Cloning of the functional domains of TSP-1 for protein expression

Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 högskolepoäng C-nivå Vt. 2009 Cloning of the functional domains of TSP-1 for protein expression Shadi Zangi Handledare: Magnus Rosenquist Institution för onkologi, radiologi och klinisk immunologi Uppsala universitet, Sweden 1

ABSTRACT Thrombospondin-1 (TSP-1) is a multifunctional extracellular matrix glycoprotein that is released from platelets α-granule to regulate angiogenesis process. TSP-1 is well-known as an inhibitory factor of angiogenesis that binds to angiogenesis stimulating factors, for example fibroblast growth factor 2 (FGF-2), vascular endothelial growth factor (VEGF) and hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF), to inhibit angiogenesis. We have cloned TSP-1 domains separately to allow studying of their function and effect on proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). We used an Escherichia coli expressionsvektor including poly histidin-tags and lac-promoter for induction of the seven successfully cloned domains by IPTG and arabinose. Our result shows that we have very low expression and induction of our protein in the E.coli by IPTG and arabinose, which is most likely due to complications associated with expressing a human protein in a prokaryotic system. KEYWORDS: Thrombospondin-1; Angiogenesis; cloning; protein expression 2

INTRODUKTION Brist på syresättning och näringstillförsel är problem vid transplantation av till exempel langerhanska öar. En snabb och korrekt revaskularisering är avgörande för funktion och överlevnad hos transplanterade langerhanska öar. Det har rapporterats visst blodflöde i langerhanska öar men kapillärerna utvecklas dåligt efter transplantation [1], vilket resulterar i låg överlevnad av öarna. Stort fokus inom transplantationsforskning ligger därför på angiogenes. Angiogenes är blodkärlnybildning i kroppens vävnader. Denna procces regleras av proangiogenetiska och antiangiogenetiska faktorer, en dynamisk interaktion mellan en variation av celler, tillväxtfaktorer och extracellulärmatrix (ECM) [2]. Vid ökade behov av syre och näring startar angiogenesen som stimuleras av tillväxtfaktorer. Endotelcellerna migrerar till närliggande vävnad och ECM bryts ner med matrixmetalloproteinasenzymet (MMP) för att nya blodkärl ska få plats att växa (Figur 1). Fig. 1. Trombospondin-1 i angiogenesprocessen. Tillväxtfaktorer binder till receptorer på endotelcellernas (EC) ytor och aktiverar dem. EC börjar sin prolifiering och migrering för att bilda nya blodkärl. TSP-1 binder direkt till tillväxtfaktorer eller deras receptor och inhiberar angiogenesen. (Modifierad från www.angio.org/understanding/understanding_archive.html) Trombospondin-1 (TSP-1) är ett protein som normalt finns i öarna och binder till angiogenesstimulerande faktorer som till exempel fibroblast growth faktor 2 (FGF-2). Forskning har visat att FGF-2- produktion minskar efter ö-cells transplantation [1]. TSP-1 är en stor komponent i trombocyters α-granula och frisätts vid aktivering av trombocyter tillsammans med kalciumjoner. Det är ett multidomänt och multifuntionellt, kalciumbindande 3

