Inhibiting the IGF-1 receptor with the cyclolignan. Picropodophyllin: an in vitro study of ovulation, implantation and receptivity in a mouse model

Transkript

1 Inhibiting the IGF-1 receptor with the cyclolignan Picropodophyllin: an in vitro study of ovulation, implantation and receptivity in a mouse model Examensarbete Biomedicinsk laboratorievetenskap vårterminen 2008 Patrik Larsson Handledare: Anneli Stavreus-Evers PhD Institutionen för kvinnors och barns hälsa, Uppsala universitet, Universitetssjukhuset UAS, Uppsala

2 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 1(34) Innehållsförteckning ABSTRACT... 2 SAMMANFATTNING... 3 INTRODUKTION... 4 MATERIAL OCH METOD... 8 Behandlingsdagar... 8 Autopsi... 8 RNA-EXTRAKTION KONCENTRATIONSBESTÄMNING AV TOTALRNA SYNTETISERING AV CDNA KONTROLL AV PRIMERS MED PCR, CDNA KONTROLL AV PRIMERS MED AGILENT, CDNA SANNTIDS- PCR RESULTAT RNA EXTRAKTION KONCENTRATIONSBESTÄMNING AV TOTALRNA KONTROLL AV PRIMERS MED PCR, CDNA KONTROLL AV PRIMERS MED AGILENT, CDNA SANNTIDS- PCR DISKUSSION ACKNOWLEDGEMENT REFERENSER... 31

3 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 2(34) ABSTRACT Picropodophyllin (PPP) is an analogue of the anti tumour lignan podophyllotoxin with the unique ability to selectively inhibit the receptor of Insulin like growth factor 1(IGF-1). IGF-1 is believed to play an important part in development of the endometrium facing implantation. With PPP treated mice, studies can be made to measure gene expression from tissue of both treated and untreated mice to compare the role of IGF-1 regarding ovulation, implantation and receptivity. The aim of this study was to analyze gene expression of some steroid hormone receptors and cytokines in ovaries from mice treated with PPP. In this study, seven mice were treated with PPP at different times and tissue was collected. PCR-primers for cdna sequences of estrogene receptor α, estrogene receptor β, progesterone receptor A, progesterone receptor B, growth hormone receptor, interleukin 1 α, interleukin 1 β, tumour necrosis factor α and androgen receptor were used. Real Time PCR was run with the samples and gene expression was measured. The results of this study showed that the inhibition of IGF-1 receptor interacted with IGF-1 which lead to altered levels of estrogene receptor alpha, progesterone receptor, growth hormone receptor and androgen receptor that can decrease ovulation. The results also showed the differences in gene products between treated and untreated samples, suggesting that IGF-1 plays an important role regarding ovulation. KEYWORDS: Growth factors, secretory proteins, Real Time PCR, Ovary, Uterus

4 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 3(34) Sammanfattning Studier med hjälp av den selektiva insulinlika tillväxtfaktor 1 receptorn (IGF-1R) antagonisten; picropodof?phyllin (PPP), hur samspelet mellan livmoderslemhinnan och implantationsprocessen, samt hur ovulationen påverkas av insulinlika tillväxtfaktorn 1 (IGF- 1) kan nu utföras. IGF-1 tros ha en viktig roll för den reproduktiva processen, där den påverkar ovulation, implantation och embryoutveckling. IGF-familjen består av tre ligander; insulin, IGF-1 och IGF-2. IGF transporteras bundet till bindarprotein (IGFBP). Medlemmarna i IGF receptorfamiljen kan binda IGF-1, IGF-2 och insulin fast med olika affinitet. PPP som är en cykloligan, är en analog från podofyllotoxin och fungerar som en syntetisk IGF-1 receptorantagonist, som selektivt inhiberar receptorns aktivitet. PPP tros även kunna nedreglera genexpression av receptorn. Tre tidigare projektarbeten har utförts på vävnader från möss injicerade med PPP. Tyngdpunkterna i dessa arbeten har legat på immunhistokemiska studier av IGF-1 i reproduktionsorgan från möss, uttryck av IGF-1, dess receptor och bindarprotein 1 i ovarier och uterus efter behandling med PPP. I denna studie användes vävnad samt cdna från sju möss behandlade med PPP, i olika stadier av reproduktionen samt även icke behandlade möss. Studiens syfte var att med sanntids-pcr jämföra genuttryck från östrogenreceptor α och β, progesteronreceptor A och B, tillväxthormonreceptor, Interleukin 1 α och β, tumor necrosis faktor α samt androgenreceptor i vävnad från PPP-behandlade och obehandlade möss och genom de erhållna resultaten från ovarievävnaden utläsa effekten på ovulationen och från uterusvävnaden effekten på implantation och receptivitet. Studieresultaten visade att IGF-1s frånvaro gav förändrade nivåer av genprodukter, som medförde minskad ovulationen. Studien visade att IGF-1s roll vid ovulationen var väsentlig.

5 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 4(34) Introduktion Podofhyllotoxin är en naturligt förkommande ligan som kan extraheras från olika växter, bland annat från Podophyllum, Linum, Juniperus (1). Liganer är fytoöstrogener, vilka är östrogenlika kemikalier som även fungerar som antioxidanter. Just podofyllotoxin är grunden till cancerläkemedlet etoposid. På grund av podofyllotoxins starka toxicitet och kraftiga bieffekter, är det främst etoposid och teniposid som används inom cancervården. Många steg krävs för den kemiska syntesen när etoposid framställs ur podofyllotoxin och i försök att förenkla framställningen har mikroorganismer använts. I samband med dessa försök har man funnit att biotransformation kan ske av podofyllotoxin till picropodof(ph)yllin (PPP) med hjälp av mögelsvamparna: Penicillium melini, Syncephalastrum racemosum och Cunninghamella elegans (1). Cycloliganen PPP är en analog från podofyllotoxin. Den kemiska framställningen av PPP sker med baskatalyserad epimerisering av 4-amino-4-deoxypodofyllotoxin, som ger den cissammansatta laktonen, PPP (2). Insulinlik tillväxtfaktor 1 (IGF-1) är en tillväxtfaktor, men dess närvaro i människokroppen är inte livsnödvändig. I samband med cancer ses ofta en förhöjd nivå av IGF-1, eftersom IGF-1 regleras av tillväxthormon (GH). Med höjda nivåer GH ökas proteinsyntesens hastighet, samt även celltillväxt och replikation. IGF-familjen består av tre ligander; insulin, IGF-1och IGF-2. Receptorer inom IGF-receptorfamiljen kan alla binda IGF- 1, IGF-2 och insulin fast med olika affinitet. Transporten i cirkulationen av IGF sker bundet till insulinlik tillväxtfaktorbindarprotein (IGFBP). PPP som är en selektiv IGF-1-receptor(IGF-1R)hämmare, är just nu högaktuell inom cancerforskningen. De egenskaper som gjort PPP intressant, är att den som första substans

