Betydelsen av farmakogenetik för behandling av ALL och IBD -exemplet TPMT and tiopuriner

Transkript

1 Betydelsen av farmakogenetik för behandling av ALL och IBD -exemplet TPMT and tiopuriner Malin Lindqvist Appell Docent i farmakogenetik, Biträdande professor vid Linköpings universitet Thiopurinmetyltransferas (TPMT)

2 Tiopuriner N N O 2 S H N H N H C 3 N S N H N N N N N 6-Mercaptopurine Azathioprine S H N H N N N H 2 N 6-Thioguanine Gertrud Elion ( ) Nobel price in MP AZA 6-TG - Purinanaloger - Cytotoxiska och immunosuppressiva egenskaper - Akut lymfatisk leukemi (ALL), - Autoimmuna sjukdomar tex inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD), reumatism och efter organtransplantation

3 METABOLISMEN AV TIOPURINLÄKEMEDEL TPMT 6-MP TGN aktiv metabolit Påverkan på benmärgen och bildning av blodceller! memp inaktiv metabolit Tumörcell går i apoptos 6-MP (6-mercaptopurin, läkemedel) TGN (tioguanin nukleotider) TPMT (tiopurin metyltransferas, enzym) memp (metylmerkaptopurin)

4 Thiopurine methyltransferase (TPMT) wt wt wt 90 % normal activity 10 % intermediate activity 0.3 % low or no activity Figure: Pettersson et al., 2002

5 Vad har TPMT för naturlig funktion? Selen spårämne Selenide (reaktiv intermediär) bildning av selenoproteiner (25 kända) en av dem är Selenocystein (Sec) Selenocystein (Sec) S-adenosylmetionine (SAM) Urbancic et al., BBA general subjects 1863 (2019)

6 Aktiviteten bestäms i röda blodkroppar eller helblod Modified from Pettersson et al., 2002

7 TPMT alleles Single nucleotide polymorphisms (SNPs) Caucasians Africans Rare allele TPMT*1/*3A (intermediate enzyme activity) TPMT*3B/*3C (TPMT deficient)

8 A website serves as a platform Aim; To maintain a common logical nomenclature system for TPMT alleles in humans ML Appell et al., Nomenclature for Alleles of the Thiopurine Methyltransferase (TPMT) gene. Pharmacogenetics and Genomics 2013, 23:

9 Tiopurinmetyltransferas (TPMT) A comprehensive study of thiopurine methyltransferase genotype, phenotype and genophenotype discrepancies in Sweden Anna Zimdahl Kahlin Anna Zimdahl Kahlin, Sara Helander, Karin Skoglund, Peter Söderkvist, Lars-Göran Mårtensson, Malin Lindqvist Appell

10 Analysis of TPMT discrepancies TPMT genotype: *1/*1 Patient TPMT enzyme activity: < 9 U/ml prbc < 23 nmol/g Hb Sequencing of TPMT exons rare or novel SNPs! In vivo Rekombinant humant TPMT from E.Coli Fluorescens och isothermal titration calorimetry (ITC) bindning toligand Analysera RNA splicing? Circular dicroism (CD) protein stability Recombinant TPMT enzyme activity

11 Klinisk användning av denna kunskap? Bestämning av TPMT genotyp /fenotyp före start av tiopurinbehandling Genotyp bestäms för SNPar; 238G>C, 460G>A, 719A>G med pyrosequencing TPMT-aktiviteten bestäms med LC-MS/MS Mätning av läkemedelsmetaboliter under pågående tiopurinbehandling (TGN och MeTIMP) Mäts med LC-MS/MS