ECM glykoprotein som binder till matrix proteiner, receptorer på cellytorna, heparin, tillväxtfaktorer, proteaser och kalcium. [3] TSP-1 är inblandad i trombocytaggregation, sårläkning, inflammatorisk svar, tillväxt av tumörer och reglering av angiogenes. Det binder med hög affinitet till flera andra heparinbindande angiogenes-faktorer som till exempel fibroblast growth factor 2 (FGF-2), vascular endotelial growth factor (VEGF) och hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) [2]. Strukturen hos TSP-1 med 7 domäner visas i Figur 2: Fig.2. Olika domäner hos TSP-1 med deras bp-storlek, namngivna efter domänens första bokstav. H = Aminoterminal domän (N-terminal): som har en heparinbindning funktion, aggregation, kemotaxi, celladhesion (heparin). O = Oligomeriserande domän: Trimerer av Tsp-1. Pc = Prokollagen domän (Pc): antiangiogenetisk. P = Properdin-liknande domän/typ I: celladhesion, kemotaxi och antiangiogenetisk. E = Epidermal growthfaktor liknande domän/typ II: inhiberar FGF-2, antiangiogenetisk. Ca = Kalciumbindande domän/typ III: adhesion, FGF-2 bindning. G = Karboxyterminal (C-terminal) lektin-liknande globulär domän: adhesion och kemotaxi [4,5]. TSP-1 har både proangiogenetiska och antiangiogenetiska domäner och reglerar endotelcellernas tillväxt, adhesion och motilitet. Prokollagen, properdin-liknande och kalciumbindande domänerna inhiberar neovaskularisering och endotelcellers migration [2]. TSP-1 är den första identifierade inhibitorn av angiogenes. Det binder till ECM och har effekt genom att förutom att den inhiberar migrering av endotelceller, även inducera apoptos i aktiva endotelceller, inhibera MMP och inhibera tillväxtfaktormedierad proangiogenesaktivitet. VEGF stimulerar angiogenes genom att inducera proliferation, migration, invasion och tubformation av vaskulära endotelceller, FGF-2 likaså [6]. Inhibering av TSP-1 kan leda till en ökning av revaskularisering vid transplantation av organ eller vävnader som i normal fall har låg syretillförsel och ökar därmed deras överlevnad och funktion. Detta förutsätter en processning av TSP-1 där angiogenetiska domäner frisätts. Antiangiogenes aktiviteten har främst lokaliserats till typ I och III repeats. Denna antiangiogenetiska aktivitet där TSP-1 binder till FGF-2 (angiogenetisk faktor) och förhindrar FGF-2 bindning till endotelceller är lokaliserad till den C-terminala domänen [2]. 4

Det finns publikationer som föreslår att TSP-1 kan vara proangiogenetiskt och i kombination med andra faktorer stimulera angiogenesen. Närvaro av fibrin, kollagen och fibroblast growth factor samtidigt som TSP-1 ökar blodkärlnybildningen [3]. För att undersöka olika domäner som finns i ett protein så klonar man dem separat för att vidare undersöka deras funktion. I detta projekt klonades och uttrycktes 7 funktionella domäner hos TSP-1 proteinet. Funktionen hos de olika domänerna i TSP-1 är ännu inte klarlagda. Deras funktion och förmåga ska provas på endotelceller vilka är viktiga i många fysiologiska processer så som angiogenes, cancerutveckling och blodkoagulation. Humana umbilical ven endotelceller (HUVEC) används vanligen för dessa undersökningar och endast i forskningssyfte. För att uttrycka proteiner måste först ett så kallat expressionssystem väljas. Faktorer som påverkar valet av expressionssystem är t.ex. ursprung, storlek på proteinet, om det är membranbunden eller inte. Vi valde att först försöka uttrycka proteinerna i Escherichia coli med gateway-systemet (Figur 3). I studien använde vi en expressionsvektor med poly histidin-tag för proteinrening och lac-promotor för isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) och arabinos-induktion. Detta projekt är en del i att hitta en strategi för stimulering av angiogenes vid transplantation av en syntetisk pankreas till diabetiker. Fig. 3. Gateway-kloningssytemet, modifierat från Invitrogens produktblad. Vår önskade gen i form av cdna eller PCR-produkt kan klonas i en entry clone som sedan kan rekombineras och uttryckas i andra sorters vektorer, anpassade efter arten på värdcellen. 5