6 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 5(34) kan hämma IGF-1s verkan på cellerna, utan att insulinets effekt på cellerna påverkas. En av de roller IGF-1 har vid cancer, har visats vara att hindra cellerna från att genomgå apoptos. Detta sker genom att cytokrom c-frisättning förhindras, via aktivering av PI3K/Akt-kaskaden. Forskning kring PPPs inhibering av IGF-1Rs tyrosinkinasaktivitet och förutspådda sänkning av Akt-fosforylering efter PPP-behandling, samt underbyggande att PPP inte är en ATPhämmare, har utförts. Av de 15 tyrosiner som betasubenheten av IGF-1R totalt innehåller, utfördes studien på de 3 relevantaste; Y1131, Y1135 och Y1136. Resultaten visar att fosforyleringen endast uteblev på Y1136 vid PPP-behandling. Fosforyleringen av de övriga tyrosinerna förblev oförändrad. Data från studien tyder på att fosforyleringen av Y1136 är avgörande för aktiveringen fosfoinositid-3-kinas (PI3K)/serin/treonin-kinas(Akt)kaskaden (3). De huvudsakliga effekterna som noterats vid forskning i samband med cancer/tumörbehandling med PPP är att tumörerna har minskat i storlek genom apoptos. Genom att PPP är en selektiv IGF-1R-hämmare har uppkomsten av bieffekter, som diabeteslika sjukdomar, diabeteskoma och död undvikits. Vissa positiva effekter är även noterade gällande inhibering av angiogenes och bensjukdomar (4, 5). För att ytterligare klargöra processen då PPP används, kan en förklaring av IGF-1Rs betydelse erfordras. IGF-1R består av 2 alfasubenheter, som står för ligandbindning och 2 betasubenheter med en transmembrandomän: En intracellulär tyrosinkinasdomän och en COOH-terminaldomän (6). Då IGF-1 binder till IGF-1R fosforyleras tyrosinresterna i kinasdomänen och aktivering sker. Den fosforylering som sker av tyrosin 1136 stabiliserar receptorkonformationen. Efter autofosforylering, då kinaset katalyserar sin egen fosforylering, fosforylerar receptorkinaset andra signalmolekyler, som insulinreceptorsubstrat 1-4 (IRS1-4) och Shc, som är ett adaptorprotein. Genom denna process sker aktivering av fosfatidylinositol-3(pip3)-kinas och mitogenaktiverade proteinkinas-signalerande kaskader (7).

7 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 6(34) Studier utförda på babian visar att IGF-1R lokaliseras till membran på körtelepitelceller i endometriet under menstruationscykeln, vid tidig graviditet och i deciduala stromaceller. Dessa bildar en genomtränglig barriär under implantationen, och i trofoblastmembran under tidig och sen graviditet. Genuttrycket i körtlar är som högst under den proliferativa och tidiga luteala fasen under menstruationscykeln, medan genuttryck för decidua- och trofoblaster var tydlig vid platsen för implantation dag 18 och vid graviditet. IGF stimulerar mitosen hos körtelepitelet under follikelstadiet. Under lutealfasen sker en minskning av IGF-1R, vilket kan sammankopplas med en minskning av sekretorisk körtelaktivitet och en ökning av sekretorisk aktivitet från IGFBP-1 (8). Ovarierna har till uppgift att härbärga och förse oocyterna med näring, samt utsöndra hormoner som leder till mognad av folliklar och utvecklingen av könskarakteristika. Folliklarnas utveckling styrs även av menstruationscykeln som består av en follikulär fas och en luteal fas, åtskilda av ovulation. Under den follikulära fasen ökar nivåerna av follikelstimulerande hormon (FSH). Då folliklarna stimuleras av FSH, producerar dessa ökade mängder östrogen. Då folliklarna istället stimuleras av luteniserande hormon (LH), ökar syntesen av progesteron. GH som huvudsakligen syntetiseras i hypofysen, kan även syntetiseras lokalt i ovarierna. En ökad mängd GH leder till stimulerad tillväxt av folliklar och minskad apoptos i folliklarna. IGF i ökade mängder har setts öka tidiga folliklars överlevnad. I IGF knockout möss har infertilitet noterats, på grund av utebliven mognadsutveckling av folliklarna och avsaknad av ovulation. I denna studie undersöktes genuttrycket i vävnad från sedan tidigare PPP-behandlade möss. Tillstånd att utföra försöket på möss har beviljats tidigare av Stockholms Norra djurförsöksetiska nämnd (N 575/03). De använda mössen av stammen NMRI var uppdelade i olika studiegrupper, med olika behandling och olika dagar för avlivning. Behandlingen med PPP skedde 3-6 dagar före eller en dag före och samma dag som parning ägde rum. Mössen

