ADHERERANDE TROMBOCYTER OCH P-SELEKTIN. Etik ansvarsfrågor, yrkesetiska koden Glykosylerat hemoglobin ISO/IEC och ackreditering.

Transkript

1 Nr 1 Februari 2001 Tidskrift för Institutet för biomedicinsk laboratorievetenskap ADHERERANDE TROMBOCYTER OCH P-SELEKTIN sid 4-9 Etik ansvarsfrågor, yrkesetiska koden Glykosylerat hemoglobin ISO/IEC och ackreditering

2 I oktober disputerade Per A. Whiss vid Hälsouniversitetet I Linköping på avhandlingen Platelet adhesion and P-selectin surface expression. För Laboratoriet har han skrivit följande artikel som ger en bakgrund till och sammanfattar avhandlingen. Trombocyters adhesion och membranuttryck av adhesionsmolekylen P-selektin När ett blodkärl skadas aktiveras trombocyter (blodplättar) och adhererar (vidhäftar) till skadan för att stoppa blödning. I skadan startar sedan en inflammationsprocess som är medierad av bl.a. glykoproteinet P-selektin. Trombocyter exponerar P-selektin på ytan och leukocyter, som bekämpar infektioner, kan ansamlas i skadeområdet. Vid vissa tillstånd kan aktivering av trombocyter även leda till blodpropp och hjärtinfarkt. Avhandlingen presenterar ett modellsystem för att experimentellt studera hur trombocyters adhesion och exponering av P-selektin regleras och hur detta kan påverkas experimentellt. Studierna visar att ämnen som efterliknar kroppsegna mekanismer, bl.a. biokemiska substanser som frisätter kväveoxid (NO), och nikotin, metalljoner som t.ex. magnesium, samt njur- och tarmsjukdom kan påverka trombocyters exponering av P- selektin. Ökad kunskap om hur trombocyter adhererar och reglerar bl.a. inflammation kan leda fram till ny diagnostik och behandling av sjukdomar som berör hjärt-kärlsystemet och inflammationsprocessen. Hemostasen startar reparationen Hemostas är den process där aktiverade trombocyter och koagulationsfaktorer samverkar för att förhindra blödning från skadade blodkärl. Denna process måste även återställa och upprätthålla cirkulationen i skadade blodkärl när blödningen har stoppats. Det krävs således att både aktiverande och inhiberande mekanismer gasen och Figur 1A. Trombocyter aktiveras vid en kärlskada när subendotelialt kollagen exponeras. Trombocyten (grön) närmast kärlskadan ändrar form och adhererar till kollagen via glykoprotein (GP) Ia/IIa samt GPIb/IX/V och von Willebrand faktor. P-selektin mobiliseras från intracellulära granula och uttrycks på trombocytens plasmamembran. Trombocyt-trombocyt adhesion (trombocytaggregation) medieras via plasmaproteinerna fibrinogen eller von Willebrand faktor och GPIIb/IIIa. Infektiösa partiklar illustreras längst ned till höger i kärlskadan. bromsen för hemostasen fungerar optimalt. Om aktiverande mekanismer dominerar, eller om inhiberande inte är tillräckliga, kan blodproppar i värsta fall orsaka hjärtinfarkt eller stroke. För att återställa funktionen i skadade blodkärl krävs även att hemostasen övergår i en läkningsprocess 4 LABORATORIET 1/2001

3 Figur 1B. Aktiverad trombocyt som adhererat till kärlskada exponerar P-selektin. Från vänster till höger illustreras lymfocyt, monocyt och neutrofil granulocyt som uttrycker P-selektin ligand och därmed kan binda till trombocyten. och att eventuell infektion bekämpas i skadan. P-selektin är ett glykoprotein som upptäcktes på aktiverade trombocyters plasmamembran under första hälften av 1980-talet. Detta protein har i senare studier uppvisat flera funktioner som kan överföra trombocyters aktivering till både koagulation, infektionsförsvar och läkningsprocess. Trombocytaktivering Insidan av intakta och friska blodkärl är uppbyggd av ett lager med endotelceller. Dessa celler utgör en antiadhesiv yta för bl.a. trombocyter och underliggande matrixproteiner avgränsas från blodet. Endotelet producerar även kontinuerligt ett antal ämnen, t.ex. NO, som