Säkring av hygienisk standard i bevattningsvatten till frilandsodlade grönsaker

Transkript

1 Dnr. V Säkring av hygienisk standard i evattningsvatten till frilandsodlade grönsaker Slutrapport Beatrix Alsanius, professor, och Malin Hulterg, docent SLU, Område Hortikultur, Enheten Hortikulturell mikroiologi Box 103, Alnarp eatrix.alsanius@slu.se Slutsater Hygienisk standard i ytvatten som används för evattning av frilandsgrödor Bevattningsvattnets kvalitet från ytvattenkällor är sämre än sitt rykte. Alla källor hamnar över något gränsvärde någon gång under säsongen Signikanta skillnader mellan runnsvatten och övriga källor i ett säsongs- och kortsiktigt perspektiv Stora variationer inom provtagningstillfälle och plats - 3 upprepningar är inte tillräckliga! Signifikanta skillnader mellan vissa provtagningsplatser Salmonella spp. förekom i fyra av fem ytvattenkällor upprepade gånger. Provtagningsrutinerna för att konstatera Salmonella i evattningsvatten ehöver ses över. Möjligheter till att tillämpa operativa normer enligt den kanadensiska och tyska modellen i Sverige ehöver undersökas. Detta earetas i ett parallellt projekt som finansieras av Tillväxtfonden inom ramen för Tillväxt Trädgård. Samspel mellan odlad kultur, halten E. coli i evattningsvatten och skördetillfälle E, coli överlever på persilja, ruccola och spenat under minst 3 dygn efter evattning med smittat vatten. Överlevnadskvoten är eroende av mängden smitta i vattnet. Detta tyder på att E, coli anpassar livsstilen på produkten med hänsyn till förekomsten i vattnet, ett fenomen som är väldokumenterat i litteraturen för andra organismer. Den sjukdomsframkallande dosen hos EHEC ligger vid 1-10 celler. Detta etyder att även 72 h efter evattning hade 100 g persilja innehållit tillräckligt mycket smitta för att framkalla sjukdom. Mål Projektets övergripande syfte är att skapa förutsättningar för en uthållig produktion av ladgrönsaker av högsta kvalitet som är fri från humanpatogener. Studiens detaljmål är att - Följa upp halter på indikatororganismer för hygienisk standard (heterotrofa mikroorganismer, koliforma akterier, E. coli) i ytvattnet som används till evattning av frilandsgrönsaker och att - Undersöka samspelet mellan odlad kultur, halten Escherichia coli (E. coli) i evattningsvattnet och intervall mellan evattnings- och skördetillfället. Förväntat resultat Undersökningen kommer att ge (1) en kort- och långsiktig ild över den hygieniska status i ytvattenkällor som används för evattning och (2) en indikation på lämpliga tröskelvärden för tjänlighet av evattningsvatten hos frilandsodlade grönsaker och är, avsedda för direktkonsumtion.

2 Bakgrund Odling av frukt, är och grönsaker på fält och under kontrollerade etingelser kräver konstevattning och som vattenkällor används orr-, kommunalt eller ytvatten. Dessa vattenkällor håller åde hygieniskt och kemiskt olika kvalitet. Användning av ytvatten som evattningsvatten vid odling av frilandsgrönsaker är mycket vanligt. I Halland och Mellansverige är ytvatten den vanligaste råvattenkällan vid evattning av frilandsgrönsaker. Denna vattenkälla kan dock medföra en förhöjd risk för spridning av invasiva enteriska mikroorganismer (Rosén & Frierg 1995). Campyloacter jejuni, Escherichia coli, Salmonella sp., Shigella sp. och Yersinia enterocolitica har nämnts i detta sammanhang (Schulze 1996, Brennhovd et al. 1992). Dessa organismer orsakar gastroenterit och diarrér (Krämer 2002). Fram tills år 2004 ansågs risken för spridning av tarmsmittor med frukt och grönt som ringa. Men faktum är att utrott med matförgiftningar relaterade till frukt och grönt har stadigt ökat sedan mitten på niotalet. I samand med utrott har tarmsmittor spårats till åde importerat och inhemska produkter. Sommaren/hösten 2005 lev spridning av humanpatogener patogener genom grönsaker särskilt aktuellt i Sverige efter att utrott av EHEC, en agressiv grupp av E. coli som orsakar hemoragisk kolit och i vissa fall njursvikt, satts i samand med frilandsodlad isergssallad (Alinh & Berggren 2005). Bevattningsvattnet har varit