SERION ELISA classic. Enterovirus IgA/IgG/IgM. Instruktioner - Svenska (Version 8.12/04-1) YOUR GLOBAL PARTNER DIAGNOSTICS.

Transkript

1 YOUR GLOBAL PARTNER IN DIAGNOSTICS SERION ELISA classic Enterovirus IgA/IgG/IgM Tillverkare Institut Virion\Serion GmbH Friedrich-Bergius-Ring 19 D Würzburg, Germany Tel.: +49 (0) 9 31 / Fax: +49 (0) 9 31 / dialog@virion-serion.de Internet: Instruktioner - Svenska (Version 8.12/04-1)

2 Uppdateringar Var uppmärksam på skillnaderna i förhållande till den tidigare versionen. Nuvarande version nr: V 8.12/04-1 Tidigare version: V 7.11/12-1 Uppdatering i avsnitt: 1, 2, 8.6, 8.7, 9.1, 9.2, 11 SERION ELISA classic Enterovirus IgA/IgG/IgM INNEHÅLLSFÖRTECKNING 1 AVSEDD ANVÄNDNING 2 DIAGNOSTISK RELEVANS 3 TESTPRINCIP SERION ELISA classic 4 KITKOMPONENTER 5 MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE MEDFÖLJER 6 FÖRVARING OCH STABILITET 7 TESTUTFÖRANDE - SERION ELISA classic 7.1 Kvalitetsförlust 7.2 Provberedning och provförvaring 7.3 Beredning av kitreagens 7.4 Översikt - testutförande 7.5 Manuellt testutförande 7.6 Automatiserat testutförande 7.7 Positiv kontroll och precisionskontroll 8 TESTUTVÄRDERING 8.1 Enpunktskvantifiering enligt 4PL-metoden 8.2 Giltighetskriterier 8.3 Beräkningar i SERION ELISA classic Enterovirus IgA/IgG/IgM 8.4 Kvantifieringsgränser 8.5 Gränsvärdesområden 8.6 Tolkning av resultat 8.7 Referensområde för friska individer 9 PRESTANDA 9.1 Sensitivitet och specificitet 9.2 Reproducerbarhet 10 Säkerhetsåtgärder 10.1 Varningar och försiktighetsåtgärder 10.2 Avfallshantering 11 REFERENSER gällande version nr: V 8.12/04-1 föregående version: V 7.11/12-1

3 Pos: 1 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/gültig für nur ein Dokument/U pdate/u pdate: Enterovir Pos: 3 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/gültig für nur ein Dokument/Bestell nummern/enterovirus: Pos: 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/gültig für alle D okumente/elisa cl assic/allgemei ne T exte ELISA cl assic/kapitelüberschrift "Diag nostische 1 Pos: 4\mod_ _43.doc 2 /Arbeitsanleitungen Texte classic/einleitung classic/gültig für "Enzymimmunoassay" alle Dokumente/ELISA SERION ELISA classic Enterovirus IgA/IgG/IgM Enzym-immunanalys för bestämning av humana antikroppar för in vitro-diagnostisk användning SERION ELISA classic Enterovirus IgA Ordernr: ESR133A SERION ELISA classic Enterovirus IgG Ordernr: ESR133G SERION ELISA classic Enterovirus IgM Ordernr: ESR133M classic/allgemeine 0\mod_ _43.doc Pos: 4 /Arbeitsanleitungen Texte classic/kapitelüberschrift für alle Dokumente/ELISA 1 AVSEDD ANVÄNDNING Pos: 5 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/gültig für nur ein Dokument/Anwendungsber eich/enterovir us: Testerna i SERION ELISA classic Enterovirus IgA, IgG och IgM är kvalitativa och kvantitativa immunanalyser för påvisande av humana antikroppar, i serum eller plasma, som är riktade mot enterovirus. Åtskiljande detektion av de olika antikroppsklasserna underlättar bekräftelse av kontakt med organismen och stödjer kategoriseringen av sjukdomsskedet. 2 DIAGNOSTISK RELEVANS Pos: 7 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/gültig für nur ein Dokument/Di agnostische Bedeutung/Enter ovirus: Di agnostische Coxsackievirus A och B samt ECHO-virus finns spridda över hela världen och tillhör familjen Picornaviridae, släktet Enterovirus. Dessa virusgrupper liknar varandra när det gäller de biologiska egenskaperna och epidemiologin. De har en primärt fekal-oral överföringsstrategi men kan även spridas via aerosoler. Överföringen mellan människor sker huvudsakligen genom kontaktinfektion där inkörsporten är antingen mag-tarmkanalen eller andningsvägarna. Virusen når via blodcirkulationen retikuloendoteliala systemet och andra målorgan som myokardiet, meningerna eller huden. I tropiska områden tenderar infektionerna att förekomma året runt medan de i tempererade områden når en topp under sommarmånaderna och avtar under hösten. Små barn är de som oftast infekteras. Infektion hos icke-immuna äldre barn och vuxna kan leda till svåra sjukdomstillstånd. Inkubationstiden ligger mellan 12 timmar och 35 dygn. Mer än 90% av alla enterovirusinfektioner är asymtomatiska eller leder bara till allmänna lindriga obehag med kort varaktighet som berör de övre andningsvägarna, exempelvis halsont med eller utan rinit som ofta är förbunden med feber. Hos vuxna kan symtomen vara faryngit, tonsillit och influensaliknade symtom. På sjukhus och andra institutioner orsakar i synnerhet enterovirus epidemier hos nyfödda och små barn med rinit, faryngit, bronkit och pneumoni. Coxsackievirus ger upphov till den så kallade "sommarinfluensan" samt andra febrila, katarrala infektioner. Andra sjukdomar som kan orsakas av enterovirus inbegriper aseptisk meningit, meningoencefalit, herpangina, exantem (enterovirus), pleurodyni, kardit (coxsackievirus), hemorragisk konjunktivit (coxsackievirus), encefalit, ataxi, Guillain-Barrés syndrom (ECHO-virus). Individer med medfödd eller inducerad immunbrist löper risk att drabbas av viruspersistens efter en infektion, vilket kan leda till kroniska sjukdomar som kronisk enterit, artrit, sjukdomar i centrala nervsystemet, recidiverande perikardit eller kronisk hjärtsjukdom. svenska 2

