Utvärdering av ny provuppbearbetningsteknik för analys av kortisol i urin Bearbetning med en magnetisk roterande bäddreaktor

Transkript

1 Utvärdering av ny provuppbearbetningsteknik för analys av kortisol i urin Bearbetning med en magnetisk roterande bäddreaktor Samiya Hagi Ali Examensarbete, 15 hp Biomedicinsk analytikerprogrammet, 180 hp VT 2018

2 Institutionen för Klinisk mikrobiologi Biomedicinsk laboratorievetenskap Biomedicinsk analytikerprogrammet Examensarbete, 15 hp Kursansvarig: Ylva Hedberg Fransson Examensarbetets engelska titel Evaluation of a New Sample Preparation Technique for the Analysis of Cortisol in Urine Handledare Patrik Appelblad, Institutionen för farmakologi och klinisk neurovetenskap, Umeå universitet Phouc Dinh, Tobias Jonsson. SpinChem AB Läraropponent: Examinator: Birgitta Sundström Ylva Hedberg Fransson Datum för godkännande:

3 Abstrakt Kortisol är ett hormon som bildas av kolesterol, utsöndras i binjurarna och är mest känd som ett stresshormon. Vid rubbning av binjurebarkfunktion görs kortisolanalys i plasma eller urin som en förstahandsanalys. För att mäta kortisolhalten i urin eller saliv används olika analytiska tekniker som vätskekromatografi (LC) med UV detektor. Innan biologiska prover kan analyseras med LC brukar de genomgå någon from av uppbearbetningsteknik. Syftet var att testa en ny provuppbearbetningsteknik bestående av en magnetisk roterande bäddreaktor (MagRBR) och jämföra den med den befintlig Supported Liquid Extraction (SLE) uppbearbetningsteknik. Bäddreaktorn packades med bärarmaterial/stationärfas så att kortisol kunde anrikas. Erhållna resultaten från en initial fastfas extraktion (SPE) metod visade att stationärfasen Rensa gav högre utbyte av kortisol än stationärfasen Isolute, därför packades MagRBR med Rensa. Ju längre tid urinprovet roterade i MagRBR desto mer kortisol anrikades. För att få kortisol att eluera användes Metyl-tert-butyleter (MTBE). Jämfört med befintlig SLE metoden krävde MagRBR mer tid och större provvolym för att kunna rena fram kortisol från urinprovet. Konklusionen var att kortisol kunde detekteras med MagRBR, men det krävde en större provvolym och längre tid än den befintliga provuppbearbetningsmetoden. Nyckelord Kortisol, SLE, SPE, MagRBR, Urin, LC 3

4 Introduktion Hydrokortisol, som även kallas kortisol, är det huvudsakliga hormonet som utsöndras av binjurarna. Kortisol är en organisk förening som tillhör steroidfamiljen och är den största glukokortikoiden hos människan. Kortisol aktiverar både antistress och anti-inflammatoriska funktioner samt stimulerar fett- och proteinnedbrytning så att glukos kan bildas i levern via glukoneogenes. Genom att öka glukoneogenes kan kortisol hjälpa kroppen att upprätthålla blodglukoskoncentrationen vid stress (1). Det är Adrenokortikotropiskt hormon (ACTH) som stimulerar utsöndringen av binjurebarkens hormoner. Kortisolkoncentrationen i kroppen varierar under dygnets 24 timmar, med lägre koncentration mitt på natten och högre på morgonen. Kortisol som förekommer i plasma brukar vara proteinbunden, metaboliseras i levern för att sedan utsöndras i urinen. Normalt brukar det finnas små mängder av fritt kortisol i urinen. Vid rubbning av binjurebarkfunktionen görs kortisolanalys i plasma eller urin som en förstahandsanalys (2). När binjuren inte klarar av att utsöndra kortisol i tillräckligt mängd kan det leda till olika symtom från huden, muskler och leder. Andra hormoner kan påverkas av kortisolminskningen vilket i sin tur ger andra konsekvenser såsom kronisk trötthet, viktförändring, sömnbesvär och yrsel (3). Överskott av kortisol kan däremot leda till Cushings syndrom som även kallas för hypofys ACTHberoende Cushing syndrom. Sjukdomen är vanligare hos kvinnor och förekommer i alla åldrar. En tumör i binjuren eller hypofysen kan leda till överproduktion av kortisol (4). Hyperkortisolemi kan även leda till depression på grund av hyperfunktion av hypofys binjure axeln (5). För att mäta kortisolhalten i urin eller saliv används olika analytiska tekniker som till exempel radioimmunanalys, gaskromatografi eller vätskekromatografi (LC eller HPLC). Immunoanalys av kortisol saknar specificiteten på grund av att de antikroppar som används har/kan ha viss grad av affinitet för andra okända steroider vilket kan ge falska positiva resultat (6). Vätskekromatografi är en instrumentell analysteknik som används till att separera olika kemiska ämnen ifrån varandra med hjälp av polaritetskillnader i syfte att kunna bestämma koncentrationen av enskilda ämnen i ett provmaterial. I ett LC instrument används olika lösningsmedel beroende på vad som ska separeras och vilken typ av kolonnmaterial som används (7). Instrumentet består vanligtvis av en pump, en injektor och en detektor. I detta arbete har en UV detektor använts vilken mäter provets absorption av ljus vid olika våglängder. Det finns två typer av UV-detektor, fast våglängdsdetektor som mäter absorption vid endast en våglängd, och den andra mäter absorption vid flera våglängder simultant med hjälp av en diodarray. Variabla UV-detektorer har normalt lägre känslighet än en detektor med fast våglängdsdetektor (8). Vätskekromatografi kopplat med masspektrometri (LC-MS) har både hög specificitet och känslighet jämfört med tidigare beskrivna teknikerna och används ofta vid många kliniska laboratorier (9). Innan urinprover kan analyseras i ett LC instrument brukar de genomgå uppbearbetning, och/eller anrikning, för att göra provet renare och koncentrera de ämnen som ska analyseras. Fastfas extraktion (SPE) och Supported Liquid Extraction (SLE) är vanliga uppbearbetningstekniker för detta ändamål. I SPE tekniken använder fasta partiklar/stationärfaser som packas i öppna kolonner och där kan ämnen 4