MATERIAL OCH METOD Arbetsflödet för de metoder som använts i arbetet är illustrerat i Figur 4. Fig. 4. Översikt över de metoder som har används under projektet för kloning och uttryck av TSP-1 domäner. Metod PCR-analys Först gjordes en sökning efter celler med tsp-1 genuttryck i databas som ledde till valet av humana navelsträng ven endotelceller (HUVEC). Från endotelcellerna renades totalt RNA fram (Qia Quick-RNA kit, Qiagen Inc.) och sedan syntetiserades cdna som var mall DNA till hela tsp-1 genen i följande PCRer. Med hjälp av specifika primerpar riktade mot de 7 domäner i tsp-1 och designade enligt NM003246 kördes en PCR för amplifikation av domänerna (Finnzymes Phusion, www.finnzymes.com). Den totala volymen av PCR-mixen var 50 µl som innehöll 36 µl d H 2 O, 1µl 10mM dntp, 10 µl 5X Exp HiFi buffert som ökar enzymstabiliteten under lång inkubering, 1 µl av varje specifik primer, 0,5 µl av templatet som spädes 20 gånger för att få bort templatplasmider från PCR-produkten och 0,5 µl Exp HiFi Polymeras (som är långsammare, korrigerar sekvenserna och undviker mutation). PCR maskinen (MJ RESEARCH, PTC 200) programmerades enligt följande: Först 2 min denaturering vid 95 C följdes av 33 cykler (30 s denaturering vid 95 C, 30 s anealing vid 54C, 1 min elongering vid 72 C) och 72 C i 10 min slutligen 4 C i evighet ( ). Agarosgelelektrofores på PCR-produkterna PCR-produkterna analyserades på 1 % agarosgel för att se produkternas storlek. Till gelen användes 0,7g agaros (Lonza), 1% TAE (Tris-acetate-EDTA) upp till 70 ml och 6

etidiumbromid 5µl/100ml (0.5ug/ml) för att synliggöra banden. Sedan laddades 10µl av varje prov på gel som var lättmixad med 2 µl LB färg (loading buffert). Storleksmarkörer var 2- Log Ladder (New England BioLabs, www.neb.com). Efter 30 min gelelektrofores vid 110 V avlästes resultatet under UV-ljus i BIO RAD GelDoc 2000 (www.biorad.com). TOPO-TA-kloning i pcr8 Invitrogen Topo-TA-kloning-tekniken möjliggör en snabb och effektiv kloningsreaktion i fem min med pcr8/gw/topo cloning kit (Invitrogen). Kittet innehåller en vektor som har arrangerats till en lineär plasmid med 3" deoxitymidin (T) överhäng som aktiveras genom en kovalent bindning till topoisomeras I. PCR-produkten med A överhäng i 3" ändarna som är tillförd av Exp HiFi DNA-polymeras kompletterar 3" T överhäng av vektorn och möjliggör snabb ligering med redan topoisomerase I utan att restriktionsenzymer behövs. Plasmiden kan sedan transformeras till bakteriecell. Amplifierad PCR-produkt med Exp HiFi polymeras klonades i pcr8-vektor som innehåller genen för spectinomycin resistans. Detta gjordes genom att blanda 0,5 µl PCR produkt med 3,5 µl vatten, 1µl saltlösning och 1µl TOPO vektor (pcr8) från Invitrogen, pcr8/gw/topo-kloning kit. Allt blandades genom att pipettera upp och ner och blandningen inkuberades fem min i rumstemperatur sedan stoppades reaktionen genom infrysning i -20 C. Transformering in One Shot Mach-1 De TA-klonade plasmiderna transformerades till förvaringsvektor One Shot Mach-1-t1 (Chemically Competent E.coli, Invitrogen) som är en "high copy number" förvaringsbakterie som kan innehålla många plasmider. Först tinades sju mach-1 rör, sedan tillsattes 1 µl plasmid till varsitt mach-1-rör och inkuberades 30 min på is. Rören inkuberades i 42 C vattenbadet i 30 s och flyttades till is igen. 250 µl S. O. C medium tillsattes till alla rör, som skakades 60 min i skakinkubator vid 37 C, 250 rmp. Proverna odlades på LB-agarplattor (diskavdelningen, UAS) med spectinomycin (100µg/ml). Glaskulor hälldes i alla plattor, som skakades för att kulorna skulle spridas på plattan, som inkuberades över natt i 37 C värmeskåp. Koloni-PCR Dagen efter gjordes en koloni-pcr på kolonier som växt på plattorna för att se riktningen på våra gener. Totalvolymen av PCR-mixen var 25 µl och den innehöll 20,75 µl dh 2 O, 0,5 µl 7