lokalt reglerar bl.a. hemostas och kärltonus. När ett blodkärl skadas aktiveras trombocyter och andra cirkulerande komponenter i blodet. Aktiveringen startar när extracellulära matrixproteiner eller så kallad subendotelial vävnad exponeras. Olika typer av kollagen bildar en dominerande del av subendotelial vävnad. Vid kontakt med kollagen adhererar trombocyter direkt via kollagenreceptorer eller indirekt via proteinet von Willebrands faktor (vwf) (Figur 1A). Även fibrinogen, från plasma eller aktiverade trombocyter, såväl som fibrin, som bildats i koagulationskaskaden, kan immobilisera vid kärlskador och bilda en adhesiv yta för trombocyter. Både kollagen- och fibrinogenreceptorer uttrycks konstant på trombocyternas plasmamembran. Vid trombocytaktivering sker en formförändring av fibrinogen-receptorn så att detta protein kan binda till receptorn och mediera trombocyt-trombocyt adhesion, oftast benämnd som trombocytaggregation. När trombocyter aktiveras dyker även nya receptorproteiner upp på membranet. Ett sådant är P-selektin. Detta glykoprotein finns normalt lagrat i trombocyternas granula men mobiliseras och uttrycks på plasmamembranet vid aktivering. P-selektin är således en aktiveringsmarkör på trombocyter. P-selektin P-selektin är en av de tre medlemmar som tillhör selektin-familjen av adhesionsmolekyler. Ett kännetecken för selektiner är att de binder till kolhydratstrukturer på olika celltyper, och alltså inte till andra proteiner. P-selektin uttrycks, förutom på aktiverade trombocyter, även på aktiverade endotelceller. Trots att man hittade P-selektin på trombocyter innan man hittade samma glykoprotein på endotelceller, så blev funktionen av P-selektin på endotel klarlagd tidigare. Vid en inflammationsprocess så reglerar endotelets P-selektin, tillsammans med de andra två familjemedlemmarna E- och L-selektin, den initiala och svagare adhesionen eller rollingen av leukocyter på endotelet. I den senare fasen reglerar andra adhesionsmolekyler, integriner och immunoglobulin-liknande proteiner, kraftigare adhesion som följs av leukocytmigration från cirkulationen till inflammationshärden. Vid en mer mekanisk kärlskada som leder till blödning kan trombocyters P-selektin förmodligen reglera utvandring av leukocyter till subendotelial vävnad på samma sätt som endotelets P-selektin. Man har funnit att de flesta typer av leukocyter uttrycker ligander som kan binda till P-selektin och därmed mediera trombocytleukocyt adhesion (Figur 1B). Trombocyterna stoppar alltså inte bara blödning utan reglerar även, via bl.a. P-selektin, leukocyters invandring i kärlskadan. På detta sätt kan infektiöst material tidigt bekämpas i skadeområdet (Figur 1C). P-selektin kan inducera monocyters syntes och uttryck av vävnadstromboplastin, även benämnt som tissue factor eller koagulationsfaktor III. Aktiverade trombocyter tillhandahåller därför inte bara en prokoagulativ yta (fosfatidylserin) utan kan även på ett potent sätt aktivera koagulationen via inducering av tissue factor på monocyter. P-selektin på aktiverade trombocyter har också föreslagits kunna reglera cirkulationen av lymfocyter mellan blod och lymfvävnad. Adhesionen mellan trombocyter och leukocyter möjlig- LABORATORIET 1/2001 5