12 Men räcker det att studera TPMT för att individualisera tiopurinbehandling? 12

13 Metabolism av tiopuriner Ett försök att sammanställa..visar på komplexiteten Courtesy of S. Haglund Deoxythioguanosine TUA TUA TX XO TPMT memp metg Nucleoside diphosphate kinase/ Pyruvate kinase NT5C Metabolism of Thiopurines XO Guanase ITPase? dtgmp AZA GST + GSH 6-MP 6-TG TPMT HPRT + PRPP Ribonukleotidreductase dtgtp GMPR HPRT +PRPP dtgdp Incorporation into DNA ITPase IMPDH +NAD CANT1 TITP TIMP TXMP TGMP TGDP AK TPMT +SAM GMPS +ATP+glutamine Guanylatkinase CANT1 DNA and RNA synthesis NT5C MPR NT5C TPMT+ SAM TXTP? ITPase? NT5C TGTP Purine memp R A K metimp P Thioxanthosine Thioguanosine Incorporation into RNA/interaction with Rac1/Rac2/Caspase pathway ITPase? Nucleoside diphosphate kinase/ Pyruvate kinase de novo synthesis Ribose-5-phosphate PRPP P PAR-amidotransferas +glutamine PRA IMP PRPP-synthetase + ATP MEKKK1 NF-KB Rac1-GTP (Rac2) Vav Adeninenucleotides Guaninenucleotides CD28 STAT3 Caspase 9 Mitocondrial pathway of apoptosis Bcl-XL antiapoptotic pathway

14 Nomenklatur för fosforylerade metaboliter Tioguaninnukleotider (TGN) är ett samlingsnamn för Tioguanosinmonofosfat (TGMP) Tioguanosindifosfat (TGDP) Tioguanosintrifosfat (TGTP) deoxytioguanosinmonofosfat (dtgmp) deoxytioguanosindifosfat (dtgdp) deoxytioguanosintrifosfat (dtgtp) ribosformen - samma socker som RNA Deoxyformen har samma socker som DNA

15 Equalis expertgrupp för läkemedel och toxikologi. Anders Helldén Harmoniseringsprojekttiopurinanalyser i Norden TPMT genotypning, fenotypning och bestämning av tiopurinmetaboliter (TGN och metimp) Tiopurinmetyltransferas (TPMT)

16 Nordiskt nätverk

17 LAND TPMT TPMT TGN/meTIMP Ort Genotyp Fenotyp Metaboliter SVERIGE Linköping X X X Göteborg X X X Halmstad X X X Stockholm X X X Uppsala X NORGE Oslo X X Trondheim X DANMARK Köpenhamn X X X Hvidovre X X (PÅ GÅNG) FINLAND Helsingfors X X (skickar till Oslo) Provutskick Nya Zeeland - metaboliter Tyskt kval.program genotypning Provutskick Nya Zeeland - genotypning

18 Tack för uppmärksamheten!

19 Verkningsmekanism allmän deoxytioguanosintrifosfat (dtgtp) inkorporeras i DNA som falska byggstenar (Tidd & Paterson 1974, Karran and Attard 2008) leder via olika mekanismer till apoptos (eller autofagi till apoptos). I lymfocyter hämmar TGTP Rac-1 vilket leder till apoptos (Tiede et al 2003) tros ha en effekt vid tiopurinbehandling av IBD.

20 Verkningsmekanism ALL? Kontra IBD? Oklart vilken betydelse metimp har jämfört med TGN, för effekten/biverkningar vid ALL. Vid IBD finns flera studier som påstår att metylerade metaboliter är korrelerade till biverkningar, tex hepatotoxicitet, myelosuppression mm.

21 Metylerade metaboliter memp som bildas när TPMT metylerar MP mha S-adenosylmetionine (SAM) är en inaktiv metabolit som inte är toxiskt för cellen (Lennard 1992) TPMT aktiviteten är negativt korrelerat med TGN och positivt korrelerat till metimp/mempn (Lennard 1990, Boström och Erdmann 1993) metimp bildas av TPMT och SAM och denna substans är i sin fosforylerade form (metimp), samt ofosforylerade form (mempr), toxisk för cellen vilka våra egna och andras in vitro studier har visat (stet 1994). De är båda potenta inhibitorer av purin de novosyntesen i cellengenom att de hämmar enzymet phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase (Coulthard 2002, Dervieux 2002, Tay 1969) Den initiala hypotesen att TPMT bildar inaktiva produkter är således bara delvis sant. Toxiciteten via TPMTs bildning av metimp beror i sin tur på hur beroende cellen är av PDNS. En del celler saknar tex MTAP ett enzym som gör att cellen inte har någon salwage pathway och därför är mycket beroende av PDNS. Om en celltyp är mycket beroende av PDNS (Prolifierande celler) så blir effekten av förändrat TPMT större (jämfört om celltypen är beroende av endast Purine salvage pathway)