dntp, 2,5 µl 10X thermopol buffert, 0,25 µl av varje primer (Tspfw och T7 rv) och 1/2 kolonier. PCR-maskinen programmerades enligt följande: Först 2 min denaturering vid 95 C som följdes av 33 cykler (30 s. denaturering vid 95 C, 30 s anealing vid 54 C, 1 min elongering vid 72 C) och 72 C i 10 min slutligen 4 C i evighet ( ). PCR-produkterna analyserades sedan elektroforetiskt på agarosgel för att se om bandens basparsstorlek stämde med de önskade. Positiva kolonier odlades i 3ml LB-medium med 3µl spectinomycin över natt. Plasmid-preparation på odlingar För att fälla ut och rena våra plasmider från bakterier måste först bakterierna lyseras. Därför gjordes en plasmidpreparation på övernatts odlingar med QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) enligt tillverkarens instruktion. Först centrifugerades övernattskulturen 15 min. vid 11180g. Bakteriepelleten sparades och supernatanten hälldes av. Sedan följdes "QIAprep Spin Miniprep Kit Using a Microcentifuge"-protokollet. Koncentrationsbestämning på plasmidpreparationen gjordes med en NANODROP 1000 spectrofotometer (Thermo Scientific, SAVEEN WERNER) vid 260 nm. Renheten bestämdes genom att titta på 260/280 kvoten. Rekombinering i phgwa Destinationsvektor phgwa har hög kapacitet för kloning och för att uttrycka rekombinerade proteiner i E. coli. Det är en pet22b modifierad för rekombineringskloning och med histidintag. Denna vektor har lacoperator och är lämplig för att uttrycka proteiner som är under kontroll av T7 promotor (Figur5). [Den var en gåva av en samarbetspartner] Fig. 5. phgwa-vektorn 8

Vid rekombinering i phgwa, som är en vektor med gener för ampicillin/kloramfenikolresistans, får vi extra aminosyror före och efter vår klonade gen. Dessa krävs för att få histidintagarna (6xHis) som binder till Ni 2+ upp vid isolering av proteiner i följande IMACrening. Histidin kan byta laddning och bli negativtladdad för att binda med hög affinitet till Ni 2+ i kolonnen, därefter kan bli positivtladdad för att släppa målproteiner vid sköljning av kolonnen. Extra-sekvens framför proteinerna var: MGSSHHHHHHGTGSYITSLYKKAGSEFAL och extra-sekvens efter proteinerna var: KGEFDPAFLYKVVMYLEHHHHHH För rekombinering tillsattes 2µl av varje prov till varsitt PCR-rör, 2µl phgwa (destinationsvektor), 4µl TE-buffert och 2µl LR-klonas som var vortexat. Rören inkuberades i 1 tim, vid 25 C. Sedan tillsattes 1µl proteinas-k (tuggar LR-klonas) och rören inkuberades ytterligare 10 min vid 37 C. Transformering in One Shot Mach-1 De rekombinerade plasmiderna i phgwa transformerades till Mach -1för förvaring. Dagen efter odlades kolonier från plattorna i 3 ml LB-medium och 3µl ampicillin/kloramfenikol över dag. Rören inkuberades i skakinkubator upp till 5 tim i 37 C 250 rpm. Glycerolstockar gjordes på odlingarna med 225µl glycerol och 1,5 ml prov som frystes snabbt i flytande kväve och förvarades i -70 C frysen. Senare gjordes en plasmid preparation på odlingarna enligt QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)-protokollet för att rena våra phgwa plasmider. För att kontrollera produktsekvenserna i de rekombinanta till phgwa skickades de gensekvenseringscenter. Sekvensanalys För sekvensering av våra PCR-produkter och His-tagarna i expressionsvektorn, skickades 20µl av varje plasmidpreparation med FedEx till Macrogen i Korea. Där utfördes sekvenseringsreaktionerna och en första kvalitetskontroll. Därefter laddade vi nerkromatogram från deras server. Sekvensernas kvalitet kontrollerades av oss och dåliga kromatogram sekvenserades om av Macrogen. I kromatogrammen sökte vi startpunkten för produkterna, som ligger i kloningskassett, med hjälp av sekvensen i invitrogenmanualen. Sekvenserna jämfördes med referenssekvensen (NM_003246) för tsp-1 genom ClustalW i programmet MacVector 9.0. 9