4 vändbarheten illustrerades genom att vi visade att en NO-frisättande substans kunde inhibera trombin-inducerat P-selektin uttryck (1). När trombocyterna var fixerade kunde de förvaras minst en vecka i +4 C utan att resultaten påverkades. Ett antal olika monoklonala antikroppar har testats i metoden och de flesta fungerar tillfredsställande men uppvisar aktiveringsberoende skillnader (2). Denna trombocyt-elisa kan således användas för att studera hur både fysiologiska och experimentella ämnen påverkar membranuttryck av P-selektin på isolerade trombocyter. Figur 1C. Neutrofil granulocyt, som mobiliserat i kärlskadan via P-selektin på trombocyten, migrerar till infektiösa partiklar för att bekämpa dessa. gör, förutom reglering av leukocytlokalisation, en intim kommunikation med ett flertal lösliga mediatorer. Den täta kontakten mellan dessa celler leder till hög lokal koncentration i den så kallade mikromiljön och cellerna kan på detta sätt interagera effektivt. Trombocyt-ELISA De väl beprövade analyser som idag används kliniskt för att bestämma primär hemostas är partikelkoncentration av trombocyter samt blödningstid. Idag använder flera större laboratorier även flödescytometri för att bestämma uttrycket av olika adhesionsreceptorer på trombocyter. Den mest använda metodiken för att studera trombocytfunktion är aggregometri, som man oftast mäter enligt den turbidimetriska original-varianten. Både flödescytometri och turbidimetrisk aggregometri mäter trombocytfunktionen i lösning och inte i samband med adhesion på en yta. Under 1995 startade vi en studie för att försöka utveckla en ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) för att bestämma plasmamembran-uttrycket av P-selektin på trombocyter. I denna metod skulle trombocyterna först bindas till eller coata en mikroplatta för att man sedan skulle kunna detektera membranuttrycket med antikroppar. Membranuttryck av P-selektin och andra adhesionsreceptorer hade tidigare studerats med bl.a. radioimmunologisk analys och flödescytometri. Jämfört med dessa tekniker så skulle ELISA-metoden vara enklare och billigare samt lättare att genomföra på fler laboratorium eftersom den utrustning som krävs för ELI- SA är mer tillgänglig. För att studera trombocyter i frånvaro av bl.a. koagulationsfaktorer i plasma och för att minska risken för aggregation så isoleras trombocyterna från plasma och resuspenderas i en buffertlösning. Silikoniserande rör med tillsatts av citrat/citronsyra/ glukos samt både acetylsalicylsyra och apyras, som hindrar frisättning av tromboxan respektive adenosin-difosfat (ADP), användes för att förhindra trombocytaktivering under provinsamlingen och isoleringsproceduren. Trombocytsuspensionen behandlades med kända aktiverande och inhiberande ämnen och fixerades med en svag formaldehydlösning innan den tillsattes i 96-håls mikroplattor av högbindande polystyren. Efter den påföljande centrifugeringen coatar trombocyterna botten på brunnarna och primära och sekundära enzymkonjugerade antikroppar kan användas för att detektera P-selektin och andra membranuttryckta markörer. Arbetet på vägen till en användbar metod bestod bl.a. i att finna optimala koncentrationer av trombocyter och antikroppar, samt lämpliga förfaranden och förhållanden för inkubering, fixering, centrifugering, tvätt och detektion. Resultaten från denna metodutveckling publicerades 1997 (1) och visade att några kända trombocytaktivatorer dos- och tidsberoende ökar uttrycket av P-selektin på isolerade trombocyter. En senare sammanställning av flera, både svaga och kraftiga, aktivatorers tidsberoende effekt visas i Figur 2. Den farmakologiska an- Frisättning av P-selektin från trombocyter Trombin är en av de kraftigaste trombocytaktivatorerna som man känner till. Vid metodutvecklingen använde vi trombin för att aktivera trombocyterna maximalt och för att följaktligen få trombocyterna att uttrycka maximalt med P-selektin på plasmamembranen. Det vi observerade med den dos trombin som gav maximal effekt var emellertid en minskning av uttrycket någon minut efter en snabb topp. Internaliserades P-selektin igen eller lossnade det från membranen? För att försöka ta reda på detta bestämde vi koncentrationen av lösligt P-selektin i trombocytsuspensionen. Vi fann att både membranbundet och lösligt P-selektin korrelerade vid de flesta förhållanden som testades. Isolerade