4 Enterovirusinfektioner kan bekräftas genom direktpåvisning av patogenen eller genom serologiska belägg för specifika antikroppar. PCR-metoden är ett viktigt komplement till de klassiska metoderna under det att ELISA-testerna har etablerat sig under senare år. På grund av det stora antalet serotyper krävs ett test med bred reaktivitet för att i ett enda test detektera alla de olika serotyperna. Testerna i SERION ELISA classic Enterovirus är baserade på en blandning av rekombinanta antigener som härstammar från bevarade och subtypspecifika epitoper på VP1-proteiner på coxsackievirus B1, B3 och B5 samt ECHOvirus E6 och E9. Dessa epitoper har befunnits vara tillräckligt korsreaktiva för att kunna påvisa infektioner orsakade av andra enterovirussubtyper. En akut enterovirusinfektion kan bekräftas genom detektering av specifika IgM- och/eller IgA-antikroppar eller en stigande IgG-titer. Den högsta frekvensen för IgM-positiva serum återfinns hos barn i åldrarna mellan 1 och 10 år. IgM-antikroppar kan vanligtvis påvisas under en period på 6 till 8 veckor. IgM-titrarna kan i ovanliga fall kvarstå upp till 6 månader efter aseptisk meningit eller upp till 3 till 6 månader efter perikardit. Patienter med recidiverande perikardit kan uppvisa detekterbara halter av IgM under mer än 5 år. Vid fall med akut infektion är IgA-detektering ett värdefullt tillägg till IgM-serologi. Persisterande IgA-antikroppar kan vara påvisbara vid typ 1-diabetes och kronisk hjärtsjukdom under 6 månader upp till flera år. Pos: 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/gültig für alle D okumente/elisa cl assic/t estprinzip/testpri nzip ELISA 1 3 TESTPRINCIP SERION ELISA classic ELISA (enzymkopplad immunadsorberande analys) är en immunanalys som är särskilt väl lämpad för bestämning av antikroppar inom området infektionsserologi. Reaktionen baserar sig på den specifika interaktionen mellan antikroppar och deras motsvarande antigen. Teststripsen i mikrotiterplattorna hos SERION ELISA classic är belagda med specifika antigener från en relevant patogen. Om patientens serumprov innehåller antikroppar binder de till den fixerade antigenen. En sekundär antikropp som har konjugerats med enzymet alkaliskt fosfatas detekterar och binder till immunkomplexet. Det färglösa substratet p-nitrofenolfosfat omvandlas då till den färgade produkten p-nitrofenol. Signalintensiteten av denna reaktions produkt är proportionell mot koncentrationen av analyten i provet och mäts fotometriskt. Pos: 9 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/gültig für mehrere Dokumente/Inhalt und Zusammensetzung/Inhalt und Zusammensetzung (alle außer Bor,EBV,Hanta,Parvo, 1 svenska 3