Site Directed Mutagenesis Det gjordes en site directed mutagenesis på de kloner som hade punktmutation. Detta är en PCR som skiljer sig från vanlig PCR och används för att korrigera sekvenserna direkt i vektorn. Primrar med korrigerad sekvens komplementära till varandra används, där korrigerande basen placeras i mitten. Efter PCR transformerades produkten direkt in i Mach-1 för amplifiering. Transformering in i BL21 (DE3) plyss För att uttrycka målproteiner transformerades phgwa-plasmider in i expressionbakterie BL21 Star (DE3) plyss (Chemically Competent Cells, Invitrogen). BL21 (DE3) plyss är en komponent E. Coli-stam som möjliggör högt proteinuttryck för gener som är under kontroll av en T7-promotor och har en ribosombindningställe. BL21 (DE3) plyss är en T7-promotor driven expressionvektor innehållande DE3 som reglerar expressionen vid tillsättning av IPTG. IPTG inducerar uttrycket av T7-RNA-polymeras i bakterie som binder senare till T7-lacpromotor på vektorn och transkription av proteingener startas. plyss-delen är en plasmid med gen för kloramfenikolresistent och kodar för T7 lysozym. T7 lysozym inhiberar T7-RNA-polymeraset och minskar målproteinets uttryck. Detta används när man vill att protein uttrycket ska induceras bara av IPTG och ge hög halt T7-RNA-polymeras, som kan aktivera T7-lacpromotorn och börja transkriptionen av målproteinet. Inducering av proteinuttryck med IPTG och arabinos Proverna odlades i 3 ml LB medium med 3µl karbenicillin (50µg/ml) över natt vid 37 C i skakinkubator. Dagen efter mättes turbiditeten på de med spektrofotometer och initialkulturen odlades igen 1/20 i LB-medium i nya odligsrör vid OD600 1. När OD (optical density) hade nått 0,4-0,6 på de nya odlingarna efter 2-3 tim delades provet till två i nya odlingsrör. Det ena användes som kontroll och det andra inducerades med 1mM IPTG och 0,2 % arabinose. Det togs 500µl av varje prov i eppendorfrör vid 0, 1, 2 och 3 tim efter inducering. Dessa centrifugerades och pelletten frystes in. SDS-PAGE Pelleten från induceringen löstes i 500µl PBS och 60µl av proverna pipeterades till nya eppendorfrör och sonikerades med sonikator (Bandelin Electronic) för att få ut proteinerna från vesiklarna. Sedan tillsattes 15µl merkaptoetanol till dem. Proverna kokades i värmeblock 10

