Påvisande av Echinococcus multilocularis med specifikt fiske av mitokondrie-dna Åsa Hagström Statens Veterinärmedicinska Anstalt Avdelning för virologi, immunbiologi och parasitologi
Innehåll Bakgrund agens övervakning provtagning Utveckling av specifikt fiske Utförande av analysen Resultat
E. multilocularis Foto: KarinTroell/SVA
Värddjur: räv hund mårdhund varg (katt) Mellanvärd: sork (människa)
Angripen lever
Övervakning av E. multilocularis rävens dvärgbandmask 2000-2010 analyserades ca 300 rävar per år jägare skickade in hela djurkroppar tarmpaketet analyseras med tarmskrapning och mikroskopering
PCR parallellt med ordinarie övervakning 2010 testades en ny metod: äggflotation följd av magnetkulebaserad extraktion och echinocock- PCR med EvaGreen (CyberGreen). Positiva prov typades med konventionell PCR.
Fynd: Echinococcus multilocularis Feb 2011, för första gången i Sverige Räv, årsunge, hona, sköts dec 2010 15 km från Uddevalla Träckprov: äggisolering + PCR pos, därefter tarmundersökning rikligt med mask
Utökad övervakning 3000 rödrävar analyserades med den gamla metoden (SSCT) under perioden mars-juni 2011
Foto: Erik Ågren/SVA
Resultat av övervakningen Ytterligare 3 smittade rävar hittades Södermanland Dalarna Västra Götaland
Ytterligare övervakning insamling av ytterligare 4000 prover insamling av rävspillning runt fyndplatsen i Södermanland inom ett område som täcker cirka 2 000 kvadratkilometer.
Mål: enklare provberedning och större känslighet Tillräckligt bra om man får bättre utbyte än med äggflotation eller samma utbyte men enklare hantering, dvs större antal provberedningar per dag
Besvärliga prov Knepiga när man vill sätta upp molekylärdiagnostiska metoder är Prov som innehåller ett litet antal av den sökta patogenen Prov som innehåller mycket inhibitorer Prov där patogenen är ojämnt fördelad i provmaterialet
Robotextraktion direkt efter homogenisering ~10 ägg i 12 ml buffert 10 ägg sp 1:5 träckprov >> 10 ägg / 3 g
- Fånga upp DNA så att man kan koncentrera det - Analysera stor provvolym - Slippa alla inhibitorer
3 ml rävträck + 12 ml buffert (slutkonc NaCl2 1M) Homogenisera i MP-Bio: 6x[6,5/s; 12x15ml;1 min] zirkonkulor, 2 mm zirkonoxidkulor, 0,5 mm Centrifugera 10 min 3000 rpm Flytta över 8 ml av supernatanten till ett 15-ml rör
Borttagande av fritt biotin Sätt uppslammad sepharose till provet Rotator i rumstemperatur, 10 rpm, 45 minuter Centrifugera 3500g, 15min 6 ml supernatant flyttas till 10 ml-rör
Hybridisering av specifik prob Sätt fiskeprob till provet Denaturera i 15 min ~98 C i vattenbad Flytta till 55 C skakvattenbad i 45 min, ca 80/min (här sker hybridiseringen, dvs DNA binder till proben) Rotator i rumstemperatur, 15min
Fiske Dynal M-270 Streptavidinkulor sätts till provet Rotator i rumstemperatur 1 timme De biotinylerade (och eventuellt hybridiserade) proberna, binder till streptavidinet på kulorna.
Nordiag Bullet robot
AUTOMATISERAD TVÄTT Flytta proven till 24-brunns platta med pyramidbotten Tvätta enligt program i Bullen Det går att tvätta 48 prov åt gången
DENATURERING Sätt elueringsplattan i ett värmeblock 99 C 10 minuter Flytta över elueringsplattan till magnetställ och för över eluatet till ny platta
Till PCR PCR-kit SsoFast probes, tar ca 1 timme Duplikat
Validering Test resultat för 177 schweiziska rävprov MC- PCR SCT (Segmentation Counting technique) Pos Neg Tot Pos 82 18 100 Neg 11 66 77 Tot 93 84 177 antal maskar (sct) per djur antal rävar MC-PCR positiva 0 84 18 66 1 - < 11 26 21 5 10 - < 101 22 18 4 100 - < 1001 24 24 0 1000 - < 5001 15 15 0 < 100 000 6* 4 2 totalt antal prov 177 100 77 MC-PCR negativa Känsligheten MC-PCR jämfört med SCT (gold standard) är 88 % (82/93) Resultat från MC-PCR i relation till antal maskar funna med SCT *i två av rävarna hittade stora mängder mask. som alla var immatura och i en tredje räv hittades.. bara proglottider (segment)
Validering Bedömningen av specificiteten baseras på de rävträck som insamlades under den svenska övervakningen. Om man förutsätter att alla positiva prov var falskt positiva, är specificiteten minst 99,9 % (2156 / 2158)
Positiva prov hittills Dalarna, 1 Västra Götaland, 3 Småland, 1 Södermanland 2 +
Mats Isaksson Mikael Juremalm Helene Wahlström Erik Ågren SVA Anders Holmberg Morten Lukacs PSS Peter Deplazes Univ. Zurich
. Tack för er uppmärksamhet!