5 4 KITKOMPONENTER Testkomponenter Delar / volym Brytbara mikrotiterteststrips var och en med åtta antigenbelagda enkelbrunnar, (totalt 96) MTP, 1 ram. Beläggningsmaterialet är inaktiverat. 12 delar Standardserum (bruksfärdigt) STD, Humant serum i proteinhaltig fosfatbuffert; negativt för anti-hiv-ak, HBsAg (hepatit B-virusytantigen) och anti-hcv-ak; konserveringsmedel: < 0,1 % natriumazid; färgämne: amarant O. Negativt kontrollserum (bruksfärdigt) NEG, Humant serum i proteinhaltig fosfatbuffert; negativt för anti-hiv-ak, HBsAg (hepatit B-virusytantigen) och anti-hcv-ak; konserveringsmedel: < 0,1 % natriumazid; färgämne: lissamingrönt V. Anti-humant IgA-, IgG- eller IgM-konjugat (bruksfärdigt) APC, Polyklonal antikropp riktad mot humant IgA, IgG eller IgM, konjugerad till alkaliskt fosfatas, stabiliserad i proteinhaltig stabilisationslösning; konserveringsmedel: 0,01 % metylisotiazolon, 0,01 % bromnitrodioxan. Tvättlösningskoncentrat (tillräckligt för 1000 ml) WASH, Natriumkloridlösning med Tween 20 och 30 mm Tris/HCl, ph 7,4; konserveringsmedel: < 0,1 % natriumazid. Spädningsbuffert DILB, Proteinhaltig fosfatbuffert med Tween 20; konserveringsmedel: < 0,1 % natriumazid; färgämne: 0,01 g/l bromfenolblått. Stopplösning STOP, 1,2 N natriumhydroxid. Substrat (bruksfärdigt) pnpp, Para-nitrofenylfosfat i lösningsmedelsfri buffert; konserveringsmedel: < 0,1 % natriumazid. (Substrat i oöppnad flaska kan vara svagt gulfärgat, vilket inte sänker produktens kvalitet!) Kvalitetskontrollcertifikat med standardkurva och utvärderingstabell INFO, (kvantifiering av antikroppar i IU/ml eller U/ml). 2 x 2 ml 2 ml 13 ml 33,3 ml 2 x 50 ml 15 ml 13 ml 2 sidor Pos: 10 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/gültig für mehrere Dokumente/Zusätzlich benötigte Materialien/Z200 Zusätzlich benötigte Materialien (für Teste mit 1 svenska 4

6 5 MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE MEDFÖLJER - vanlig laboratorieutrustning - för IgM-detektering: SERION Rf-Absorbent, ordernr. Z200 (20 ml) - fotometer för mikrotiterplattor, med filter, våglängd 405 nm, rekommenderad referensvåglängd 620 nm nm (t.ex. 650 nm) - inkubator 37 C - fuktkammare - destillerat vatten - påsklämmor (ordernr. VT120) Pos: 11 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/gültig für alle Dokumente/ELISA classic/lagerung und Haltbarkeit/Lagerung und 1 svenska 5

7 Pos: 12 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estdurchführung/überschrift: Durchführ 1 6 FÖRVARING OCH STABILITET Reagens Förvaring Stabilitet Mikrotiterstrips (belagda med antigen) oöppnad efter öppning vid 2-8 C tillsammans med torkmedel i en försluten aluminiumpåse se förfallodatum; minsta hållbarhetstid fyra veckor; Kontrollserum och standardserum Strips som inte används måste förvaras torrt i en försluten aluminiumpåse. efter öppnande vid 2-8 C hållbar till förfallodatum vid korrekt användning och förvaring se förfallodatum; 24 månader från tillverkningsdatum Konjugat bruksfärdig lösning vid 2-8 C Undvik kontamination t.ex. genom användning av sterila spetsar. se förfallodatum; 28 månader från tillverkningsdatum Spädningsbuffert Oöppnad efter öppnande vid 2-8 C Kassera grumliga lösningar. se förfallodatum; 36 månader från tillverkningsdatum 24 månader Tvättlösning Koncentrat efter öppnande vid 2 8 C bruksspädning vid 2-8 C bruksspädning vid rumstemperatur Flaskor för brukslösning bör regelbundet rengöras. Kassera grumliga lösningar. se förfallodatum; 2 veckor; 1 vecka Substrat bruksfärdig lösning vid 2-8 C, förvaras skyddade för ljus Undvik kontamination t.ex. genom användning av sterila spetsar. Kassera om lösningen gulfärgas (extinktion mot dest. vatten > 0,25 OD). se förfallodatum; 36 månader från tillverkningsdatum Stopplösning Efter öppnande vid rumstemperatur se förfallodatum svenska 6

8 Pos: 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estdurchführung/allgemeine Hi nweise ELISA cl 2 7 TESTUTFÖRANDE - SERION ELISA classic 7.1 Kvalitetsförlust Vid arbete med SERION ELISA classics immunanalyser ska enbart SERION ELISA classics egna reagens användas. Komponenterna får in bytas ut mot reagens från andra tillverkare. Standard- och kontrollserum i SERION ELISA classics immunanalyser har definierats och färdigställts uteslutande för testkitet som ska användas och ska inte användas till andra batcher. Spädningsbuffert, tvättlösning, substrat och stopplösning kan användas för alla SERION ELISA classics immunanalyser oberoende av batcher och test. Det finns tre olika konjugatkoncentrationer för varje immunglobulinklass: LÅG, MEDEL, HÖG. Konjugatklassindelningen finns angiven på varje etikett enligt följande: t.ex. IgG + IgG ++ IgG +++ IgG-konjugat i låg koncentration IgG-konjugat i medelkoncentration IgG-konjugat i hög koncentration För att garantera en oföränderlig kvalitet på våra produkter måste i sällsynta fall särskilda konjugat användas. Specialkonjugaten framställs som separata batcher, betecknas inte med + och är inte utbytbara mot andra konjugat. Läs noggrant informationen på etiketterna! Alla komponenter i SERION ELISA classics tester kan om de förvaras oöppnade och på angivet sätt användas fram till förfallodatumet som finns angivet på etiketterna. Reagensen ska inte användas efter förfallodatumet. Om reagensen späds eller förändras kan känsligheten försämras. Skydda reagensen för starkt ljus under förvaring och inkubering. För att undvika avdunstning och kontamination måste reagensbehållarna tillslutas väl efter användning. Skär enbart av toppen av den markerade sidan vid öppnande av aluminiumpåsen för mikrotiterplattan, då detta säkerställer en god återförslutning. Använd inte stripsen om aluminiumpåsen är skadad eller om påsen med återstående remsor och torkmedel inte återförslutits på korrekt sätt. Aseptisk teknik ska användas för att förebygga kontamination när alikvoterna tas ut från reagensrören. Berör inte och stänk inte ned brunnarnas övre väggar under pipetteringen av konjugaten för att undvika falskt positiva resultat. Se till att flaskornas och/eller ampullernas korkar inte blandas ihop. Testresultatens reproducerbarhet är beroende av omsorgsfull omblandning av reagensen. Skaka om flaskorna med kontrollserum före användning och även alla prov efter spädning (t.ex. genom att använda en vortexblandare). svenska 7