i 10 min vid 95 C och separerades på gel med SDS-PAGE. Gelerna var färdiggjutna (10 % Tris-HCl från BIO-RAD) och som kontroll användes BIO-RAD precision plus proteinstandard. För att proteiner skulle synas färgades gelen med Coomasiefärg under 60 min. Gelen avfärgades med bara avfärgningslösning som innehöll 500 ml H 2 O, 100 ml ättiksyra och 400 ml metanol i en liter. ÄKTA- immobilized metal affinitychromatography (IMAC)-rening Preparering av provet: framgångsrikt inducerade prov enligt SDS-PAGE odlades igen från glycerolstockar i större volymer och inducerades efter 3 tim med 0,2 % arabinose och 1mM IPTG. Proverna centrifugerades 10 min vid 3382g och 4 C. Pelleten löstes i 5 ml iskall buffert A (20mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 20-40 mm imidazol, ph 7,4 (ph ställs med HCl), sedan fylls till 1 liter med MQ vatten, filtreras med vacumfilter-corning) och hälldes över till ett plaströr placerat i bägare med is. Därefter sonikerades provet på is för lysering (0,5+0,5 s cykler, 28 W(40%) i 4 min). Provet hälldes över i centrifugrör och centrifugerades vid 28145g i 20 min i 4 C för att få bort cellmembran och debris. Supernatanten hälldes över i ett plaströr, som sattes på is. Programmet för pumparna kontrollerades (UNICORN, ny metod, explorer wizard, ok, 280 nm) på ÄKTA. Programmet bestod av 15 kolonnvolymer (CV) tvätt med 0% Buffert B ( 20mM Tris-HCl, 0,5M NaCl, 500mM imidazol, ph 7,4) följt av en 10 CV tvätt med 6% B. Därefter en gradient från 6% till 20% B över 10 CV, följt av en gradient från 20% till 100% över 20 CV. Först tvättades och urluftades slangarna, och fylldes med respektive buffert (A och B som var iskalla). Kolonnen (HisTrap affinity columns, GE Healthcare) tvättades manuellt med 20ml H 2 O, och därefter laddades den med 5 ml nickellösning (1 sked Ni till 40 ml H 2 O). Överflödet fördes bort med 20 ml buffert A, och slutligen tillsattes provet till kolonnen och den kopplades in i maskinen för att börja programmet. När programmet var slut tvättades kolonnen med 20 ml HCl och fylldes sedan med 20% etanol för förvaring. RESULTAT & DISKUSSION Resultaten av PCR med specifika primerpar mot TSP-1 sju domäner som kördes på gel visas i Figur 6. Antal baspar stämde med de förväntade varför rätta produkter hade erhållits. 11

Ca G PC P 1500bp 1000bp 500bp Ca < 762bp +300 G < 675bp+300 PC< 189bp+300 P < 522bp+300 Fig. 6. Exempel på gel med konfirmerade PCR-produktstorlekar, där T7-primrar utanför kloningskasetterna användes, vilket gav produkter 300baspar (bp) större än de klonade fragmenten. Produkterna klonades i pcr8-plasmiden och förvarades sedan i Mach-1 bakterien. För att rekombinera våra produkter i phgwa-plasmiden krävdes att de satt i rätt riktning och därför kördes koloni-pcr. Produkterna sitter i plasmid (p) kallas för ph, po, ppc, pp, pe, pca och pg. Resultatet från gelen på ph visade att 3 av 10 kolonier var positiva, vilket var förväntat, eftersom slumpmässig koloni-upplockning användes (Figur 7). ). I annat fall förväntas 5 av 10 kolonier vara positiva. 1500bp 1000bp 500bp ph < 807bp Fig. 7. Koloni-PCR på 10 ph-kolonier klonade i pcr8 Plasmidpreparationer från odlingarna på positiva kolonier hade höga koncentrationer eftersom de var transformerade i Mach-1 vilket är en "high copy nummer" bakterie, med många kopior av plasmiden. Positiva kolonier rekombinerades i phgwa och transformerades sedan i Mach-1 och skickades för sekvensering. Resultaten visade att sekvenserna hos po, pg, pca och ppc var rätt men ph, pe och pp hade fel i sekvensen. Det var fel läsram på ph på grund av ett fel i den beställda primern. En korrigerad primer beställdes och en PCR för korrigering av läsramen kördes. Resultatet ses på gelen i Figur 8 och hela processen kördes om. 12