5 som ska analyseras separeras i olika fraktioner (10). SPE kolonner kan innehålla polära eller opolära stationärfaser och i den här studien användes stationärfaser som hette Rensa och Isolute som var opolära stationärfaser. Urinprov som ska analyseras appliceras i SPE kolonnen följt av ett eller flera tvättsteg i syfte att eluera urinrester, så kallad provmatris och samtidigt behålla de ämnen, analyterna som ska analyseras kvar på kolonnen. För att få analytena att lossna från kolonnen tillsätts en annan lämplig lösningsmedelsblandning som är starkare och kan bryta analyternas bindning till SPE kolonnens stationärfas (11). SLE är den befintliga uppbearbetningsteknik som används vid Norrlands Universitetssjukhus för kortisolanalys i urin. Till skillnad från SPE teknik innehöll SLE polära stationärfaser och analyterna i urinprov kunde då binda till polära partiklar istället. I den här studien testades en ny uppbearbetningsteknik där en magnetisk roterande bäddreaktor (MagRBR) användes och där stationärfasen var packad i bäddreaktorn. MagRBR roterar med en viss hastighet vilket gör att urinprovet som innehåller kortisol åker in i bäddreaktorn från undersidan och åker ut från båda sidorna och på så sätt fastnar kortisol i stationärfasen som finns i reaktorn (12). Syftet med den här studien var att testa en ny provuppbearbetningsteknik baserad på en magnetisk roterande bäddreaktor och jämföra både tid och utbyte av kortisol med en befintlig provuppbearbetningsteknik. 5