8 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 7(34) avlivades dag 4 eller 9 efter det att parningen ägt rum. De lösningsmedelsbehandlade mössen fick enbart propylenglykol. Uttryck från följande gener söktes; Androgenreceptor (AR) som aktiveras genom inbindning av testosteron eller dihydrotestosteron och reglerar genexpression, tillväxthormonreceptor (GHR), där GHR genen kodar för ett protein som är en transmembranreceptor för GH, progesteronreceptor A (PRA) och progesteronreceptor B (PRB), där PRA och PRB är intracellulära steroidreceptorer som specifikt binder in progesteron. De två huvudformerna skiljer i molekylvikt. Desuutom undersöktes östrogenreceptor α (ERα) och östrogenreceptor β (ERβ). Både ERα och ERβ är medlemmar av the nuclear hormone familjen av intracellulära receptorer som aktiveras av hormonet 17β-östradiol. Huvudfunktionen för ER är att reglerera genexpression. ERα uttrycks främst i uterus och ERβ uttrycks främst i ovarierna. Interleukin 1 α (IL1α) och interleukin 1 β (IL1β) är proinflammatoriska cytokiner inblandade i immunförsvaret mot infektioner och har typ 1, transmembranreceptorer. Dessa undersöktes tillsammans med Tumour necrosis factor α (TNF α), som även den är en cytokin. β-actin uttrycks i all vävnad och är en housekeeping gene och därför passande att använda som endogen kontroll. Genuttrycket av housekeeping genes påverkas ibland av utförd behandling AR, PR och ER tillhör samma familj av transkriptionsfaktorer. De är uppbyggda på samma sätt med ligandbindande domän och DNA-bindande domän och reglerande domäner. Hormonerna produceras i ovarierna, men receptorerna uttrycks inte alltid där. Mätningar av genuttrycket utfördes på den sedan tidigare nedfrusna vävnaden. Teknikerna som användes innefattade RNA-extraktion, syntetisering av cdna och sanntids-pcr, där provvärdena jämfördes mot värden från standardkurvor.

9 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 8(34) Syftet med denna studie var att utröna huruvida förändrade genproduktsnivåer inducerade av PPP förekommer och i så fall vilka effekter dessa har på ovulationen då oocyten släpper från ovarierna. Dessutom undersöktes effekterna på implantationen då det befruktade ägget fäster in och tränger ned i livmoderslemhinnan och effekterna på receptiviteten då endometriet är mottagligt att ta emot det befruktade ägget. MATERIAL OCH METOD Material: Provmaterial Uterus och ovarievävnad från möss sedan tidigare behandlade med PPP i olika stadier av reproduktionen och icke behandlade möss användes, se tabell 1. Tabell1: Använda studiegrupper med antal djur, organ och behandling i de olika grupperna. Studiegrupp Organ Studiesyfte Behandling Autopsi Behandlingsdagar efter (antal) dagar PPP 7 (1-4) Ovarier Kontroll Ingen 4 PPP 4 (1-6) Ovarier Ovulation PPP PPP 4 (7-12) Ovarier Ovulation Lösn.medel PPP 4 (A-H) Ovarier Ovulation PPP PPP 5 (x-x) Ovarier Ovulation Okänd PPP 2 (1-6) Uterus Implantation Lösn.medel PPP 2 (7-12) Uterus Implantation PPP PPP 6 (1-6) Uterus Endometrie rec Lösn.medel PPP 6 (7-12) Uterus Endometrie rec PPP

10 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 9(34) Vävnad förvarad i RNAlater (Qiagen, Hilden, Germany) lösning -70 och -130C frys, i uppmärkta rör. Olika kit användes. Till RNA-extraktionen användes RNeasy mini kit (Qiagen). Till syntetiserandet av cdna från RNA användes SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, USA). För kontroll av RNA-koncentration användes Agilent RNA 6000 Pico LabChip Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Till primerkontroll på DNA användes Agilent 1000 DNA assay (Agilent Technologies). Primers beställda från CyberGene (CyberGene, Stockholm, Sweden) användes, se tabell2. Tabell2: Använda primers och respektive sekvenser. Primer β-actin forward mouse β-actin reverse mouse AR forward mouse AR reverse mouse ER-α forward mouse ER-α reverse mouse ER-β forward mouse ER-β reverse mouse GHR forward mouse GHR reverse mouse IL1α forward mouse IL1α reverse mouse IL1β forward mouse IL1β reverse mouse PR forward mouse PR reverse mouse TNFα forward mouse TNFα reverse mouse Sekvens ACGGCCAGGTCATCACTATTG CCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA CAGCAGAAACGATTGTACCATTG GCTTACGAGCTCCCAGAGTCA CTACTACATACCCCCGGAAGCA CAGGGATTCTCAGAACCTTTCG TATGAGTGCATTGTCGCTGTCTT CAACTCCCAGCAACCACATG CAAAAATGTTTCACTGTTGACGAAA CGAATCCCGGTCAAACTAATGT TCCTCTAGAGCTCCATGCTACAGA TGATGAAAGGGCTCCCAAGT CTACAGGCTCCGAGATGAACAAC TCCATTGAGGTGGAGAGCTTTC GCAGGGCATGACAACACAAA TGTCTCTCGCCTAGTTGGTTGA GGCAGGTTCTGTCCCTTTCA CTGTGCTCATGGTGTCTTTTCTG