1500bp 1000bp 500bp ph< 807bp Fig.8. PCR-produkt på ph efter läsram-korrigering med nya primerpar. Det var en punktmutation på pe som korrigerades med site directed mutagenesis (Figur 9). På grund av punktmutationen uttrycks fel aminosyra (serin istället för asparagin i position 41). En punktmutation kan förändra funktionen eller orsaka lokal instabilitet hos ett protein. Sekvensen från pp var mycket svag och det visade att den inte var ren, hade för lite DNA eller inte hade någon sekvens alltså pp-transformanter odlades upp igen för ny plasmidpreparation. 1500bp 1000bp 500bp Fig. 9. pe-rekombinanter i Mach-1 efter site directed mutagenesis I Figur 10 ses sekvensresultaten från kromatogrammen erhållna från ph med en dålig sekvens och fel läsram (Figur 10A), pe med punktmutation (Figur 10B) och pp som var mycket svag (Figur 10C). Sekvenserna på våra produkter jämfördes med dem rapporterade sekvenserna från genbank för både ph och pe. De första 23 baserna motsvarar korrekt sekvens för kloningskasetten i phgwa för ph (Fig.11) och en punktmutation i 123 bp för pe (Figur 12A). När sekvenserna för pe översattes till aminosyror fick vi annan aminosyra i position 41 (Figur 12B). A 13

B C Fig. 10. Kromatogram för ph med kontaminerad och oren sekvens (A), pe med perfekt sekvens i start punkten (B) och pp med svag signal (C). Fig. 11. Sekvensjämförelse mellan phgwa med heparinbindande domänen (ph) klonad i fel läsram (överst) och korrigerad läsram (underst). De första 23 baserna motsvarar korrekt sekvens för kloningskasetten i phgwa. A. B. Fig. 12. Sekvensjämförelse mellan DNA-sekvensen från EGF-liknande domänen från NM_003246 och (pe) epidermal growthfactor liknande domän i phgwa (A). Motsvarande sekvenser översatta till aminosyror (B). De tre konstruktionerna (ph, pe och pp) skickades till sekvensering igen. Efter sekvensering transformerades de i BL21 och inducerades med IPTG men resultaten var inte bra då ingen expression erhölls. Sedan användes arabinos för inducering men resultaten var inte helt perfekt varför inducering med både IPTG och arabinos valdes, som hade används i andra publikationer. Arabinos är mer effektiv för induktion i E.coli med T7-Lac-promotor än IPTG som kan vara tillväxthämmande för våra proteiner [7]. Resultaten av inducering med enbart arabinose visas i Figur 13 (pca och ph i phgwa). Storleken på proteinerna uträknades med en formel: Medelaminosyrans vikt 0,12 kda x (PCR-produktenslängd+ histidintagstorleken 88)/3= storleken i kda 14

pca ph 0h 1h 2h 3h 3hctrl std 0h 1h 2h 3h 3hctrl 37 25 20 Fig.13. Inducering av pca och ph med arabinos. Proverna är tagna vid 1, 2, 3 tim efter tillsättning av arabinos och för icke-inducerade (utan arabinos) vid 0 och 3 tim (3hctrl). Storleksmarkörens (Std) band 37, 25 och 20kDa är angivna. Eftersom proverna i Figur 13 var inducerade efter 3 tim från tillsättning av arabinos då bestämdes att bara samla prov efter 3 tim följande odlingar. I Figur 14 visas resultaten av inducering för pg, po, pp, ppc och pe (i phgwa) med både IPTG och arabinos. Proverna är tagna efter 3 tim (I) från tillsättning av IPTG och arabinos, jämfört med icke-inducerade transformanter (C). pg po pp ppc pe I C I C I C Std I C I C 37 25 20 Fig.14. Inducerade prov (I) med IPTG och arabinos och icke-inducerade som kontroll (C) efter 3 tim. Storleksmarkörens (Std) band 37, 25 och 20kDa är angivna. Resultatet från induceringen på pg, pp och pe syntes på gelen men de överuttryckta pooch ppc- proteinerna hade för liten storlek och ett kortare gel borde ha körts för att de små proteinerna ska synas på gelen. Gelen visade att vi har fått ett dålig induktion med lite protein uttryck i E.coli. E.coli är en billig prokaryot värdcell som har höga expressionsnivåer av den orsaken att den växer snabbt och används därför som första hands alternativ för proteinexpression [8]. Inducerade prov separerades med IMAC på ÄKTA för proteinrening. Sammanfattningsvis är ÄKTA en gradientpump som blandar 2 buffertar till lämplig koncentration för eluering av våra proteiner baserat på proteinernas affinitet till i detta fall en nickelkolonn. Histidin- 15