9 Pos: 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estdurchführung/kapi tel überschrift 3 Pos: 18 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für nur ein D okument/testdurchführ ung/probenverdünnung/enterovirus: Probenverdünnung, Teil 2 Ü berschrift, R Var noggrann vid pipetteringen och följ angivna tider och temperaturer för inkubationen. Stora tidsskillnader mellan pipettering av den första och sista brunnen på mikrotiterplattan vid portionering av prov och kontrollserum, konjugat eller substrat kan resultera i olika inkubationstider, vilket kan påverka resultatens precision och reproducerbarhet. Optimala resultat kan bara uppnås om man strikt följer instruktionerna. SERION ELISA classics immunanalyser är endast giltiga om de batchspecifika valideringskriterierna på kvalitetskontrollcertifikatet uppfylls. Korrekt tvättning förhindrar ospecificiteter i testet. Därför bör tvättproceduren genomföras med stor noggrannhet. Alla de flatbottnade brunnarna ska fyllas med lika stora volymer tvättbuffert. Se vid slutet av tvättproceduren till att brunnarna tömts på all tvättbuffert för att undvika okontrollerade spädningseffekter. Undvik skumbildning! Se till att texten (patogen och antikroppsklass) på mikrotitertestremsorna inte skadas under tvättning och utsugning så att oordning inte uppstår. Pos: 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für mehrer e D okumente/t estdurchführ ung/probenvor ber. und Lager ung (für ALLE Err eger auß er Borreli a, CM V, FSM E, H SV,Masern,Mumps,R öteln,vz Provberedning och provförvaring Lipemiska, hemolytiska och ikteriska prov (serum eller plasma) ska testas med försiktighet. Klart kontaminerade prov bör inte testas. Lämpliga material är serum och plasma (EDTA, citrat, heparin) som tagits i enlighet med vedertagna standardiserade laboratorieförfaranden. Proven får inte värmeinaktiveras Provspädning Späd patientproven (V 1 ) före testkörning med spädningsbuffert (V 2 ) enligt följande: Pos: 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für nur ein D okument/testdurchführ ung/probenverdünnung/enterovirus: Probenverdünnung, Teil SERION ELISA classic Enterovirus IgA V 1 + V 2 = sätt 10 µl patientprov till 1000 µl spädningsbuffert SERION ELISA classic Enterovirus IgG V 1 + V 2 = sätt 10 µl patientprov till 1000 µl spädningsbuffert (= 1+100) 50 µl av den första spädningen till 200 µl spädningsbuffert (= 1+4) Pos: 17 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estdurchführung/pr obenver dünnung: Mischung der Efter spädning och före pipettering i mikrotiterplattan måste proven blandas noggrant för uppnående av en homogen lösning. svenska 8

10 Pos: 23 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estdurchführung/reagenzienvorberei tung, T eil 233 SERION ELISA classic Enterovirus IgM Pos: 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für mehrer e D okumente/t estdurchführ ung/probenver dünnung: R heumafaktor-interferenz (für T ests mit Störning från reumafaktorer Reumafaktorer är autoantikroppar, huvudsakligen av klassen IgM, som företrädesvis binder till IgG-immunkomplex. Närvaron av icke-specifika IgM-antikroppar (reumafaktorer) kan leda till falskt positiva resultat i IgM-analysen. Dessutom föreligger risk att svagbindande patogenspecifika IgM-antikroppar trängs undan av starkbindande IgGantikroppar vilket leder till ett falskt negativt IgM-resultat. Det är därför nödvändigt att före IgM-detekteringen förbehandla proven med absorptionsmedel för reumafaktorer (SERION Rf-Absorbent, ordernr: Z200 (20 ml/100 tester)). Rf-absorption utförs genom inkubering av patientproven i Rf-spädningsbuffert under 15 minuter vid rumstemperatur eller över natt vid 4 C. Testproceduren beskrivs i en separat bruksanvisning. Pos: 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für nur ein D okument/testdurchführ ung/probenverdünnung/enterovirus: Probenverdünnung T eil Innan testet körs måste reumafaktorabsorptionsmedlet (V 1 ) spädas 1+4 i spädningsbuffert (V 2 ). V 1 + V 2 = V 3 (1 + 4) sätt 200 µl Rf-absorptionsmedel till 800 µl spädningsbuffert Patientproven (V 4 ) måste spädas i denna Rf-spädningsbuffert (V 3 ): V 4 + V 3 = sätt 10 µl patientprov till 1000 µl Rf-spädningsbuffert Pos: 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estdurchführung/pr obenver dünnung: Mischung der Efter spädning och före pipettering i mikrotiterplattan måste proven blandas noggrant för uppnående av en homogen lösning. Pos: 22 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estdurchführung/pr obenlager Provförvaring Patientprov bör inte förvaras mer än 7 dygn vid 2-8 C. Längre förvaring är möjlig vid - 20 C. Undvik upprepad frysning och tining av prov. Spädda prov kan förvaras upp till en vecka vid 2-8 C. svenska 9