11 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 10(34) Apparatur Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), är en chipbaserad plattform, som på 30 minuter kan leverera data för DNA, RNA eller proteiner. Agilent 2100 Bioanalyzer användes för att koncentrationsbestämma det utvunna RNAt, kontrollera DNA-produkten efter PCRamplifiering. För att tolka erhållna data användes det tillhörande programmet 2100 expert. För vortexning av Agilentchipen användes IKA vortex MS-1 (IKA Werke, Staufen, Germany) StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, USA) 48 brunnars system användes för att amplifiera cdna och kvantitativt mäta genuttryck. För primerdesign användes mjukvaran Primer Express Software Version 3.0. Till StepOne PCR användes programmet StepOne ver2.0 för datainsamling och för att analysera datat. För vanlig PCR till primertest, amplifiering av DNA och som inkubator då cdna skapades användes Applied biosystems 2720 thermal cycler (Applied Biosystems). Vid RNA-extraktionen då RNeasy mini kit (Qiagen) användes, skedde sönderdelnings och homogeniseringssteget med en rotor-stator homogenisator. Metod RNA-extraktion För RNA-extraktion från vävnad användes RNeasy mini kit. Det medföljande protokollet följdes. Först kontrollvägdes vävnadsbitarna så att de understeg 30mg. Därefter homogeniserades preparatet med en rotor-stator homogenisator. Sönderdelningen och homogeniseringen utfördes i ett flatbottnat eppendorfrör innehållande 600µl RNeasy Lysis (RLT) buffert, där β-mercaptoetanol var tillsatt. Lysatet centrifugerades under 3 minuter vid maxhastighet. 1 del 70% etanol tillsattes till supernatanten och mixades. 600µl lösning fördes över till RNeasy spinfiltret placerat i ett 2ml samlingsrör och centrifugerades i 15 sekunder vid minst 8000 x g och uppsamlad vätska slängdes. Ytterligare 600µl lösning fördes över och

12 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 11(34) samma procedur utfördes igen. För att rengöra spinnfiltrets membran tillsattes 700µl RW1 buffert och detta centrifugerades i 15 sekunder vid minst 8000 x g och uppsamlad vätska slängdes. För att ytterligare rengöra spinnfiltrets membran tillsattes 500µl RPE-buffert till spinfiltret följt av centrifugering i 15 sekunder vid minst 8000 x g och uppsamlad vätska slängdes. Till en sista rengöring av spinnfitrets membran tillsattes 500µl RPE-buffert till spinfiltret och detta centrifugerades i 2 minuter vid minst 8000 x g. Uppsamlingsröret och uppsamlad vätska slängdes. Nytt 1,5ml uppsamlingsrör applicerades och 50µl Rnase-fritt vatten tillsattes till spinnfiltrets membran. En sista centrifugering utfördes i 1 minut vid minst 8000 x g för att eluera totalrna. Uppsamlingsröret med totalrna sparades i -20C. Koncentrationsbestämning av totalrna Koncentrationen av det erhållna totalrnat kontrollerades i Agilent 2100 Bioanalyzer. Mätnivån var pg/µl. Det RNA 6000 Pico LabChip Kit som användes var speciellt utvecklat för analys av RNA-fragment. Varje RNA-Pico chip innehöll ett antal sammankopplade mikrokanaler som användes för att separera nukleinsyrafragment baserat på deras storlek via elektrofores. Koncentrationsmätningen inleddes med att gelen för chipet iordningsställdes. 550µl RNA 6000 Pico gel matrix pipetterades över till ett spinnfilter och centrifugerades i 10 minuter vid 1500 x g. Aliquotering skedde, där 65µl filtrerad gel fördes över till 0,5ml RNase fritt mikrofugrör. RNA 6000 Pico gel dye koncentrat vortexades i 10 sekunder och centrifugerades ned, innan 1µl tillsattes till röret innehållande 65µl filtrerad gel. Blandningen vortexades och centrifugerades sedan i 10 minuter vid x g. Ett nytt chip placerades i primingstationen som ställts in för RNA. 9µl gel dye mix pipetterades till brunnen märkt G. Primingstationen fälldes ned och sprutan trycktes ned från 1ml till stängt läge, där den hölls fast i 30 sekunder. Sprutan lösgjordes och efter 5 sekunder drogs den upp till 1 ml positionen igen. 9µl gel dye mix tillsattes till de 2 övriga brunnarna märkta G. 9µl RNA 6000 Pico Conditioning Solution (CS) tillsattes till brunnen märkt CS. 5µl RNA 6000

13 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 12(34) Pico marker tillsattes till alla provbrunnar och brunnen märkt med stegsymbol. 1µl av stegmarkören laddades i brunnen märkt med stegsymbol och de 11 provbrunnarna laddades 1µl av vardera prov. Det färdigpreparerade chipet placerades i IKA-vortexern och vortexades i 1 minut vid 2000 varv/ minut. Chipet placerades i Agilent 2100 Bioanalyzer och kördes. Resultaten presenterades dels som elektroforesband och dels som elektroferogram. Syntetisering av cdna Av det koncentrationsbestämda total-rnat skapades cdna att användas som grund för amplifiering i PCR, genom att SuperScript III Reverse Transcriptase användes. RNA späddes till koncentrationen 1µg/µl. RNAt grundspäddes med Rnase-fritt vatten 1:100. Mängd spädd RNA samt H 2 O för att uppnå maxmängden 11µl räknades ut. Till den slutliga reaktionsvolym 20µl, kunde totalrna av mängden 10pg-5µg/µl användas. Till nukleasfria rör tillsattes 1µl random primers (50-250ng), 1µl 10mM dntp-mix och den uträknade mängden totalrna och RNase fritt H 2 O. Blandningen värmdes till 65C i 5 minuter och inkuberades sedan på is i 1 minut. Rören centrifugerades i 15 sekunder vid 8000 x g. 4µl 5X First strand buffert, 1µl 0,1M ditiotreitol (DTT), 1µl RNase OUT (40 units/µl) och 1µl Superscript III RT (200 units/µl) tillsattes. Mixning skedde genom försiktig pipettering. Inkubering utfördes vid 25C i 5 minuter, sedan vid 50C i 45 minuter. Sist inaktiverades reaktionen genom uppvärmning till 70C i 15 minuter. Kontroll av primers med PCR, cdna För kontroll av primerspecificiteten kördes PCR på alla primers. Teoretiska data för respektive primer användes som utgångstemperatur för fastställande av annealingtemperatur. För alla primers användes PCR-programmet 95C i 5 minuter, 95C i 30 sekunder (34 cykler), xxc (beroende på primer) i 30 sekunder (34 cykler), 72C i 30 sekunder (34 cykler) och 72C i 10 minuter. Körningen startade med att 1ml av alla primers späddes till 10µM. Mix