trombocyter som aktiveras mobiliserar alltså P-selektin från intracellulära granula för membranuttryck, men en viss mängd P-selektin frisätts och kan detekteras i löslig form (3). Förhållandet mellan membranbundet och lösligt P-selektin varierar och är aktiveringsberoende. NOfrisättande substanser inhiberar t.ex. både membranbundet och lösligt P-selektin i trombocytsuspension på ett likartat sätt efter trombin-aktivering. Vad har då det fria lösliga P-selektinet för effekt och funktion? Eftersom lösligt P-selektin kan binda till leukocyter in vitro är det mycket möjligt att det har en effekt även in vivo. Lösligt P-selektin kan minska bindningen till membranbundet P-selektin bara genom att konkurrera om bindningsplatsen. Experimentella studier visar även att lösligt P-selektin kan stimulera neutrofila granulocyters rörelseförmåga och därigenom reglera t.ex. inflammationsprocessen (4). Således kan lösligt P-selektin fungera kemotaktiskt och 6 LABORATORIET 1/2001

5 andra aktivatorer, jämfört med friska kontroller (7). Det var ingen skillnad i lösligt P-selektin vid någon av de studerade sjukdomarna jämfört med friska kontroller. Således kan trombocytdefekter vid olika sjukdomstillstånd observeras med trombocyt-elisa. För att utröna vilken betydelse och nytta man kan ha av dessa resultat krävs emellertid mer omfattande studier. Skulle man exempelvis kunna använda denna typ av analys för att på ett tidigt stadium bedöma graden av trombocytpåverkan vid sjukdom och risk för kardiovaskulära komplikationer eller effekt av behandling? Figur 2. Uttryck av P-selektin på isolerade humana trombocyters plasmamembran (absorbans vid 405 nm) bestämt med ELISA efter inkubering med olika kända aktivatorer. Buffert (kontroll), kollagen (10 µg/ml), adrenalin (10 µm), adenosindifosfat (ADP, 10 µm), adrenalin + ADP ( µm), ristocetin (1,25 mg/ml), phorbol myristate acetate (PMA, 0,1 µm) och trombin (0,1 U/ml) inkuberades med trombocyter i rumstemperatur. Efter tre (grå staplar) och tio minuter (svarta staplar) fixerades trombocyterna med formaldehyd. Inkubering med primära monoklonala antikroppar riktade mot P-selektin följdes av inkubering med sekundära enzymkonjugerade antikroppar riktade mot den primära antikroppen. Tio minuter efter tillsats av substrat avlästes absorbansen vid 405 nm. Data presenteras som medelvärde och standard error of the mean (SEM) och representerar trombocyter från 7-14 friska blodgivare för varje testsubstans. mobilisera leukocyter på avstånd, medan membranbundet P-selektin medierar en fysisk kontakt mellan trombocyter och leukocyter för att främja dessa cellers intima interaktioner. P-selektin på trombocyter vid sjukdom Eftersom trombocyter är så känsliga för aktivering så kan i princip varje form av tillstånd, behandling eller sjukdom som påverkar trombocyter även orsaka en ökning av P-selektin. Ökningen kan detekteras antingen membranuttryckt på trombocyter eller i löslig form. Nivån av någon av dessa former P-selektin kan därför användas för att bedöma graden av trombocytaktivering vid olika riskfaktorer, sjukdomar eller behandlingar. Ett stort antal publikationer visar att trombocytbundet såväl som lösligt P-selektin ökar vid ett flertal kardiovaskulära sjukdomar. Ett exempel på en riskfaktor som vi observerat orsakar en svag, men ändå tydlig och dosberoende, ökning av P-selektin på isolerade trombocyter är oxiderat LDL (low density lipoprotein) (5). Vi har använt trombocyt-elisa för att studera trombocytfunktionen vid två olika sjukdomstillstånd med tidigare beskriven trombocytpåverkan: inflammatorisk tarmsjukdom och nedsatt njurfunktion. Inflammatoriska tarmsjukdomar innefattar ulcerös kolit och Crohns sjukdom, båda med okänd etiologi. Vid dessa sjukdomar har trombocytdysfunktion observerats och ärftliga