vektorn för andra humanpatogener till grönsaker, land dessa t.ex. hepatit A virus, Norovirus, Rotavirus, Adenovirus samt parasitiska protozoa (Alsanius et al. 2010). Konsekvenserna av användning av hygieniskt olämpligt vatten vid evattning av frilandsgrönsaker inneär dels en påtaglig ekonomisk förlust i odlarleden, dels ett markant stopp i försäljningsleden samt en negativ attityd från konsumenternas sida. Odlaren som draades av EHEC-incidenten sommaren/hösten 2005 förlorade drygt en miljon kronor. Den ekonomiska förlusten kan dock vara mycket mer etydande om incidenten inträffar tidigare på säsongen. Försäljningsnedgång som följd av ett utrott draar inte enart den specifika produkten utan också andra liknande produkter inom samma grupp, t.ex. jordguar efter ett utrott relaterat till hallon. Vid sidan av företagsekonomiska aspekterna leder utrott genom matförgiftningar till påtagligt, och iland mångårigt lidande, kostnader genom inkomstortfall samt ökade kostnader för sjukvården. Tarmsmittor kan spridas inom hela produktionssystemet från jord till ord. I ett odlingsperspektiv har organiskt gödsel och vatten pekats ut som dominanta källor för smittspridning. Andra källor är skörderedskap, vilda och tamdjur, människor. Personlig hygien och rening av redskap är också viktiga faktorer. I samand med diskussion kring smittspridning måste man dock hålla i åtanke att spridningen inte kan förhindras till 100%. Till sin natur sker frilandsodling av frukt, är och grönt inte i sterila system! Däremot ör risken för smittspridning minskas genom lämpliga åtgärder. Två frågor är väsentliga för omdömesfull hantering av evattningsvatten till frilandsgrödor, nämligen (1) Vilka indikatororganismer för hygienisk standard ska tillämpas i samand med ytvattnet som används till evattning? och (2) Vilka gränsvärden för tjänlighet gäller för evattningsvatten till grönsaker för färskkonsumtion. Gränsvärden Till skillnad av några andra europeiska länder finns det i dagens läge inga svenska gränsvärden för tjänlighet av evattningsvattnet till frilandskulturer. Också internationellt finns det inga fastställda standarder. Efter kontakt med myndigheter och olika svenska grossister och fresh-cut producenter visar att det från handelns sida i dagens läge inte finns några särskilda krav på hygien. Det finns dock krav på dricksvattenkvalitet från vissa

3 marknadsaktörer. Ett sådant krav förefaller med dagens utrustning utopiskt även om exempelvis kommunalt vatten används. Vi har sett att även ett vatten av god kvalitet kontamineras i stamledningssystemet i fält (Alsanius et al., inskickat manuskript); utöver detta skulle krav på dricksvattenkvalitet också förutsätter att det fanns dricksvattenledningar ända ut till evattningsrampen, och att det fanns en hygienisk lagring av stamledningsdelar under den tiden de inte används. Så sker inte i dagens läge. Ett annat förslag i detta sammanhang som hörs i det offentliga rummet i samand med evattningskvalitet gör tröskelvärden för strandadvattenkvalitet gällande. Detta resonemang ygger på kallsupsteorin, där man likställer den acceptala mängden fekala föroreningar på frukt och grönt med gränsvärdena för ra strandadvatten. Denna liknelse är dock enart egränsad tillämpar. Från SLV:s sida finns det amitioner att definera gränsvärden för evattningsvattnets hygieniska status, ett arete som görs i samarete med LRF. Ett exempel på operativa normer för evattningsvattnet är DIN 19650, andra normer tillämpas i olika provinser i Canada. Provtagningssätt och tröskelvärden varierar mellan olika länders normer. Operativa normer måste också ställas i relation till kulturens interception av smittan, dvs hur mycket av smittan hålls tillaka av ladverket. Vi undersöker också hur länge olika mängder E.coli i evattningsvattnet hålls kvar av olika ladgrönsaker. Som modellkulturer används ruccola, spenat och persilja (åde krusladig och slätladig persilja). Kulturerna är valda med hänsyn till ladytans morfologiska olikheter. Medverkande i projektet Följande personer (i alfaetisk ordning) har sedan projektstart