14 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 13(34) tillblandades med 1,5µl 10X Buffert, 1,5µl MgCl 2 (25mM), 1,5µl dntp mix (2mM), 0,16µl Taq enzyme (5U/µl), 0,6µl Forward primer (10µM), 0,6µl Reverse primer (10µM), 1µl cdna (1µg/µl) och 8,14µl milliq H 2 O till en slutlig volym av 15µl. Kontroll av primers med AGILENT, cdna För att kontrollera hur väl primerna fungerat i PCR körningen så testades PCR-produkterna i Agilent 2100 Bioanalyzer. DNA 1000 Chip Kit som användes var speciellt utvecklat för DNA analys. Primerkontrollen inleddes med att gelen (G) för chipet iordningsställdes. De ingående produkterna ställdes i rumstemperatur i 30 minuter innan 25µl DNA dye koncentrat pipetterades över till rör innehållande gel matrix. Detta vortexades och centrifugerades ned innan blandningen fördes över till ett spinnfilter och centrifugerades i 15 minuter vid 2240 x g. Ett nytt DNA-chip placerades i den för DNA anpassade primingstationen. 9µl gel dye mix fördes över till brunnen markerad G och sprutan trycktes ned från 1ml till stängt läge, där den hölls fast i 1 minut. Sprutan lösgjordes och drogs efter 5 sekunder upp till 1ml positionen. 9µl gel dye mix pipetterades i de två övriga brunnarna markerade med G. 5µl marker pipetterades till alla provbrunnarna och till brunnen märkt med stegsymbol. 1µl stegmarkör tillsattes till stegbrunnen och 1µl prov tillsattes i varje provbrunn. Det färdigpreparerade chipet placerades i IKA-vortexern och vortexades i 1 minut vid 2400 varv/ minut. Chipet placerades i Agilent 2100 Bioanalyzer och kördes. Resultaten presenterades dels som elektroforesband och i diagram kallade elektroferogram. Sanntids- PCR För att kontrollera genuttryck kördes singleplex sanntids-pcr med SYBRgreen reagens. Först kördes normalprover för att producera en standardkurva. Som normalprov till standardkurvan användes cdna av koncentrationen 4,0ng/µl. Spädningar av standardprov 1:2 gjordes i 5 steg av cdna och till varje spädning tillsattes 0,6µl primer med optimerad

15 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 14(34) startkoncentration. Alla prover analyserades i duplikat. Samma procedur utfördes med alla primerparen. Mall med beskrivning av varje brunns innehåll i 48 hålsplatta producerades i StepOne (TM) programvaran. Parametrar beträffande startkvantiteten räknades ut till 6,0ng och skrevs in. Final primer koncentration beräknades också, anpassad till vald startkoncentration, och skrevs in. 48-hålsplattor laddades i StepOne Real time PCR-maskinen och kördes. För varje körning användes 2 brunnar per primerpar till negativ kontroll, där vatten tillsattes istället för cdna. Som referensprov kontroll användes obehandlat provmaterial från PPP 2:3. Som endogen kontroll användes β-actin. För test av provmaterialet kördes 1,5µl prov och 2x0,6µl primer med respektive prov i dubblerade uppsättningar. Vid varje körning, analyserades även β-actin för att kontrollera förekomsten av genuttryck i alla testade prover. 2 brunnar per primerpar kördes även som negativ kontroll. RESULTAT RNA extraktion Koncentrationsbestämning av totalrna Koncentrationen för respektive prov, grundspädda 1:100: PPP4:1 394pg/µl, PPP4:2 9628pg/µl, PPP4:3 1678pg/µl, PPP4: pg/µl, PPP4:6 7322pg/µl, PPP4:7 1115pg/µl, PPP4:8 6831pg/µl, PPP4:9 754pg/µl, PPP4: pg/µl, PPP4: pg/µl, PPP4:12 452pg/µl, PPP4:A 13883pg/µl, PPP4:B 3310pg/µl, PPP4:C 11044pg/µl, PPP4:D 2391pg/µl, PPP4:E 9940pg/µl, PPP4:G 10762pg/µl, PPP4:H 6815pg/µl, PPP7:1 97pg/µl, PPP7:2 4849pg/µl, PPP7:3 7779pg/µl, PPP7:4 1936pg/µl. Resultaten presenterades i Agilent 2100 Bioanalyzer enligt figur 1,2 och 3.

16 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 15(34) Figur 1: Resultatpresentation av koncentration för PPP4:1 till PPP4:12 från Agilent. Figur 2: Resultatpresentation av koncentration för PPP4:A till PPP4:H från Agilent.

17 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 16(34) Figur 3: Resultatpresentation av koncentration för PPP7:1 till PPP7:4 från Agilent. Kontroll av primers med PCR, cdna Annealingtemperaturer från 55 till 60C studerades. Alla primrar gav distinkta band vid 58C, vilken valdes för samtliga primers. Kontroll av primers med AGILENT, cdna Erhållna amplikonstorlekar för respektive primer: β-actin 81bp, teoretiska värdet 72bp, AR 106bp, teoretiska värdet 104bp, ERα 93bp, teoretiska värdet 84bp, ERβ 103bp, teoretiska värdet 95bp, GHR 99bp, teoretiska värdet 92bp, IL1α 90bp, teoretiska värdet 90bp, IL1β 90bp, teoretiska värdet 79bp, PR 82bp, teoretiska värdet 74bp, TNFα 82bp, teoretiska värdet 73bp.. Resultaten presenterades i Agilent 2100 Bioanalyzer enligt figur 4 och 5.

18 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 17(34) Figur 4: Resultatpresentation av koncentration för ERβ, PR, β-actin, IL1α, TNFα och AR från Agilent. Figur 5: Resultatpresentation av koncentration för ERα, GHR och IL1β från Agilent.