6 Material och metoder Standardlösningar Kortisol och kortison användes som standardlösningar. Kortisol (minimum 98% Sigma, Sigma Aldrich, St Louis, US) blandades med 10 ml metanol (Fisher Scientific, UK) i en 10 ml mätkolv med den slutliga koncentrationen 506 µmol/l. Kortison (purum 97% Fluka Chemika Buchs Switzerland) blandades med 10 ml metanol i en 10 ml mätkolv, med den slutliga koncentrationen 498 µmol/l. Från de två standardlösningarna späddes åtta olika koncentrationsnivåer; 1,78; 4,5; 9,36; 13,7; 19,8; 33,4; 51,3 och 190 µmol/l för kortisol och 0,99; 4,95; 9,93; 14,4; 19,6; 29,9; 48,8 och 164 µmol/l för kortison. Dessa arbetslösningar analyserades därefter med hjälp av LC och det gjordes två kalibreringskurvor för respektive standardlösning. Två lösningar bereddes med avsikt att användas som internstandard. Kortisollösning och en kortisonlösning som innehöll 80 ml metanol och 20 ml vatten, slutkoncentrationen av båda lösningarna var 50 µmol/l. Urinprov som bearbetades med SLE spikades till att innehålla 50 µmol/l kortisol. Vätskekromatografianalys Ett LC-10 instrument bestående av två pumpar, autoinjektor, kolonnugn och UV detektor (Shimadzu Kyoto, Japan) användes för att analysera standardlösningar och urinprover. Två mobilfaser bestående av milli-q vatten (Millipore MilliQ med Millipank 0,22 µm filter, Merck Lifescience, Darmstadt Tyskland) med 0,1% myrsyra (Merck Germany) (HCOOH) eller acetontril (ACN) med 0,1% HCOOH användes för gradienteluering. Mobilfaserna pumpades med hjälp av två LC 10A högtryckpumpar, pump A och B, där trycket varierade mellan Mpa i den isokratiska delen av kromatogrammet. I LC systemet fanns även en autoinjektor där proverna placerades inför analys. Prover eller standardlösningar, tio µl injicerades på en Purospher Star RP-18 kolumn endcapped kolonn, (Merck LifeScience, Darmstadt, Tyskland) där de olika molekylerna fastnade och separerades på kolonens stationärfas. Vissa molekyler tog sig genom kolonen snabbare än andra beroende på deras polaritet och dess affinitiet för antingen stationär eller mobil fas. Temperaturen var 30 C och flödeshastigheten 0,3 ml/min. Efter kolonnen satt en LC-UV- detektor tillkopplad där molekylerna passerade och detekterades vid våglängderna 240 och 250nm. Supported Liquid Extraction (SLE) Nio urinprover som markerades med A1-A3, B1-B3 och C1-C3 analyserades. Av dessa urinprover var det sex stycken dvs A1-A3 och B1-B3 som innehöll endast urin och inget tillsatt kortisol, medan de tre resterande urinprover dvs C1-C3 var spikade till att innehålla 50 µmol/l kortisol. Urin, 130 µl pipetterades till en SLE- Array (Isolute SLE+, Biotage AB, Uppsala, Sverige). Proverna rann ner genom respektive SLE brunn med hjälp av vaccum som skapade ett undertryck. Efter fem minuter tillsattes 1500 µl Metyl-tert-butyleter (MTBE (Sigma Aldrich, Germany) 98% och den fick sjunka ner utan något undertryck under några minuter och därefter med högt undertryck i två minuter. Detta steg gjordes två gånger. Eluatet fick därefter dunsta in till torrhet för att få bort all MTBE. Slutligen 6

7 tillsattes 100 µl 50 µmol/l kortisonlösning och 400 µl ren metanol till proverna B1-B3 och C1-C3, och för A1-A3 tillsattes endast 500 µl metanol. Det gjordes även en standard som inte bearbetades utan analyserades direkt i LC. Den standarden innehöll 50 µmol/l av både kortison och kortisol i metanol. Fastfas extraktion (SPE) Den kortisollösning som innehöll 50 µmol/l späddes i 100 ml urin till en slutkoncentration på 1 µmol/l. För provuppbearbetning med SPE användes två olika bärarmaterial/stationärfaser, Rensa och Isolute, båda erhölls från Biotage AB (Uppsala, Sverige). Det vägdes upp 165 mg Rensa och 100 mg Isolute och de packades i plastsprutor/kolonner som rymde 1 ml provvolym och har 10 µm filter (United Chemical Technologies, Bristol USA). Stationärfaserna packades i åtta plastsprutor, fyra plastsprutor med Rensa och fyra plastsprutor med Isolute. Metanol tillsattes till alla packade SPE kolonner så att den tillsatta stationärfasen fick sjunka ner genom sprutan och forma en stabil bädd utan undertryck. Därefter tillsattes 500 µl Milli-Q vatten, surgjort till ph 2 med HCL för att tvätta SPE materialet. Efter tvätt tillsattes urinprover 3, 6, 9, 12 och 15 ml spikade med 1 µmol/l kortisol. Proverna fick sjunka in i sorbenten utan undertryck följt av ett högt undertryck i två minuter. För att få bort urinrester/provmatris repeterades tvättsteget enligt ovan tre gånger. 750 µl MTBEtillsattes i två omgångar och tilläts dunsta in. Därefter tillsattes 100 µl 50 µmol/l internstandard och 400 µl metanol följt av LC-UV analys. Magnetisk roterande bäddreaktor (MagRBR) Metanol 5 ml överfördes till MagRBR som var packad med 0,85 mg Rensa, som fick rotera i 15 min. Metanolen hälldes bort och MagRBR tvättades med 5 ml MilliQ vatten surgjort till ph 2 tre gånger. Sex ml Urinprov som innehöll 50 µmol/l kortisol, överfördes och MagRBR fick rotera i 10 min. Därefter hälldes urinprovet av och MagRBR tvättades µl MTBE överfördes och bäddreaktorn fick rotera i 15 min. MTBE fick sedan dunsta in till torrhet varefter 400 µl metanol och 100 µl 50 µmol/l internstandard överfördes och analyserades i LC. I det andra försöket fick urinprovet rotera i 30 min och MTBE tillsattes till MagRBR i tre omgångar. I ett tredje försök fick urinprovet rotera i två tim och MTBE volymen ökades till 5 ml. Statistik De statistiska analyser som gjordes i detta arbete var beräkning av medelvärdet, standardavvikelse (SD) och relativ standardavvikelse (100xSD/medelvärdet, angett som % RSD) för de olika proverna. Etiska överväganden I den här studien användes ett frivilligt donerat urinprov, vid provtagningen utsattes inte donatorn för någon risk. Studien är ett kliniskt utvecklingsarbete som inte kräver en etisk granskning. 7