koagulationsdefekter verkar faktiskt minska risken för sjukdomarna. Med trombocyt-elisa observerade vi ett ökad basaluttryck av P- selektin på trombocyter från patienter med inflammatorisk tarmsjukdom i remission jämfört med friska kontroller (6). Njursjukdom är också förknippad med defekt trombocytfunktion och kardiovaskulär risk. I en studie på patienter med nedsatt njurfunktion uppvisade trombocyter från dessa patienter en lägre nivå av P-selektin vid aktivering med trombin, men inte Trombocyt-ELISA vid farmakologiska studier Cykliska nukleotider spelar en viktig roll vid reglering av trombocytfunktionen genom att bromsa den ökade koncentrationen av cytosoliskt Ca 2+ som uppstår vid trombocytaktivering. Vi har med trombocyt-elisa visat att NO-frisättande substanser, som ökar cykliskt GMP, minskar trombinmedierat P-selektin uttryck (1, 2). Vi har även visat att cykliskt GMP ökande NO kan samverka med cykliskt AMP ökande substanser, som t.ex. adenosin, för att inhibera uttryck av P-selektin på trombocyter (8, 9). Dessa studier visar effekter av påverkan in vitro och i slutet av 1996 startade vi en studie för att utröna om trombocyt-elisa även kunde detektera biokemiska ämnens effekter på trombocyter ex vivo. Cigarettrökning är kanske den vanligaste orsaken till sjukdom och dödlighet i industrialiserade länder som faktiskt går att undvika. Att trombocyter och blodkärl påverkas negativt av rökning är allmänt accepterat, men det är inte klarlagt om nikotin är en direkt orsak till detta. Cigarettrök innehåller flera tusen andra ämnen utöver nikotin. Det är viktigt att känna till om nikotin har en direkt negativ effekt på trombocyter eftersom behandling med nikotin-produkter, som t.ex. plåster och tuggummi, används vid rökavvänjning. Detta är särskilt betydelsefullt om man behandlar patienter som löper ökad kardiovaskulär risk, som t.ex. njursjuka. Nikotin-produkter kan även vara av terapeutiskt intresse vid t.ex. ulcerös kolit, och vid Parkinsons och Alzheimers sjukdom. För att studera om nikotin har en direkt effekt på trombocytfunktionen testade vi ett flertal trombocytpara- LABORATORIET 1/2001 7

6 metrar i samband med intravenös infusion av nikotin på friska kontroller och patienter med nedsatt njurfunktion (7). Alla individer i studien var cigarettrökare eller snusare och blodprov togs före, direkt efter och 2 timmar efter infusion av nikotin. De trombocyt-tester som utfördes var bl.a. aggregation, uttryck av fibrinogen, von Willebrands faktor och P-selektin bestämt med flödescytometri, samt P-selektinuttryck med ELISA. Dessutom bestämdes även plasmakoncentrationerna av nikotin och huvudmetaboliten kotinin, NO metaboliter, lösligt P-selektin och några trombocytspecifika proteiner. De enda analyser som påverkades signifikant var trombocytaggregation i helblod och P-selektinuttryck på isolerade trombocyter med ELISA. Kollageninducerad aggregation hämmades reversibelt direkt efter infusionen. P-selektinuttryck med ELISA ökade 2 timmar efter infusionen vid stimulering med de flesta aktivatorer. Dessa resultat kan betyda att direkteffekten av nikotin på trombocyter in vivo är kortvarig och hämmande. En senare effekt är ökad trombocytaktivering och skulle kunna vara indirekt medierad via nikotin-inducerat adrenalinpåslag. Adrenalin är en svag trombocyt-aktivator som ökar effekten av andra aktivatorer. Dessa resultat kan förklara en del av alla de motsägelsefulla resultat som publicerats om cigarettrökningens och nikotinets effekt på trombocyter. Kombinerad adhesion och P-selektin bestämning Eftersom trombocyternas fysiologiska funktion är att adherera till en yta som signalerar kärlskada så har min senaste forskningtid fokuserats på att försöka få fram en metod där trombocyters P-selektinuttrycket i samband med adhesion till en yta