19 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 18(34) Sanntids- PCR De optimerade valda startkoncentrationerna respektive finalprimer koncentrationerna för de olika primerna var; ERα 1,5µM och 60nM, ERβ 1,0µM och 40nM, PR 1,0µM och 40nM, β- actin 0,75µM och 30nM, GHR 1,5µM och 60nM, IL1α 1,5µM och 60nM, IL1β 1,0µM och 40nM, TNFα 1,0µM och 40nM, AR 1,5µM och 60nM. Standardkurvor, med de nya primrarna gav värden, som efter viss justering av primerstartkoncentration och final primerkoncentration gav CT-värden inom intervallet utan att primerdimers med dubbla smältkurvor uppstod. Exempel från standardkurvskörningarna visas i figur 6 och 7. Figur 6: Resultatpresentation av standardkurva för β-actin från sanntids-pcr körning med StepOne Bioanalyser. Presenterade värden: slope: Y-Intercept: R²:0.986

20 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 19(34) Figur 7: Resultatpresentation av standardkurva för AR från sanntids-pcr körning med StepOne Bioanalyser. Presenterade värden: slope: Y-Intercept: R²:0.955 Utbredningen av de erhållna värdena från körning av prov PPP4 och PPP7, extrapolerade mot värdena från standardkurvorna visas i figurerna 8 till 12. Värdena från de PPPbehandlade proverna är benämnda PPP4 beh1 och PPP4 beh4. De obehandlade proverna är benämnda PPP4 obeh och PPP7.

21 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 20(34) ER-a standard m ed provvärdeplottar threshol cycle (CT) ,01 0, kvantitet ng/µl R 2 = 0,901 Figur 8: Resultatpresentation för ERα från sanntids-pcr körning med StepOne Bioanalyser. Presenterade värden: ER-a PPP4 beh4 PPP4 obeh PPP4 beh1 PPP7 SD ER-a ER-b standard med provvärdeplottar threshol cycle (CT) , kvantitet ng/µl R 2 = 0,8712 Figur 9: Resultatpresentation för ERβ från sanntids-pcr körning med StepOne Bioanalyser. Presenterade värden: ER-b PPP4 beh4 PPP4 obeh PPP4 beh1 PPP7 Logg. (ER-b)

22 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 21(34) PR standard m ed provvärdeplottar threshol cycle (CT) ,01 0, kvantitet ng/µl R 2 = 0,8266 Figur 10: Resultatpresentation för PR från sanntids-pcr körning med StepOne Bioanalyser. Presenterade värden: PR PPP4 beh4 PPP4 obeh PPP4 beh1 PPP7 PR AR standard med provvärdeplottar threshol cycle (C T) ,01 0, kvantitet ng/µl R 2 = 0,9547 Figur 11: Resultatpresentation för AR från sanntids-pcr körning med StepOne Bioanalyser. Presenterade värden: AR PPP4 beh4 PPP4 obeh PPP4 beh1 PPP7 Logg. (AR)

23 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 22(34) GHR standard m ed provvärdeplottar threshol cycle (CT) , R 2 = 0,6065 kvantitet ng/µl Figur 12: Resultatpresentation för GHR från sanntids-pcr körning med StepOne Bioanalyser. Presenterade värden: GHR PPP4 beh PPP4 obeh PPP4 behx PPP7 Logg. (GHR) Icke parametriska statistiskt bearbetade resultat visas i boxplotfigurerna 13 till 17. Avgränsningen i boxarna visar medianvärdet. Hälften av värdena var större, tredje kvartilen (Q3) och hälften var mindre, första kvartilen (Q1) än medianvärdet i boxarna. 50% av värdena redovisas i boxarna. Uppåtgående linjen visar största observationsvärdet. Den plottade punkten visar en mild outlier, där observationen ligger utanför inner fences (Q3 * 1,5 kvartilavståndet) och anger en avvikande observation. I samtliga diagram visar första boxen PPP7. Andra boxen visar PPP4 beh1. Tredje boxen visar PPP4 obeh och fjärde boxen visar PPP4 beh4. Y-axlarna visar kvantiteten amplifierat DNA i enheten ng/µl.

24 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 23(34) 60 ERα Figur 13: ERα. Presenterade värden: PPP7, PPP4 beh1, PPP4 obeh, PPP4 beh4. ERβ Figur 14: ERβ. Presenterade värden: PPP7, PPP4 beh1, PPP4 obeh, PPP4 beh4.

25 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 24(34) 1000 PR Figur 15: PR. Presenterade värden: PPP7, PPP4 beh1, PPP4 obeh, PPP4 beh4. Statistiskt signifikant värde. PPP4 beh4 är statistiskt skilt från PPP7. AR Figur 16: AR. Presenterade värden: PPP7, PPP4 beh1, PPP4 obeh, PPP4 beh4.

26 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 25(34) 3,5 GHR 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Figur 17: GHR. Presenterade värden: PPP7, PPP4 beh1, PPP4 obeh, PPP4 beh4. DISKUSSION Vid RNA-extraktionen uppenbarade sig inga hinder. RNA-koncentrationsmätningarna gav heller inga bekymmer. Skapandet av cdna från total RNA gick planenligt. Vid PCRkörningen då primrarna skulle kontrolleras fick omkörningar göras ett antal gånger för att justera primrarnas annealingtemperaturer. För att åstadkomma några gelelektroforesbandresultat överhuvudtaget och även specifikare inbindning av primrarna med tydligare band och mindre bakgrundsbrus än de ursprungligt valda temperaturerna, behölls i ett första skede endast 4 av 10 temperaturer. Dock fick dessa tester göras om helt, då de från början valda primerna ersattes med nya primers. Detta berodde på att det vid PCR och AGILENT körningarna för att kontrollera det amplifierade DNA:t, erhölls resultat från respektive primers amplikonlängd, som inte stämde överens med den förväntade storleken. BLAST-sökningen på NCBI:s hemsida gav få träffar. Primrarnas forward- och