varit inlandade projektet: Beatrix Alsanius, Mehoo Alam, Måns Asp, Stephen Burleigh, Malin Hulterg, Christine Larsson, Anna Karin Roserg Referensgruppen (i alfaetisk ordning) estod av Anette Borgstrand, Mellansvenska Odlare; Sven-Olof Dimander, LRF; Pirjo Gustafssson, LRF-GRO; Helena Eliasson, Everfresh; Sven Löfdahl/Sofia Ivarsson, Smittskyddsinstitutet; Andrea Kosia, Sydgrönt; Gunilla Norderg, LRF-GRO; Per Nordmark, Norrvidinge Gård; Lars Plym Forshell, SLV; Mette Olsson, ICA och Bengt Petersen, SABA, Rolf Stegmark, FINDUS. På grund av personella förändringar i organisationerna har också sammansättning av referensgruppen varierat. Outcome Resultat från studien har presenterats i olika forum och sammanhang; på nationell nivå i samand med Information om hygien och primärproduktion av livsmedel tillsammans med LRF och SLV i Skåne och Örero (3 tillfällen), mars 2008 Verksamhetspresentation för SLU:s styrelse, maj 2008 Besök av SLU:s rektor hos området Hortikultur, SLU, Alnarp, maj 2008 Projektpresentation LTJ-fakultet, SLU, Alnarp, septemer 2008 Föredrag vid Livsmedelsforskardagarna Bara Mat, Lund, 23/24 nov 2008 ( I de lugnaste vatten ) Föredrag vid Trädgårdskonferensen, Alnarp, 21/22 jan 2009 ( Vårt fina vatten ) Föredrag Rädd för vatten. Bärodlarmöte, Länsstyrelsen i Västra Götaland, 1 dec 2009, Hooks Herrgård. Föredrag Vattenkvalitet vid odling av frilandsgrönsaker. KSLA-seminarium Trädgårdsodling och vattenkvalitet resursehov, hygien, läckage vid frilandsodling. 30 sept 1 okt 2009, Hässleholm Presentation Vatten är liv. Bevattningskurs anordnat av HIR Malmöhus, 19 jan 2010

4 Presentation av hygienfrågor och evattningsvatten för handeln (15 mars 2010; anordnat av SLV) Workshop, Borgey fältdagar, 30 juni 2010 Tillväxt Trädgårds årsmöte, 26 januari 2011 Salmonella-dagen, 26 januari 2011 på internationell nivå i samand med ISHS-konferens Malmö, septemer 2008 (injuden talare) Deutsche Gartenauwissenschaftliche Gesellschaft, årsmöte, Stuttgart Hohenheim, 28 feruari 2010, föredrag IHC Lisaon, augusti 2010 (poster) ISHS, 1 st Symposium on Microial Horticulture, Alnarp, maj 2011 (2 poster) FEMS, Genève, juni 2011 (poster) ISHS, Torino, 22 juli 2011 (1 fördrag, 1 poster) Spin-off-effekter av detta projekt Stöd för att skapa ranschriktlinjer Rekommendationer till riktlinjer kring provtagning och tröskelvärden inom ramen för Svensk Sigill (under utformning) Projekt inom Tillväxt Trädgård ang. underlag för protokoll för edömning av kvalitet till evattning av är och grönt för färskkonsumtion Projekt inom Partnerskap Alnarp ang. rening av evattning på friland Information till svenska massmedier (radio, TV, dagstidningar) samt fackpress i samand med det pågående EHEC-utrottet relaterad till grönsaker i Tyskland Expertstöd till tyska myndigheter och organisationer i samand med det pågående EHEC-utrottet relaterad till grönsaker i Tyskland Följande material från projektet har lämnats eller att komma att lämnas i skriftlig form på nationell nivå Alsanius BW, Burleigh S, Larsson C, Suvinen A, Gustafsson AK, Hulterg M EHEC s öde på frilandsodlade grönsaker. Fakta från Partnerskap Alnarp. LTJ fakultetens faktalad 2010:8. Alsanius, BW 2010/11 Underlag ang vattenkvalitet till Sigills kriterieråd Ekelöf J, Svensson SE, Svensson B, Alsanius B Bevattning. (redaktör: E. Windfäll). LRF Kraftsamling Växtodling. Alsanius BW, Kristensen L, Gustafsson AK, Larsson C, Hulterg M Salmonella vanlig i ytvattenkällorna. Viola 114 (18): Alsanius BW, Kristensen L, Gustafsson AK, Larsson C, Hulterg M Hygien i evattningsvatten en högaktuell fråga. Viola 114 (18): internationell nivå Alsanius BW, Gustafsson AK, Hulterg M Path-organic aspects on irrigation water quality to field grown vegetales. Astract. ISHS-konferens septemer 2008, Malmö. IS1. Alsanius B.W., Gustafsson, A.K. & Hulterg M Microiological aspects on irrigation water quality to field grown vegetales. Acta Horticulturae 852, Alsanius BW, Kristensen L, Roserg AK, Hulterg M Preharvest measures for increased iosafety of field grown crops. Acta Horticulturae (in press).