kan studeras. Tidigare publikationer har visat att adhesionen kan bestämmas genom att man utnyttjar ett intracellulärt enzym i trombocyter (10). Om man sedan använder samma förfarande som för trombocyt-elisa så kan man studera hur olika ytor påverkar trombocyternas membranuttryck av membranreceptorer (11). Initiala studier om hur olika faktorer påverkar trombocytadhesionen visade att koncentrationen av divalenta katjoner har mycket stor betydelse. Magnesiumjoner är avgörande för adhesion till både kollagen och fibrinogen medan kalciumjoner främst påverkar adhesionen till fibrinogen. Kalciumjoner kan faktiskt även hämma magnesiumberoende adhesion. Vid adhesion av isolerade trombocyter till både kollagen och fibrinogen verkar magnesium fungera som gas och kalcium som broms. Magnesiumberoende trombocytadhesion till kollagen orsakar ett ökat uttryck av P-selektin jämfört med motsvarande adhesion på fibrinogen (12). Sammanfattningsvis visar resultaten med dessa kombinerade adhesion och P-selektin mätningar att tillgången på divalenta katjoner tillsammans med ytan reglerar graden av trombocyters adhesion och P-selektinuttyck. Förhoppningsvis kan detta modellsystem för trombocytadhesion och bestämning av uttryck av bl.a. P-selektin öka förståelsen för hur trombocyter aktiveras och reglerar påföljande processer, som t.ex. inflammation och sårläkning, vid en kärlskada. Man skulle exempelvis kunna studera om ett presumptivt läkemedel påverkar P-selektin uttryck utan att påverka trombocytadhesionen. På detta sätt kan man separera mekanismer som mestadels har betydelse för inflammationsprocessen från mekanismer som mestadels har betydelse för hemostasen. Slutsatser Trombocyters adhesion och aktivering spelar en en avgörande roll för hemostasen men kan även reglera inflammation och läkningsprocess. Ett modellsystem för att studera trombocyters kommunikation med leukocyter, i samband med adhesion till ytor som efterliknar kärlskada, kan öka kunskapen om hur dessa processer regleras. Ökad kunskap kan leda fram till mer specifik farmakologisk behandling av kardiovaskulära komplikationer, som t.ex. bildning av blodproppar. I framtiden kan även ett förenklad modellsystem för trombocytadhesion vara användbart för att diagnostisera trombocytdefekter och bedöma effekten av farmakologisk behandling. PER A. WHISS Biomedicinsk analytiker, Med Dr Avd. för Farmakologi vid Hälsouniversitetet i Linköping och Inst. för Naturvetenskap och Biomedicin vid Hälsohögskolan i Jönköping Referenser 1. Whiss, P.A., Andersson, R.G.G., and Srinivas, U. (1997) Modulation of P-selectin expression on isolated human platelets by an NO donor assessed by a novel ELISA application. J Immunol Methods 200: [published erratum appears in J Immunol Methods 1997;206:183]. 2. Whiss, P.A. (2000) Platelet P-selectin: A link between outflow and inflow host defence. In: Pandalai, S.G. (ed.) Recent Research Developments in Immunology. Research Signpost: Trivandrum, India, Vol. 2, Part I, pp Whiss, P.A., Andersson, R.G.G., and Srinivas, U. (1998) Kinetics of platelet P-selectin mobilization: Concurrent surface expression and release induced by thrombin or PMA, and inhibition by the NO donor SNAP. Cell Adhes Commun 6: Bengtsson, T., Frydén, A., Zalavary, S., Whiss, P.A., Orselius, K., and Grenegård, M. (1999) Platelets enhance neutrophil locomotion: evidence for a role of P-selectin. Scand J Clin Lab Invest 59: Whiss, P.A. (2000) Platelet adhesion and P-selectin surface expression, Medical dissertation, Faculty of Health Sciences, Linköpings universitet. 6. Fägerstam, J.P., Whiss, P.A., Ström, M., and Andersson, R.G.G. (2000) Expression of platelet P-selectin and detection of soluble P-selectin, NPY and RANTES in patients with inflammatory bowel disease. Inflamm Res 49: LABORATORIET 1/2001