27 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 26(34) reversesekvenser användes för upprepade sökningar med inriktning på musgenomet, dock med klent resultat. Vid standardkurvskörningarna med sanntids-pcr, framkom att de ursprungliga primrarna som användes i försöket, vilka var tagna ur publicerade artiklar, inte överensstämde gällande amplikonlängder. Vissa av de ursprungliga primrarna var ej avsedda för sanntids-pcr. För att överbrygga dessa hinder lades stor vikt vid att optimera reagensmixens sammansättning. Även arbetssätt vid laddning av plattorna justerades, för att förhindra uppkomsten av bubblor, vilka kunde leda till felaktiga resultat vid plattavläsningen. Resultaten av optimeringsförsöken var fruktlösa och de ursprungliga primrarna övergavs till förmån för primrar som designades med primerdesignmjukvara. De nya primrarnas specificitet testades med matchning mot musgenomet. Med de nya primrarna erhölls bättre amplikonvärden och skarpare gelelektroforesband. Koncentrationsoptimeringar gjordes för att standardkurvorna skulle ge acceptabla värden med R 2- värde nära 1,0 och slopevärde nära -3,3. Trots detta gav IL1β, GHR och TNFα standardkurvsvärden som föll utanför godkännanderamen. ERβ gav svagt diffus bakgrund vid PCR-test, vilket tyder på delvis ospecifik inbindning av primern. IL1α som fungerade utmärkt vid PCR-testet, amplifierades inte i sanntids-time PCR, av okänd orsak. Dessa felaktigheter skulle med all sannolikhet ha gått att få ordning på om mer tid funnits att tillgå. Då primerdesign och optimering dragit ut på tiden begränsades antalet körningar av prov till att omfatta proverna rörande ovulation. Resultaten från de prov som kördes extrapolerades i jämförelse med de erhållna värdena från standardkurvskörningarna. Vissa värden från provkörningarna hamnade på nivåer utanför standardkurvornas spännvidd och på grund av detta borde kreerandet av standardkurvorna gjorts om med högre startkoncentration och lägre slutkoncentration. Inget referensprov kördes tyvärr på plattorna tillsammans med analyserat

28 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 27(34) prov och den endogena kontrollen, vilket var synd. Om detta gjorts, så hade comparative Cт ( Cт) metoden kunnat användas och givit resultat med större säkerhet (9). De prov som analyserades var PPP4 där effekten på ovulation skulle studeras och PPP7 som bestod av obehandlade kontroller. Godtagbara resultat från körningen med prover erhölls för ERα, ERβ, PR och AR. För standardkurvan gällande GHR blev R 2- korrelationsvärdet endast 0,6065, men provvärden erhölls. Det låga korrelationsvärdet tyder på spridning av indata och lägre överensstämmande av trendlinjen. De extrapolerade GHR-värdena bör därför tolkas med viss försiktighet. TNFαs och IL1βs standardkurvor blev ej tillräckligt bra för att kunna användas. De för påverkan på ovulation erhållna värdena, pekade genomgående på att en återhämtning skett, då PPP4 beh1-proverna för samtliga sökta genprodukter hade ett lägre värde än PPP4 beh4-proverna. Att ERα återhämtar sig i ett lägre tempo än ERβ, kan ha sin förklaring i att större mängder av ERβ uttrycks i ovarierna än ERα. Värdena för PR och AR var även dessa lägre vid PPP4 beh1 än för PPP4 beh4. Att PR i PPP4 beh1 var lågt kan tyda på att de granulosa cellerna hindrades utveckla LH-receptorer, som ger ökad progesteronsyntes. Den i AR relativt PR noterade svaga återhämtningen vid PPP4 beh4 kan bero på den dag 4 med ökade mängden PR, även möjligen ökade progesteronmängden, som vid höga nivåer kan blockera AR. GHR minskar något vid PPP4 beh1, vilket kan bero på den negativen feedbacken för GH som styrs av ökade mängder fritt IGF-1. Vid PPP4 beh4 ökade nivån till över den i kontrollerna uttryckta nivån. Den sena men kraftiga ökningen av GHR kan tyda på att fritt IGF-1 minskade, vilket kan ske om IGF-1 användes till annan uppreglering. Värdena för PPP4 obeh och PPP7 borde varit på samma nivå. Ett skäl till differensen i värdena kan vara att försöksdjuren för PPP4 och PPP7 ej befunnit sig i samma fas av menstruationscykeln. Detta skulle även förklara PPP7s höga Erβ-nivåer och låga PRnivåer, som dag 1 till 2 i mössens menstruationscykel uttrycks i analogi med motsvarande

29 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 28(34) mönster. PPP7-värdenas fluktuation med mycket höga värden, som för ERβ eller mycket låga värden, som för PR, kan höra samman med att försöksdjur tenderar att synkronisera sina menstruationscykler. Den markanta skillnaden mellan provvärdena och PPP7 för PR gav upphov till att de statistiskt bearbetade data visade p>0,05 och en signifikant skillnad mellan PPP4 beh4 och PPP7. För Erα, ERβ, AR och GHR hamnade p<0,05, vilket är statistiskt signifikant. Inom cancerforskningen är PPP som selektivt hämmar IGF1-receptorn högaktuell och har visat sig ha stor inverkan på cancercellers fortlevnad (10,11). I en nyligen presenterad artikel ges en möjlig förklaring till den inom cancerforskningen önskade apoptopiska effekten, som PPP besitter. I den förklaringen föreslås att PPP inducerar IGF1R-ubiquitinering och stimulerar extracellulär signalreglerande kinas ½ (ERK), på ett Mdm2-liknande vis och därigenom hjälper till vid apoptos (12). Endast begränsad resistans har noterats då cancerceller har utsatts för långtidsbehandling in vitro med PPP (13). Andra forskningsområden har endast i liten omfattning utnyttjat möjligheten att använda sig av PPPs egenskaper i försök. I ett av de få utförda försöken där PPP utvärderats i annat sammanhang än cancer, är då begränsning av skada i carotidartären undersökts på råtta. Även i detta försök visade sig PPP ha en positiv inverkan på tillfrisknandet (14). Användandet av PPP i forskning liknande den som används i denna studie, då IGF1s effekt slås ut för att andra hormoners eller dess receptorers inverkan och roll i organismen ska kunna mätas, verkar dock ej ha genomförts. Resultaten pekade på att behandling med PPP, då effekten av IGF1 har blockerats, förändrade nivåerna för ERα, ERβ, PR, GHR och AR. Effekten av dessa ändrade nivåer på ovulationen är svår att förutsäga. I diskussion med min handledare har framkommit att resultat om förhindrad ovulation tidigare noterats. En tanke om detta är att PPP påverkar steroidhormonsyntesen, vilket i sin tur kan påverka steroidhormonreceptorerna. Ingen artikel