5 El-Mogy M, Burleigh S, Alam M & Alsanius BW Survival and attachment of Escherichia coli O157:H7 to strawerry surface. Acta Horticulturae (in press). Alsanius BW, Roserg AK, Hulterg M Hygienic standard of impoundments for irrigation of field vegetales in Southern Sweden. (manuscript). Burleigh S & Alsanius BW The use of MPN-PCR and GFP-tagging in the study of O157:H7 survival in the greenhouse (manuscript). Hygienisk standard i ytvatten som används för evattning av frilandsgrödor Från senvåren till hösten 2008 har vi studerat den hygieniska statusen i vattendrag i södra Sverige i syfte att få ett mått på variationerna över tid åde långsiktigt och kortsiktigt. Fem av källorna var ytvattenkällor (2 Skåne, 2 Halland, 1 Östergötland). Brunnsvatten vid en grönsaksodling i Halland användes som kontroll. För att se variationerna över en säsong, samlades prover in vid åtta tillfällen. Vattenkällorna kan kategoriseras i fyra olika typer av vatten (taell 1). Taell 1. Vattenkällor som ingick i provtagningen säsong 2008 Vattenkälla Typ Kategori 1 Brunnsvatten 1 2 Damm matad av äck, dränerings- och regnvatten 2 3 Damm matad av äck, dränerings- och regnvatten 2 4 Damm matad av dräneringsvatten 2 5 Bäck 3 6 Sjö 4 Analys av vattenprover skedde 1) i ett säsongsperspektiv och i ett kortsiktigt perspektiv. För säsongsperspektivet samlades prover vid åtta tillfällen under säsong 2008 med tre replikat per plats och provtagningstillfälle: Juni: vecka 24, 26; Juli: vecka 28, 30; Augusti: vecka 33, 35; Septemer: vecka 37, 39. För att få ett mått på hur vattenkvaliteten varierade i ett kortsiktigt perspektiv, undersökte vi samtliga sex vattendrag vid ett tillfälle (mitten av augusti) under en tre-timmarsperiod. Proverna togs var femte minut. Analyser. Mikroorganismer vid 22 C (M22), koliforma akterier (TC), E. coli (EC) och intestinala enterokocker (FS) används i studien som indikatororganismer för vattenhygien. TC och EC är indikatorer för kortvariga fekala föroreningar. FS tjänar som indikator för långsiktiga fekala föroreningar. Utöver detta kollar vi på förekomsten av sjukdomsalstraren Salmonella. Provanalyserna har utförts av ett ackrediterat kommersiellt laoratorium. Salmonella-positiva prov skickades för konfirmering och serotypsestämning till SVA. I de fall som S. Typhimurium konstaterades, har proverna lämnats vidare till Smittskyddsinstitutet för fag-typning. Proverna i Östergötland transporterades med udil till Alcontrol Las huvudkontor, medan proverna från de andra fem provtagningsplatserna analyserades hos Alcontrol La i Malmö. I taell 2 redovisas hur information från de olika indikatorerna kan tolkas.