11 Pos: 25 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estdurchführung/reagenzienvorberei tung, T eil Pos: 26 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estdurchführung/testabl auf/ü berschrift Beredning av kitreagens Se till att alla reagens före testning antagit rumstemperatur Mikrotiterteststrips Mikrotiterteststripsen i ramar ligger förpackade tillsammans med ett torkmedel i en aluminiumpåse. Ta ut de teststrips som inte behövs ur ramen och sätt tillbaka dem i aluminiumpåsen. Förslut noggrant påsen för att säkra lufttät förvaring Kontrollserum respektive standardserum Kontroll- och standardserum är bruksfärdiga och ska inte spädas ytterligare. Vid varje testkörning måste oberoende av antalet mikrotiterteststrips som används även kontroll- och standardserum finnas med. Standardserumen ska finnas med i dubbel uppsättning. Pos: 24 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für mehrer e D okumente/t estdurchführ ung/r eagenzienvorbereitung: Rf- Absorbens (für T este mit Behandla inte kontrollserumen med Rf-absorptionsmedel Anti-humant IgA-, IgG- eller IgM-AP-konjugat (bruksfärdigt) Konjugat med lika stor koncentration och av samma immunglobulinklass är utbytbara. Undvik kontamination av bruksfärdiga konjugat, t.ex. genom användning av sterila spetsar Tvättlösning Späd den koncentrerade tvättbufferten (V 1 ) 1:30 med dest. vatten till en slutvolym V 2. Exempel: Buffertkoncentrat (V 1 ) Slutvolym (V 2 ) 33,3 ml ml 1,0 ml 30 ml Spädningsbuffert för prov (bruksfärdig) Substrat (bruksfärdigt) Undvik kontamination av den bruksfärdiga substratlösningen, t.ex. genom användning av sterila spetsar Stopplösning (bruksfärdig) svenska 10

12 Pos: 27 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für nur ein D okument/testdurchführ ung/t establauf/enterovirus: T Pos: 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estdurchführung/testabl auf/t establ Pos: 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für mehrer e D okumente/t estdurchführ ung/m anuelle Testdurchführ ung (für ALLE Erreg er auß er C Översikt - testutförande SERION ELISA classic Enterovirus IgA/IgG/IgM kvantitativ analys Vid IgM-detektering genomförs absorption av reumafaktorn, se nr ; inkubering 15 minuter vid rumstemperatur eller över natt vid 4 C provspädning 1 (patientprov) IgA/IgM: IgG: Pipettera spädda prov och bruksfärdig kontroll eller standardserum i mikrotestbrunnarna (100 µl) INKUBATION 60 min vid 37 C fuktkammare TVÄTTA (4 x 300 µl tvättlösning DIL WASH )² Pipettera i konjugatlösning APC (100 µl) INKUBATION 30 min vid 37 C fuktkammare TVÄTTA (4 x 300 µl tvättlösning DIL WASH )² Pipettera i substratlösning pnpp (100 µl) INKUBATION 30 min vid 37 C fuktkammare Pipettera i stopplösning STOP (100 µl) AVLÄS EXTINKTIONEN vid 405 nm 1 Särskilda spädningsbuffertar för följande SERION ELISA classic-tester: Borrelia burgdorferi, IgG, IgM, EBV EA, IgG, Parvovirus B19, IgM, och Hantavirus Puumala, IgG, IgM 2 Vid manuell hantering: slå plattan vid avslutad tvättprocedur mot en pappershandduk. svenska 11