30 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 29(34) finns ännu publicerad om detta. Även resultat gällande embryonal utveckling har iakttagits, där PPP-behandling får den embryonala utvecklingen att stanna upp, tills dess att behandlingen tas bort, då embryotillväxten fortskrider. Emryoutvecklingen påverkas dock negativt med skador på embryona. Syftet med denna studie har bara delvis besvarats och arbetet med att fullständigt kartlägga IGF1-receptorns inverkan bör fullföljas för att öka förståelsen för IGF1:s betydelse.

31 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 30(34) ACKNOWLEDGEMENT Jag vill tacka min handledare Anneli Stavreus-Evers för den hjälp jag har fått under mitt examensarbete. Tack Anneli för att du låtit mig tagit stort eget ansvar i ditt projekt, samt besvarade mina frågor och funderingar. Tack Malin för att du introducerade mig till sanntids-pcr och gav mig starthjälp i labbet, samt tog dig tid att besvara mina frågor. Tack Margareta Nordling för att du öppnade möjligheten för mig att göra mitt examensarbete hos er och få en inblick i forskningsvärlden. Det har varit en intressant tid och jag har lärt mig jättemycket. Tack till mina opponenter Kaitlin Nymo och Sylvia Malmberg, som uppmanat och uppmuntrat mig under examensarbetet. Tack till alla er andra som jag har jobbat med på labbet och som har hjälpt mig under mitt examensarbete. Jag vill även tacka min fru Jeannette och mina döttrar Ellen och Yrsa för allt stöd under examensarbetet.

32 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 31(34) REFERENSER 1. Hong Zhu Guo, De An Guo, Xue Yan Fei, Ya Jun Cui, et al. Biotransformation of Podophyllotoxin to Picropodophyllin by Microbes. Journal of Asian Natural Products Research. (1998) 1:2, Emmanuel Roulland, Prokopios Magiatis, Paola Arimondo, Emmanuel Bertounesque, et al. Hemi-synthesis and Biological Activity of New Analogues of Podophyllotoxin. Bioorganic and Medicinal Chemistry. (2002) 10, Daiana Vasilcanu, Ada Girnita, Leonard Girnita, Radu Vasilcanu, et al. The cyclolignan PPP induces activation loop-specific inhibition of tyrosine phosphorylation of the insulin-like growth factor-1 receptor. Link to the phosphatidyl inositol-3 kinase/akt apoptotic pathway. Oncogene. (2004) Eline Menu, Helena Jernberg-Wiklund, Hendrik De Raeve, Evy De Leenheer, et al. Targeting the IGF-1R using picropodophyllin in the therapeutical 5T2MM mouse model of multiple myeloma: Beneficial effects on tumor growth, angiogenesis, bone disease and survival. International Journal of Cancer. (2007) 121, Thomas Strömberg, Simon Ekman, Leonard Girnita, Lina Y. Dimberg, et al. IGF-1 receptor tyrosine kinase inhibition by the cyclolignan PPP induces 2/M-phase accumulation and apoptosis in multiple myeloma cells. Blood Journal. (2006) 107, Axel Ullrich, Alane Gray, Albert W.Tam, Teresa Yang-Feng, et al. Insulin like growth factor 1 receptor primary structure: Comparison with insulin receptor suggests structural determinants that define functional specificity. The EMBO Journal. (1986) 5,

33 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 32(34) 7. Bita Sehat, Sandra Andersson, Radu Vasilcanu, Leonard Girnita, et al. Role of ubiquitination in IGF-1 receptor signaling and degradation. PLoS ONE. (2007) 4, e , Asgerally T Fazleabas,Sheri Hild-Petito, Harold G Verhage. Secretory proteins and growth dactors of the baboon (Papio anubis) uterus: Potentional roles in pregnancy. Cell Biology International. (1994) 12, Stuart N Peirson, Jason N Butler, Russel G Foster. Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis. Nucleic Acids Research. (2003) 14, e73, Ada Girnita, Leonard Girnita,Fabrizio del Prete, Armando Bartolazzi, et al. Cyclolignans as inhibitors of the insulin-like growth factor-1 receptor and malignant cell growth. Cancer Research. (2004) 64, Elfar Ulfarsson, Alexandra Karström, Shucheng Yin, Ada Girnita, et al. Expression and growth dependency of the insulin-like growth factor 1 receptor in craniopharyngioma cells: a novel therapeutic approach. Clin Cancer Res. (2005) 11, Radu Vasilcanu, Daiana Vasilcanu, Bita Sehat, Shucheng Yin, et al. Insulin-like growth factor type-1 receptor-dependent phosphorylation of extracellular signalregulated kinase 1/2 but not Akt (protein kinase B) can be induced by picropodophyllin. Mol Pharm. (2008) 73, Daina Vasilcanu, W-H Weng, Ada Girnita, W-O Lui, et al. The insulin-like growth factor-1 receptor inhibitor PPP produces only very limited resistance in tumor cells exposed to long-term selection. Oncogene. (2006) 25,

34 UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete biomedicinsk laboratorievetenskap 33(34) 14. Anton Razuvaev, Kent Lund, Joy Roy, Ulf Hedin, et al. Noninvasive real-time imaging of intima thickness after rat carotid artery balloon injury using ultrasound biomicroscopy. Atherosclerosis. (2008) ATH-10217, 1-7.