8 Resultat Supported Liquid Extraction (SLE) Resultat från nio urinprover indelade i olika grupper, A1-A3, B1-B3 och C1-C3, samt standardlösningar redovisas i tabell 1. Medelvärde och standardavvikelse (SD) och relativ standardavvikelse (RSD) beräknades för de olika grupperna. Grupp A hade lägst respons (areavärde) för både kortisol och kortison med ett medelvärde på mauxs för kortisol och mauxs för kortison medan SD var 556 mauxs för kortisol och 412 mauxs för kortison. RSD var 25% för kortisol och 28% för kortison. Grupp B hade högre medelvärde och lägre SD och RSD. Grupp C hade högst areavärden för både kortisol och kortison (Tab. 1). Fastfas extraktion (SPE) med Rensa och Isolute material Resultat från de 10 urinprover genomgick Fastfas extraktion med de två olika stationärfaserna Rensa och Isolute. Vid användning av 3 ml urinprov gav det en areavärden på 120AUxS för Rensa och 70 AUxS för Isolute. Utbyte för kortisol låg på 88% med Rensa materialet och 47% med Isolute. Vid användning av 6 ml urinprov var areavärdet 265 AUxS med Rensa och 155AUxS med Isolute, utbyte för kortisol var 112% med Rensa och 62% med Isolute. Vid användning av 9 ml urinprov ökade areavärdet med Rensa till 394 AUxS och med Isolute till 216 AUxS där utbytet för kortisol var 110% för Rensa och 51% med Isolute. Vid användning av 12 ml urinprov gav Rensa areavärde på 540 AUxS och Isolute gav 207 AUxS, utbyte var 117% för Rensa och 11% med Isolute. Vid 15 ml urinprov var det 656 AUxS med Rensa och 292 AUxS med Isolute, där utbyte för kortisol var 110% för Rensa och 24% med Isolute (Fig. 1). Magnetisk roterande bäddreaktor Resultaten från, sex ml, urinprov som roterade i MagRBR i 10 minuter gav areavärden på mauxs för kortisol och mauxs för kortison (Tab. 2). Urinprov 6 ml roterade i MagRBR i 30 minuter och analyserades i LC tre gånger. Vid den första analysomgången låg areamedelvärde på mauxs för kortisol och mauxs för kortison. Vid den andra analysomgången var areamedelvärdet mauxs för kortisol och mauxs för kortison. Vid den tredje omgången var areamedelvärdet mauxs för kortisol och mauxs för kortison (Tab. 3). Urinprov 1, 2 och 3 roterade två timmar i MagRBR, urinprov nummer 1 gav ett areamedelvärde på mauxs för kortisol och mauxs för kortison. Urinprov nummer 2 låg areamedelvärdet på mauxs för kortisol och mauxs för kortison. Urinprov nummer 3 gav ett areamedelvärde på mauxs för kortisol och mauxs för kortison (Tab. 4). 8