13 Pos: 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estdurchführung/automatische Manuellt testutförande 1. Placera erforderligt antal brunnar i ramen och ta fram ett protokollblad. 2. Tillsätt vardera 100 µl spätt prov eller bruksfärdiga kontroller i därför avsedda brunnar på mikrotiterteststripsen. Spara en brunn för substratblank, t.ex.: IgA/IgG/IgM kvantitativ brunn nr. brunn A1 brunn B1 brunn C1 brunn D1 substratblank negativ kontroll standardserum standardserum brunn E1 patient Provinkubation under 60 minuter (+/- 5 min) vid 37 C (+/- 1 C) i fuktkammare 4. Tvätta efter inkubationen alla brunnarna med tvättlösning (med automattvätt eller manuellt): - sug eller skaka ut inkubationslösningen - fyll varje brunn med 300 µl tvättlösning - sug eller skaka ut tvättbufferten - upprepa tvättproceduren 3 gånger (totalt 4 gånger!) - torka genom att slå mikrotiterplattan mot en pappershandduk 5. Tillsats av konjugat Tillsätt 100 µl av det bruksfärdiga IgA/IgG/IgM-konjugatet till de avsedda brunnarna (förutom i substratblanken) 6. Konjugatinkubation under 30 minuter (+/- 1 min)* vid 37 C (+/- 1 C) i fuktkammare 7. Tvätta efter inkubationen alla brunnarna med tvättlösning (se ovan) 8. Tillsats av substrat Tillsätt 100 µl av den bruksfärdiga substratlösningen i var och en av brunnarna (inklusive i brunnen för substratblank!) 9. Substratinkubation under 30 minuter (+/- 1 min)* vid 37 C (+/- 1 C) i fuktkammare. 10. Avbrytande av reaktionen Tillsätt 100 µl stopplösning i varje brunn, skaka försiktigt mikrotiterplattan för att blanda om. 11. Avläs extinktionen Avläs den optiska densiteten (OD) inom 60 minuter vid 405 nm mot substratblank, referensvåglängd mellan 620 nm och 690 nm (t.ex. 650 nm). * Notera att under speciella arbetsförhållanden kan laboratorieinterna anpassningar av inkubationstiderna vara nödvändiga. svenska 12

14 Pos: 31 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estdurchführung/positi vkontroll e / Richtigkeitskontroll 2 Pos: 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estauswertung/kapi tel überschrift: TESTAU SWER TUNG + Erreg Automatiserat testutförande SERION ELISA lämpar sig för utförande i automatiserad utrustning och utvärderas vid användning av Immunomat TM samt DYNEX DSX och DS2. Det automatiserade utförandet genomförs analogt med manuell användning. Notera att under speciella arbetsförhållanden kan laboratorieinterna anpassningar av inkubationstiderna vara nödvändiga. 7.7 Positiv kontroll och precisionskontroll För en regelbunden verifiering av testmetoden, i syfte att uppfylla kraven i laboratorieinterna kvalitetsstyrningssystem, rekommenderar vi användning av SERION ELISA controls för att bestämma precisionen och tillförlitligheten hos SERION ELISA classics testkörningar. Användning av SERION ELISA controls beskrivs i särskilda instruktionsmanualer. svenska 13

15 Pos: 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estauswertung/testauswertung: Testgültig kei 2 8 TESTUTVÄRDERING SERION ELISA classic Enterovirus IgA/IgG/IgM Pos: 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estauswertung/testauswertung: Ei n-punkt-quantifizi Enpunktskvantifiering enligt 4PL-metoden Användning av icke-linjära funktioner, vilka anpassar en sigmoidal kurva utan ytterligare transformation till OD-värden, ger bäst precision vid omvandling av mätvärden till kvantitativa värden. Bestämning av antikroppskoncentrationer med SERION ELISA classic genomförs med hjälp av 4 parameter logistic-log -modellen (4PL) som är idealisk för exakt kurvanpassning. Den baseras på formeln: OD = A e D - A B(C - ln konc.) Parametrarna A, B, C och D ger exakt kurvform och definierar: 1. den undre asymptoten parameter A 2. kurvans lutning parameter B 3. kurvans vändpunkt parameter C 4. den övre asymptoten parameter D Kurvan utvärderas för varje batch i upprepade testkörningar och vid optimala betingelser av Institut Virion\Serion GmbH (Würzburg, Tyskland). Kunden belastas inte med det tidsoch kostnadskrävande arbetet att ta fram en standardkurva. För utvärdering av antikroppskoncentrationer bifogas alla testkit från SERION ELISA classic en lotspecifik standardkurva samt en lotspecifik utvärderingstabell. Utvärderingsprogrammet SERION evaluate samt det Microsoft -Excel-baserade programvaruverktyget SERION activity finns att få på begäran. För att kompensera normala testvariationer och även för kontroll av testkörningar används ett standardserum i varje enskild testkörning. Genom tillverkarens kvalitetskontroll fastställs för detta kontrollserum ett referensvärde med ett giltighetsområde. Inom detta område garanteras en korrekt kvantifiering av antikroppskoncentrationen. svenska 14

16 Pos: 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estauswertung/auswertung: Ü 2 Pos: 36 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estauswertung/nichtautomatisierte Giltighetskriterier - Substratblanken måste uppvisa ett OD-värde på < 0,25. - Den negativa kontrollen måste ge ett negativt testresultat. - OD-medelvärdet måste, vid användning av de kvantitetsbestämmande SERION ELISA classic-testerna, (efter subtraktion av substratblanken!) för standardserumet ligga inom giltighetsområdet som ges på det lotspecifika kvalitetskontrollcertifikatet. - OD-värdenas variation för standardserumet får inte överstiga 20 %. Om dessa kriterier inte uppfylls är testet inte giltigt och måste upprepas. 8.3 Beräkningar i SERION ELISA classic Enterovirus IgA/IgG/IgM Icke-automatiserad utvärdering För utvärdering av SERION ELISA classics test medföljer i alla testkit ett lotspecifikt kvalitetskontrollcertifikat med standardkurva och en utvärderingstabell genom vilka de erhållna OD-värdena kan omvandlas till motsvarande antikroppsaktiviteter. Substratblanksvärdet måste subtraheras från alla OD-värden före utvärdering. Dokumente/Testauswertung/Testauswertung: Tetanus Pos: 37 /Arbeitsanleitungen & 5\mod_ _43.doc ELISA classic/gültig Methode für mehrere Tests außer Metod 1: Kvalitativ utvärdering För att fastställa cutoff-områdena multiplicerar man medelvärdet för den mätta optiska densiteten för standardserumet med de angivna numeriska uppgifterna från kvalitetskontrollcertifikatet (se formler för speciella utvärderingssystem), t.ex.: OD = 0,502 x MW(STD) vid övre cutoff-värdet OD = 0,352 x MW(STD) vid undre cutoff-värdet Vid ett uppmätt extinktionsmedelvärde på 0,64 för standardserumet ligger alltså cutoffområdet på 0,225 0,321. svenska 15