6 Taell 2. Sammanställning av några organismer som används vid hygienisk kvalitetsedömning av vatten (Asholt et al. 2001, ändrat) Grupp av organismer Processorganismer Heterotrofa organismer vid 22 C (M22) Totalantal koliforma akterier (TC) Indikatororganismer för fekal förorening Termotoleranta koliforma (fekala koliforma) akterier Antal snaväxande heterotrofa organismer; eskriva främst elastning genom jord Heterogen grupp av akterier; eskriver den allmänna sanitära nivån i vattnet, men är inte direkt relaterad till fekal förorening Undergrupp av totalantal koliforma akterier; indirekt mått på E. coli E. coli (EC) Fekal koliform akterie Intestinala enterokocker (fekala streptokocker) (FS) Patogener Heterogen grupp av akterier som indikerar fekal förorening i vatten Salmonella spp. Sjukdomsalstrare; används som en av indikatorerna i den tyska operativa normen DIN Variationer i ett långsiktigt perspektiv Ytvattenkällorna hade generellt en högre hygienisk elastning än djuporrad runn. Halten mikroorganismer vid 22 C, koliforma akterier och E. coli låg för det mesta över riktvärden för enskild runn. En del prover var inom ramen för strandadvattenkvalitet (tjänlig eller tjänlig med anmärkning), men många låg över dessa riktvärden. En hög förekomst av dessa indikatororganismer ökar risken för vattenuren smitta. Halten organismer varierade starkt mellan olika provtagningstillfällen, iland också mellan de tre proverna som tas vid varje tillfälle. I fyra av de fem ytvattenkällorna konstaterades olika suspecies av Salmonella någon gång under säsongen. I en av evattningsdammarna matade med äck, dränerings- och regnvatten noterades aldrig Salmonella. Proverna från två ytvattenkällor (äck, sjö) visade Salmonella enterica susp. diarizonae (III) upprepade gånger; proverna från det tredje företaget visade S. Typhimurium. Fagtypningen av S. Typhimurium visade på fagtyp NST. I den fjärde ytvattenkällan konstaterades S. Umilo. Denna typ har enligt litteraturen konstaterats på fåglar. I och med att den upptäcktes i samand med provtagning i slutet på septemer, kan man spekulera i om det kan vara en smitta från flyttfåglar. Enligt diskussion med Smittskyddsinstitutet är det en möjlig förklaring. Variationerna till trots kunde det konstateras signifikanta skillnader (Anova, Tukey-test, p<0.05) mellan runnsvatten och ytvattenkällorna och mellan ytvattenkällorna för nästa alla indikatororganismer. Principalkomponentanalys visade att mikroorganismer vid 22 C (M22) å ena sidan och koliforma akterier (TC), E.coli (EC) samt intestinala enterokocker (FS) å andra sidan hade den största inverkan på resultatet och att log M22 och log FS var determinanta, men klustren kunde på as av föreliggande data tydligt separeras. Vid tolkning av vattenanalyser understryks ofta att koliforma akterier (TC), E. coli (EC) och intestinala enterokocker (FS) är indikatorer för förorening. Det hade på så sätt varit intressant

7 om dessa organismer tillsammans eller enskild hade kunnat användas för att förutsäga förekomsten av Salmonella. Ett sådant samand kunde dock inte konstateras. De stora variationerna mellan provtagningstillfällen visar att det inte räcker med att ta ett enskilt prov under säsongen och att dra slutsatser för andra tillfällen under säsongen. De visar också att ett tre prover inte är tillräckliga för att säkra provresultatet vid ett och samma tillfälle. Utifrån de resultaten som vi uppnådde under projektets första år påörjades ett parallellt projekt inom ramen för satsningen Tillväxt Trädgård, där vi tagit fram ett underlag för ett provtagningsprotokoll. Variationer i ett kortsiktigt perspektiv Förekomsten av mikroorganismer som växer vid 22 C var alltid lägst i runnsvattnet. De andra vattenkällorna varierade med faktor 10 inom vattenkällan. Allra högst låg proverna från sjövattnet