taggade proteiner eluerades från den nickeljonladdade HisTrap kolonen med imidazole 20-250 mm från [9]. Defekta ventiler i ÄKTAn ledde till luftläckage till kolonnen och inga proteiner kunde renas fram. För en bättre induktion borde våra humana proteiner uttryckas i en annan sorts bakterie. Om den inte ger bättre resultat borde de uttryckas i en eukaryot cell med en mammalies- expressionvektor som har komponenter (organeller och enzymer) som är mer kompatibla med uttryck av humana gensekvenser. Nackdelen med mammalieceller är att de växer långsamt och därmed ökar risken för kontamination. Vid lågt uttryck kan också kraftigare proteinextraktion än sonikering användas, men då kan proteinerna förstöras [10]. Vi lyckades att framgångsrikt klona samtliga sju Tsp1-domäner och rekombinera in dem i expressionsvektorer, vilka konfirmerades genom sekvensering. Transformanter innehållande samtliga konstruktioner genererades och induktion av produkter optimerades (genom kombination av IPTG och arabinos). Denna induktion ska utföras med ytterligare expressionsbakterier för att försöka uppnå ännu högre uttryck i fortsättningen av projektet. Proteiner ska extraheras med kraftigare sonikering och de renade proteinernas funktion ska provas på endotelceller (HUVEC). ACKNOWLEDGEMENT Först och främst vill jag framföra ett stort tack till min handledare Magnus Rosenkuist för ett mycket lärorikt examensarbete och för all hjälp jag fick med den laborativa och skriftliga arbetet. Jag vill även tacka Lillemor Funke Biomedicinsk analytiker som med sin stora erfarenhet hjälpte mig med laborerandet. Till sist vill jag tacka all personal på klinisk immunologi/c5/rudbeck som gjort min vistelse mycket trivsam. REFERENSER [1] S. Kellouche et al.: Platelets, thrombospondin-1 and human dermal fibroblasts cooperate for stimulation of endothelial cell tubulogenesis through VEGF and PAI-1 regulation. Experimental cell research. 2007;313(3):486-99 [2] B. Margosio et al.: Thrombospondin 1 as a scavenger for matrix-associated fibroblast growth factor 2. Blod. 2003;102(13):4399-406 [3] N. Esemuede et al.: The role of Thrombospondin-1 in human disease. Journal of Surgical Research. 2004;122(1):135-42 [4] D. F. Mosher: Physiology of Thrombospondin. Medicinal research reviews.1990; 41: 85-97 16

[5] D.S. Annis, et al.: Funktion-blocking antithrombospondin-1 monoclonal antibodies. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2006;4(2):459-68 [6] L. Tillmar and N. Welsh. In vitro cultured rat islets express genes that both prevent and promote angiogenesis. Journal of the Pancreas. 2004; 5(2): 81-91 [7] N. Narayan et al.: Arabinose-induction of lac-derived promoter systems for penicillin acylase production in Escherichia coli. Biotechnology progress. 2006; 22(3): 617-25 [8] D. Busso et al: Construction of a set Gateway-based destination vectors for high-throughput cloning and expression screening in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 2005;343(2):313-21 [9] K.Terpe: Overview of tag protein fusions; from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 2003; 60:523-533 [10] A. Ward et al.: E. coli expression and purification of human and cynomolgus IL-15. Protein expression and purification. 2009, E-pub ahead of print 17