9 Diskussion Överskott av kortisol kan leda till Cushings syndrom som även kallas för hypofys ACTH-beroende Cushing syndrom. Hormonet stiger under stress vilket gör att den blir associerad med dålig påverkan. (13). I studien optimerades en ny provuppbearbetningsteknik för analys av kortisol i urin. SLE är en provuppbearbetningsteknik som används vid Norrlands universitetssjukhus för upprening av urinprover före kemisk analys av kortisol. Efter provuppbearbetning analyseras kortisol med vätskekromatografi kopplat med masspektrometri (LC-MS). I den här studien användes dock UV detektion istället för masspektrometri. Koncentrationen av internstandard ökades därför från 20 nm till 50 µmol/l. Urinproverna delades i tre olika grupper, grupp A och B innehöll endast urin och inget tillsatt kortisol vilket proverna i grupp C gjorde. Resultaten från LC visade att proverna i grupp A gav areamedelvärdet mauxs för kortisol och mauxs för kortison på grund att urinen normalt innehåller små mängder av både kortisol och kortison. De resterande urinproverna C1-C3 gav högre areavärden eftersom de var spikade till att innehålla både kortisol och kortison (50 µmol/l). Fastfas extraktion testades med olika provvolymer 3; 6; 9; 12 och 15 ml med samma kortisolkoncentration (1 µmol/l). Resultaten visade att stationärfasen Rensa gav högre areavärden och utbyte jämfört med Isolute. Vid 12 ml urinvolym kunde man se att utbyte av kortisol hos Isolute sjönk från 51 till 11% och areavärdet från 216 till 207 AUxS, vilket kunde bero på ett fel som uppstod vid pipettering som orsakade att volymen vart lägre än 12 ml. Vid 9 ml prov sjönk utbyte hos Rensa från 112 till 110% men areavärdet fortsatte att öka. För att få kortisol att eluera från stationärfaserna Rensa/Isolute tillsattes MTBE vilket är ett opolärt lösningmedel. MTBE kunde effektivt eluera kortisol. Om elueringstiden skulle ökas från 5 minuter till 10 eller 15 minuter skulle det möjligen kunna ge högre areavärden med Isolute. För att kunna rena fram kortisol från urinprover ska en magnetisk bäddreaktor vara packad med lämpligt stationärfas/bärarmaterial. SPE metoden visade att Rensa hade högre utbyte av kortisol än Isolute, därför packades MagRBR med Rensa. Urinprov, sex ml som innehöll kortisol med slutkoncentration (1 µmol/l) fick rotera i MagRBR i 10 min. Under tiden urinprovet roterade bands kortisol i urinprovet till Rensa materialet. Resultaten visade ett areamedelvärde på mauxs för kortisol och mauxs för kortison. För SPE med Rensa var areavärde mauxs vid användning av sex ml urinprov. Att låta urinen rotera i 10 minuter gav ett för lågt areavärde/-en vilket kunde bero på att endast en liten del av kortisol som fanns i urinen hann binda in till bärarmaterialen i MagRBR. När urinprovet roterade i 30 minuter och MTBE roterades i tre omgångar ökade areamedelvärdet till mauxs. Desto längre tid urinprovet roterar i MagRBR desto mer kortisol binder in till stationärfasen/bärarmaterialen. Eftersom MTBE roterade i tre omgångar kunde även mer kortisol lossna från stationärfasen. Vid två timmar rotation av urinprov samt ökning av MTBE till 5mL erhölls ett areamedelvärde på mauxs. 9

10 I en tidigare studie optimerades en metod baserad på micellär elektrokinetisk kromatografi (MEKC) med UV-detektion för detektion av kortisol i urinprover (14). Den publicerade metoden har en låg känslighet för absorptionsdetektion varför förbehandling av proverna krävs i syfte att anrika provkoncentrationen. Studien började med en provvolym på en ml, men den ökades till 3,5 och 10 ml. Studien visar att först vid 15 ml urinprov kan endogen kortisolnivå detekteras. Som provuppbearbetningsteknik testades flytande-vätskextraktion (LLE) och SPE. Till skillnad från SPE krävde LLE stora mängder av organiska lösningsmedel som inte var bra för miljön eller personal. De senare argumenten är också en orsak till att SPE blivit mer populär i analytiska laboratorier. Jämfört med den här studien användes inte LLE metoden. Det som var gemensamt för båda studierna var att provkoncentrationen höjdes på grund av att LC med UV-detektor har lägre känslighet än LC-MS. Kortisolkoncentrationen ökades från 20 nm till 50 µmol/l i SLE-metoden. LC-MS har blivit mer populär inom det kliniska laboratoriet under de senaste åren (15). Konklusionen av denna studie var att kortisol kunde detekteras med MagRBR, men det krävde mer provvolym och tid än den befintliga provuppbearbetningsmetoden som idag används vid Norrlands universitetssjukhus. För att kunna dra mer slutsatser skulle fler experiment behövas för att optimera extraktionen med MagRBR. 10