med log En vattenkälla med uppsamlad vatten var alltid lägst, med log 2.5 till 3.3, där de flesta mätningarna föll inom ramen för standarden för enskild runn. Vad gäller koliforma akterier förekom mycket kraftiga variationer (nästan 2 tiopotenser) i vattnet från den djuporrade runnen. Inte alltid kunde vatten från denna källa rymmas inom standard för dricksvattenkvalitet hos användaren, men de platsade inom ramen för gränsvärden för enskild runn. Bland ytvattenkällorna utkristalliserades två grupper: sjövattenkällan och en uppsamlingsdamm med alltid mycket högre värden än de tre andra. De tre sistnämnda platsade inom riktlinjerna för enskild runn. Variationerna med faktor 5 till 10 fanns mellan högsta och lägsta värde inom samma vattenkälla. E. coli-förekomsten var låg och mycket konstant i runnsvatten. Däremot var halterna mycket varierande i de andra vattenkällorna. Inom vattenkällan fanns stora avvikelser, i synnerhet i sjövattentäckten, där det högsta och lägsta värdet låg mellan 2- till 3-tiopotenser isär. Variationerna i de andra källorna låg på ungefär faktor 50. De högsta halterna av E. coli noterades i en av damm som matades av ytvatten. För halten intestinala enterokocker konstaterades mycket jämna halter i vattnet från den djuporrade runnen - ortsett från två avvikelser. Halterna var också ganska jämna för sjösamt äckvattnet, fast dessa två källor låg på en mycket hög nivå. De tre andra system låg mittemellan dessa två extrema. Variationerna inom dessa tre vattenkällor var olika stora. Salmonella enterica susp. diarizonae (III) konstaterades i 20 av 36 sjövattensprover. S. Typhimurium fastställdes i fem prover i en av dammarna som matades av dränerings- och regnvatten vid två toppar, en i örjan och en mot slutet av oservationsperioden. Smittan hade inte konstaterats i något tidigare prov. Statistisk analys av värdena visar en mycket väl separerad ild åde vid jämförelse med envägs-anova och multivariatstatistik (prinicipalkomponentanalys, diskriminantanalys). Igen inverkade M22 å ena sidan och TC, EC, FS på separationen, med M22 och log E.coli som de mest determinanta varialerna. Datamaterialet lämpar sig väl för att eräkna minimiantalet upprepningar för provtagningarna. Detta arete har i skrivandets stund inte avslutats. Samspel mellan odlad kultur, halten E. coli i evattningsvatten och skördetillfälle I slutet av år 1 startades de första förförsöken för att undersöka samspelet mellan tidpunkt för evattning och skörd av kulturer som evattnats med smittat vatten. Ett antal olika E. coli stammar testades, land dessa E. coli DH5α, K12 samt E81186 (iokemisk stam av E. coli O157:H7). Undersökningen genomfördes med hänsyn till stammarnas metaoliska preferenser (användning av näringskällor) samt förmåga till ildning av iofilm. Våra

8 undersökningar visar att stammarna skiljer sig i sina metaoliska preferenser samt förmågan att ilda iofilm i närvaro av olika enskilda näringskällor. En iokemisk stam av E. coli O157:H7 (EHEC, E81186) som Smittskyddsinstitutet, Solna, ställt till vårt förfogande användes som modellorganism. Denna stam är inte sjukdomsalstrande (icke patogen) i och med att den inte ildar några verotoxiner, men eter sig i övrigt som den patogena varianten. I första delen av undersökningen användes persilja, åde krus- och slättladig, som modellkultur. Enligt ansökan planerades en koncentration (densitet) av EHEC på 10, 100 resp kolonier per ml evattningsvatten och en total dos av 5 mm per giva. Det visade sig att det var mycket svårt att få tillförlitliga resultat från den svagaste koncentrationen. Därför använde i senare försök 100, 1000 resp kolonier per ml. Aretet delades upp i olika steg, nämligen olika metoder för reisolering och huvudförsöket. Vid re-isolering aretade vi med (1) det selektiva mediet som rekommenderats av