infertile couple: an evidence-based protocol. Reproductive biology and endocrinology 8:21 [2] Aghajanova, L. Altmae, S. Bjursten, K. et al Disturbances in the LIF pathway in the endometrium among women with unexplained infertility. Fertility and sterility 91: [3] Giess, R. Tanasescu, I. Steck, T. et al Leukemia inhibitory factor gene mutations in infertile women. Molecular human reproduction 5:581-6 [4] Fazleabas, AT. Strakova, Z Endometrial function: cell specific changes in the uterine environment. Molecular and cellular endocrinology 186:143-7 [5] Bentin-Ley, U. Horn, T. Sjögren, A. et al Ultrastructure of human blastocystendometrial interactions in vitro. Journal of reproduction and fertility 120: [6] Kimber, SJ Leukemia inhibitory factor in implantation and uterine biology. Reproduction (Cambridge, England) 130: [7] Aghajanova, L. Stavreus-Evers, A. Nikas, Y. et al Coexpression of pinopodes and leukemia inhibitory factor, as well as its receptor, in human endometrium. Fertility and sterility 79: [8] Stewart, CL. Kaspar, P. Brunet, LJ. et al Blastocyst implantation depends on maternal expression of leukaemia inhibitory factor. Nature 359:76-9

11 [9] Lédée-Bataille, N. Laprée-Dalage, G. Taupin, JL. et al Concentration of leukemia inhibitory factor (LIF) in uterine flushing fluid is highly predictive of embryo implantation. Human reproduction (Oxford, England) 17:213-8 [10] Aghajanova, L Update on the role of leukemia inhibitory factor in assisted reproduction. Current opinion in obstetrics and gynecology Epub ahead of print [11] Duc-Goiran, P. Mignot, TM. Bourgeois, C. et al Embryo-maternal interactions at the implantation site: a delicate equilibrium. European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology 83: [12] Kabir-Salmani, M. Nikzad, H. Shiokawa, S. et al Secretory role for human uterodomes (pinopods): secretion of LIF. Molecular human reproduction 11:553-9 [13] Stavreus-Evers, A. Nikas, G. Sahlin, L. et al Formation of pinopodes in human endometrium is associated with the concentrations of progesterone and progesterone receptors. Fertility and sterility 76: [14] Achache, H. Revel, A Endometrial receptivity markers, the journey to successful embryo implantation. Human reproduction update 12: [15] Cullinan, EB. Abbondanzo, SJ. Anderson, PS. et al Leukemia inhibitory factor (LIF) and LIF receptor expression in human endometrium suggests a potential autocrine/paracrine function in regulating embryo implantation. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America 93: [16] Brown, PO. Botstein, D Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature genetics 21:33-7 [17] Vandesompole, J. De Preter, K. Pattyn, F. et al Accurate normalization of realtime quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome biolog 18:3 [18] Moskaluk, CA. Kern, CE Microdissection and polymerase chain reaction amplification of genomic DNA from histological tissue sections. The American journal of pathology 150: [19] Meller, M. Vadachkoria, S. Luthy, DA. et al Evaluation of housekeeping genes in placental comparative expression studies. Placenta 26:601-7