11 Tack tillägnas Jag vil tacka mina handledare Patrik Appelblad, Phouc Dinh och Tobias Jonsson för god handledning 11

12 Referenser 1. Britannica academic, Cortisol 2018, ( ) 2. Ganort P, Grubb A, Linstedt G, Simonsson P, Stenflo J and Theodorsson E. (2003). Klinisk kemi i praktisk medicin. Studentlitteratur. ISBN Sid 420 och Munsterhjelm K, Nordell KM, Brunes B, Edberg Anderssonn K, Saupe G. Salivkortisol kan påvisa binjureutmattning. 201l; Cushings syndrom/sjukdom ( ) 5. Thirthalli J, Naveen G.H, Rao M.G, Varambally S, Christopher R, Gangadhar B.N. Cortisol and antidepressant effects of yoga. Indian J Psychiatry. 2013;55(3):S405-8 doi: / Jia M, Chew WM, Feinstein Y, Skeath P, Sternberg EM. Quantification of Cortisol in Human Eccrine Sweat by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectometry. Analyst ;141(6): doi: /c5an02387d 7. Biomedicinsk Analytiker HPLC ( ) 8. Biocompare. HPLC UV Detector (UV/visible HPLC Detectors) Detectors/ ( ) 9. J J Pitt. Principles and Applications of Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Clinical Biochemistry.Clin Biochem Rev. 2009;30(1):19-34 PMID: Biotage ISOLUTE SLE+Supported Liquid Extraction Products ( ) 11. Institutionen för fysik,kemi och biologi (s ) 12. Spinchem MagRBR ( ) 13. Wirth M.M, Scherer S.M, Hoks R.M, Abercorombie H.C. The effect of cortisol on emotional responses depends on order of cortisol and placebo administration in a within-subjects design. Psychoneuroendocrinology.2011 ;36(7): doi: /j 14. Reetu K, Ranabir S. Stress and hormones. Indian J Endocrinol Metab.2011;15(1):18-22 doi / Grebe SK, Singh RJ LC-MS/MS in the Clinical Laboratory-Where to From here?. Clin Biochem Rev. 2011;32(1):5-31. PMID

13 Tabell 1. Urinprover som bearbetats med SLE metoden och analyserades med LC Urinprover Area (mauxs) Area (mauxs) RSD (%) Kortisol Kortison Kortisol Kortison A A A Medelvärdet SD B B B Medelvärdet SD C C C Medelvärdet SD Standard

14 Tabell 2. Urinprovet som fick rotera i MagRBR i 10 minuter och analyserades i LC 3 gånger gav area 1, 2 och 3 för både kortisol och kortison. Urinvolym (6ml) Area1 (mauxs) Area 2 (mauxs) Area 3 (mauxs) Medelvärdet (mauxs) SD (mauxs) RSD (%) Kortisol ,7 Kortison ,6 14

15 Tabell 3. Urinprov fick rotera i 30 minuter följt av tre omgångarna med MTBE-lösninge fick rotera i MagRBR. För varje omgång analyserades provet i LC tre gånger viket gav tre replikat för både kortisol och kortison. Medelvärdet beräknades Area medelvärde (mauxs) SD (mauxs) RSD (%) Kortisol , , ,40 Kortison , , ,37 15

16 Tabell 4. De tre olika urinprover som fick roteras i MagRBR i två timmar, sedan analyserades i LC tre gånger. Area medelvärde (mauxs) SD (mauxs) RSD (%) Kortisol , , ,6 Kortison , , ,90 16

17 SPE Area (AUxs) % 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% Volym (ml) Utbyte (%) Isolute Area Rensa Area Isolute utbyte Rensa utbyte Figur 1. Resultaten för de två stationärfaser Rensa och Isolute, där areavärdet för kortisol redovisas på vänstra y-axel och Utbyte av kortisol redovisas i den högra y-axel samt urinvolym på x-axel. 17

18 A B Area (AUxs) Area (AUxs) Kortisol (µmol/l) Kortisol (µmol/l) C D Area (AUxs) Area (AUxs) Kortison (µmol/l) Kortison (µmol/l) Figur 2. Kalibreringskurvor för kortisol och kortison med koncentration på x-axel och respons (areavärde) på y-axel. 18