Smittskyddsinstitutet, med (2) en immunomagnetisk metod (DynaBeads) samt (3) med en iosensor. (1) Det rekommenderade selektiva mediet (McConkey + cefixime and tellurite) fungerade inte särskilt väl i och med att akgrundsfloran som naturligt förekommer på växtmaterial inte uteslöts på ett tillfredställande sätt. (2) Vid den immunomagnetisk metoden (DynaBeads) aretar man med små magnetkulor som är eskiktade med antikroppar för EHEC. Växter inokulerades med EHEC; den totala akteriefloran reisolerades från laden, överfördes i en anrikningskultur och EHEC fiskades selektivt med hjälp av magnetkulorna som sedan kunde överföras med en magnet till ett selektivt medium. Denna metod är anpassad till relativt stora vätskevolymer, förhållandevis dyrt och tillåter enart en kvalitativ estämning, dock ingen kvantifiering av EHEC. (3) Som ett tredje alternativ markerade vi den iokemiska stammen med en iosensor (grönt fluorescerande protein, GFP), som ger stammen förmågan att fluorescera under UV-ljus (figur 1). GFP upptäcktes först hos maneten Aequorea victoria; för denna upptäckt tilldelades Martin Chalfie, Osamu Shimomura och Roger Tsien år 2008 Noelpriset i kemi. Stammen med iosensor (E.coli O157:H7 gfp+) motsvarade i övrigt stammen utan iosensor. Den iosensor försedda stammen användes i huvudförsöket. I ett kompletterande försök optimerade vi odlingsetingelserna för att ha en så effektiv kolonisering av och reisolering av den fluorescerande stammen från växtmaterialet. Detta förarete avslutades i slutet av augusti. A B

9 Figur 1. Fluorescerande kolonier av den iokemiska E.coli O157:H7 stammen med iosensor (gfp) framför en akgrund av andra mikroorganismer som lever på lad under UV-ljus (A) och under dagsljus (B) (foto: Stephen Burleigh). Huvudstudie Inom ramen för huvudstudien har vi aretat med krus- och slättladig persilja, ruccola och spenat. Växtmaterialet odlades upp i en växthuskammare. Bevattning skedde enart ovanifrån fram till smittillfället. Efter kontaminering tillfördes vatten enart vid ehov och i så fall enart underifrån. Prover togs direkt innan samt 3h, 24h, 48h och 72 h efter kontaminering. Halten iokemisk EHEC avtog undan för undan i alla ehandlingar och tendenserna var likadana för samtliga växtslag. Det fanns dock skillnader i hur snat halterna sjönk. Vid ehandling med en låg halt av iokemisk EHEC (100 kolonier per ml) sjönk halten linjärt från till 10 kolonier per försöksruta (parcell) inom loppet av tre dygn. Vid högre utgångshalter i evattningsvatten sjönk antalet kolonier snat till en örjan, men minskningen stannade upp och efter 3 dygn fanns 1000 resp kolonier per parcell kvar. Minskningen hade vid dessa två utgångshalter ett polynomialt resp. exponentiellt förlopp vilket inneär att halterna även långsiktigt inte kommer att li 0. Förklaringen till detta ligger i livsstilen på laden. Att akterier finns i alla miljöer är allmänt känt sedan tidigare. Flertalet mikroorganismer gör ingen skada. På lad finns i genomsnitt (10 7 ) till (10 10 ) akteriekolonier per gram färskvikt. Antalet akteriekolonier varierar mellan växtslag. Många akterier som finns i ladmiljön är utrustade med mekanismer som skyddar mot de inte särskilt gästvänliga etingelserna, såsom uttorkning och UV-strålning. Avgörande för akteriernas överlevnad är tillgänglighet av vatten och näring. Inte alla ställen på lad tillgodoser dessa krav. De optimala koloniseringsplatserna finns nära ladnerverna, kluvöppningarna, trikomer samt vid sår. Bakterier ligger inte på lad och skvalpar omkring utan finns i en slags iofilm som ger skydd mot uttorkning. När en enskild akterie träffar ladytan via evattningsvattnet är det inte säkert att den hamnar vid en plats med god tillgänglighet till vatten och näring över tid. Den kan heller inte ensamt skydda sig mot uttorkning. Den ensamme resenären