17 Pos: 39 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estauswertung/automatische Auswer 3 Metod 2: Pos: 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estauswertung/testauswertung: Methode 2 (für alle T Kontinuerlig bestämning av antikroppsaktiviteten med hjälp av standardkurvan Variabiliteten mellan analyserna (från dag till dag och mellan laboratorier) kompenseras genom multiplicering av det uppmätta värdet, för ett patientprov, med korrigeringsfaktorn F. Denna faktor beräknas enligt följande: F = OD-referensvärde (för standardserum) aktuellt OD-värde (för standardserum) Förfarandet är nödvändigt för att justera respektive normalisera användarens testresultat i förhållande till den lotspecifika standardkurvan. De dagliga avvikelserna måste först korrigeras genom att beräkna korrigeringsfaktorn F. 1. Medelvärdet av de två OD-värdena för standardserumet måste beräknas för att kontrollera att det ligger inom det angivna giltighetsområdet. 2. Beräkning av faktor F: det angivna referensvärdet delas med medelvärdet av standardserumets extinktion: F = extinktionsreferensvärdet för STD-serumet / medelvärdet för STD-serumets extinktion. 3. Alla värden som erhålls för patientproven multipliceras med F. 4. Antikroppsaktiviteten i IU/ml eller U/ml kan utläsas ur standardkurvan via de korrigerade värdena. svenska 16

18 Pos: 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estauswertung/quantifi 2 Pos: 41 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für mehrer e D okumente/t estauswertung/grenzwertber eich ( für T este mehrerer 2 Pos: 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estauswertung/kapi tel überschrift: Interpretation der Automatisk testutvärdering med programvaran SERION evaluate Efter inmatning av de fyra parametrarna och referensvärdet för standardserumet beräknas antikroppsaktiviteten on-line med programvaran SERION evaluate från bearbetade och mätta testkörningar med SERION ELISA classic. Om standardens optiska densitet ligger utanför giltighetsområdet visas följande meddelande. Standardvärdena ligger utanför områdena i följande grupper: Grupp eller Standardvärdena avviker mer än 20 % i följande grupper: Grupp I dessa fall är testkörningen inte giltig och måste upprepas. Parametrar och referensvärden behöver endast förändras om ny lot tas i bruk (utvärderingstabellen visar parametrar och referensvärden). Korrekt inmatning av de lotspecifika uppgifterna kan kontrolleras utgående från den standardserumaktivitet (i IU/ml eller U/ml) som anges för standardserumet. Det beräknade aktivitetsmedelvärdet måste motsvara värdet som anges på det lotspecifika certifikatet. De mätta värdena korrigeras automatiskt. I standardversionen visar utskriften följande: Provkod OD-värde IU/ml eller U/ml Utvärdering 8.4 Kvantifieringsgränser Kvantifieringsgränserna specificeras på SERION ELISA classics kvalitetskontrollcertifikat. Spädningens rätlinjighet inom detta område har visats i omfattande utvärderingsstudier. Om testresultatet för patientprovet ligger över den övre kvantifieringsgränsen kan provet testas igen i en högre spädning. Den fastställda antikroppsaktiviteten måste i detta fall multipliceras med den ytterligare spädningsfaktorn. 8.5 Gränsvärdesområden Gränsvärdesområdena för SERION ELISA classic Enterovirus IgA/IgG/IgM specificeras på kvalitetskontrollcertifikatet och anger området för gränsvärdesresultaten. Erhållna värden vid test av ett patientprov som faller under detta område anger ett negativt testresultat; värden över gränsvärdesområdet tolkas som positiva. Någon definitiv slutsats är omöjlig att dra i de fall där resultaten ligger inom gränsvärdesområdet. I sådana fall bör testet upprepas parallellt med ett uppföljningsprov som tas en eller två veckor senare (serumpar). svenska 17