kommer förmodligen att dö efter ett tag på ladet. Det är det vi ser när iokemisk EHEC tillfördes i en låg halt med evattningsvattnet. Finns det däremot högre halter av iokemisk EHEC i evattningsvattnet, är dels chansen större att de hamnar på platser med god tillgänglighet av vatten och föda och dels kan organismerna skydda sig och varandra genom att ilda en slags iofilm. Figur 2 visar förekomsten av iokemisk EHEC på 100 g färskvikt av krusladig persilja vid olika halter i evattningsvatten och olika skördetillfällen. Liknande resultat uppnåddes med de övriga växtslagen. Halterna var påtagligt höga fortfarande tre dygn efter evattning med smittat vatten, då högre doser av smittämnet förekom. Bakterierna hade dock inte försvunnit helt då evattningsvattnet enart innehöll motsvarande 100 kolonier per ml vid en vattengiva av 5 mm. I föreliggande undersökning aretade vi med en icke-patogen stam av EHEC (iokemisk EHEC). Förutom att inte framkalla sjukdom rukar icke patogena stammar ha ett mindre aggressivt koloniseringssätt alltså en mer fredlig livsstil. Hade undersökningen genomförts med en patogen EHEC-stam hade den förmodligen koloniserat ladverket i minst samma utsträckning. Därför drar vi slutsatsen att man definitivt inte ska underskrida ett evattningsintervall av tre dygn mellan evattning och skörd när ytvatten används som källa för evattning av krusladig persilja. Undersökningen visar också vikten av hygieniskt hög kvalitet för evattningsvatten.

10 log CFU/100 g fw c c c a a a a a a Tidsinterval (h) Figur 2. Förekomst av iokemisk E. coli O157:H7 per 100 g färskvikt av persilja 3, 24, 48 och 72 timmar efter evattning med smittat evattningsvatten. Det smittade evattningsvattnet innehöll 0, 100 (10 2 ), 1000 (10 3 ) resp (10 4 ) kolonier E. coli O157:H7 per ml evattningsvatten motsvarande en vattengiva av 5 mm. Antalet kolonier (CFU; colony forming units) uppges som logaritmiskt värde per 100 g färskvikt där log 0 = 1 koloni, log 1 = 10 kolonier, log 2 = 100 kolonier, log 3 = kolonier, log 4 = kolonier, log 5 = kolonier, log 6 = kolonier etc. Avvikande okstav ovanför stapeln vid samma skördetillfälle indikerar att halterna skiljer sig signifikant. I ett sidoexperiment undersöktes förmågan av E. coli O157:H7 att fästa vid ytan av jordguar. Intakta jordguar doppades i vatten kontaminerad med E. coli O157:H7 (iokemisk stam). Undersökningen visade att den generella förekomsten på jordguar avtar med ökande intervall mellan ehandling och analys. Den testade stammen har dock favoritplatser på jordguar. Förekomsten var högst på foderladen samt på fruktens nedersta del. I motsats till den avtagande trenden på frukten med ökande intervall mellan ehandling och analys, så ökade förekomsten på foderladen, vilket tyder på att E. coli O157:H7 inte enart överlevde utan också förökade sig på foderlad av jordguar. Litteratur Alinh A. & Berggren I EHEC-akterien kansmitta via gödsel och gröda. Livsmedel i fokus 8: 48. Alsanius B.W., Gustafsson, A.K. & Hulterg M Microiological aspects on irrigation water quality to field grown vegetales. Acta Horticulturae 852: Asholt NJ, Graow WOK, Snozzi M 2001 Indicators of microial quality. In: Gewtell L & Bartram J. Water quality: guidelines and health. London: IWA Pulishing, s Brennhovd P., Kapperud G. & Langeland G Survey of thermotolerant Campyloacter spp. and Yersinia spp. in three surface water sources in Norway. International Journal of Food Microiology 15, DIN Bewässerung. Hygienische Belange von Bewässerungswasser. Berlin: Beuth. Krämer J Leensmittel-Mikroiologie. 4:e uppl. Ulmer UTB: Stuttgart. Rosén L. & Frierg J Påverkan på säkerheten i vattenförsörjningen från strandetande nötkreatur fallstudie Göta älv. VA-Forsk Rapport s. Schulze E Hygienisch-mikroiologische Wasseruntersuchungen. 2:a uppl. Gustav Fischer Verlag: Jena.