19 Pos: 44 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/t estauswertung/kapi tel überschrift: Refer enzbereiche gesunder Pr Tolkning av resultat Pos: 43 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für nur ein D okument/testauswertung/enter ovirus/enterovir us: Inter pretati on der Antikroppar som bildats till svar på enterovirusinfektioner kan delas in i homotypiska och heterotypiska populationer med olika specificitet. Homotypiska antikroppar riktas mot serotypspecifika epitoper medan heterotypiska immunglobuliner känner igen epitoper som bevarats bland de olika serotyperna. Korrelation mellan nivåer av heterotypiska till heterotypiska antikroppar i en patients serum kan variera beroende på ålder och socioekonomisk status. Andelen heterotypiska antikroppar stiger i allmänget med ålder på grund av ökande exponering för enterovirussubtyper. Testerna i SERION ELISA classic Enterovirus IgA, IgG och IgM är baserade på en blandning av rekombinanta antigener som härstammar från bevarade och subtypspecifika epitoper på VP1-proteiner på coxsackievirus B1, B2 och B5 samt ECHO-virus E6 och E9. Testerna "SERION ELISA classic Enterovirus" möjliggör därmed påvisande av heterotypiska antikroppar riktade mot de bevarade epitoperna på VP1-proteiner och detektion av infektioner orsakade av andra enterovirusserotyper. Dessutom är testerna "SERION ELISA classic Coxsackievirus" lämpliga för bestämningen av heoptypiska antikroppar riktade mot subtypspecifika epitoper på VP1-proteinerna på coxsackievirus B1, B3 och B5 samt ECHO-virus E6 och E9. För att påvisa en akut infektion genom detektion av specifika antikroppar krävs i regel analys av ett serumpar. Ett positivt resultat för IgM eller IgA i kombination med stigande IgG-aktivitet utgör entydigt bevis för en akut eller nylig infektion. Ett positivt resultat i testet "SERION ELISA classic Enterovirus IgG" från ett enstaka serumprov utgör inte avgörande belägg för en pågående infektion. Analys av ett serumpar (ett första serum i början av kliniska symtom och ytterligare ett serum taget cirka 14 dagar senare) krävs för att ställa en avgörande diagnos. Gränsvärdesintervallet för testerna "SERION ELISA classic Enterovirus IgG" har valts för att reflektera den höga bakgrundsnivån för seropositiviteten i populationen. Positiva testresultat när testerna "SERION ELISA classic Enterovirus IgA och IgM" används, som inte nödvändigtvis är positiva i testet "SERION ELISA classic Enterovirus IgG", är i sällsynta fall möjliga. En definitiv diagnos kräver den kliniska bilden och analys av serumpar. I extremt sällsynta fall kan falskt negativa testresultat framkomma ur prover från patienter som främst bildar homotypiska antikroppar enbart riktade mot den enskilda serotypen och till följd eventuellt inte påvisas av testet "SERION ELISA classic Enterovirus " Persisterande IgM- och IgA-antikroppar (> 6 månader) observeras ofta vid kronisk sjukdom, t.ex. kronisk hjärtsjukdom och typ 1-diabetes. Korsreaktioner mellan enterovirus och hepatit A-virus, Epstein-Barrvirus (EBV), cytomegalovirus (CMV), rhinovirus och mykoplasma har beskrivits. svenska 18

20 Pos: 46 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/leistungsmer kmale/kapi tel überschrift Leistungsmer 1 Pos: 47 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/leistungsmer kmale/kapi tel überschrift: Sensiti vität und Spezi 2 Pos: 49 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für all e D okumente/elisa classic/leistungsmer kmale/kapi tel überschrift Präzisi Referensområde för friska individer Pos: 45 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für nur ein D okument/testauswertung/enter ovirus/enterovir us: R eferenzbereich gesunder Analys av slumpvisa bloddonatorers serum, som uppsamlats i södra Tyskland, med testerna i SERION ELISA classic Enterovirus IgA, IgG och IgM resulterade i följande fördelning. Av 104 serum som undersöktes med IgA-testet i SERION ELISA classic Enterovirus var 94 (90,4 %) negativa, sju serum (6,7 %) reagerade positivt och tre serum (2,9 %) ansågs ligga på gränsen. Av 50 serum var 46 (92,0 %) negativa när de analyserades med IgG-testet i SERION ELISA classic Enterovirus, tre (6,0 %) serum gav ett positivt resultat och ett prov (2,0 %) bedömdes ligga på gränsen. Dessutom uppvisade resultaten vid IgM-testning av 50 serum i SERION ELISA classic Enterovirus följande: 49 (98,0 %) var negativa, inget serum var positivt positivt och ett (2,0 %) prov gav ett gränsvärde. 9 PRESTANDA 9.1 Sensitivitet och specificitet Pos: 48 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/gültig für nur ein D okument/leistungsmer kmal e/enter ovirus/enterovir us: Sensi ti vität und Spezifi Prestationsegenskaperna för testerna SERION ELISA classic Enterovirus IgA, IgG och IgM beräknades med hjälp av resultat från en intern studie som använde sig av mer än 40 sera från patienter med misstänkt pågående infektion, i tillägg till över 80 sera från bloddonatorer och gravida kvinnor. Analyserna validerades med hjälp av SERION ELISA classic-testerna baserat på inaktiverade viruspartiklar som referens. Gränsvärdesresultat användes inte i beräkningarna.av sensitivitet och specificitet. Prestationsegenskaper Sensitivitet Specificitet SERION ELISA classic Enterovirus IgA 93,8 % 97,7 % SERION ELISA classic Enterovirus IgG 92,0 % 95,3 % SERION ELISA classic Enterovirus IgM 93,3 % 96,7 % svenska 19