Umeå Universitet Biomedicinska analytikerprogrammet

Umeå Universitet Biomedicinska analytikerprogrammet Aktivering av T-cellsproliferation med konventionella antigenet Purified Protein Derivative, mitogenet Phytohemagglutinin och superantigenet Staphylococcus aureus enterotoxin B Årskull: Laborationsrapport i Labmedicin II, termin 6 Laborationsdatum: Inlämnad: Godkänd: Handledare:

Abstrakt Toxiner är en virulensfaktor, som produceras av vissa typer av bakterier. Dessa kan delas in i två grupper; endotoxiner och exotoxiner. Bland exotoxinerna finns så kallade superantigener som kan aktivera T-cellsproliferationen genom att binda till utsidan av T-cellsreceptorn (TCR) och MHC klass II, vilket skapar en kraftig T-cellsrespons med en massiv frisättning av cytokiner. Vid en Staphylococcus aureus infektion kan detta bland annat orsaka ett tillstånd som kallas för Toxic Schock Syndrome (TSS). Ett mitogen använder andra typer av mekanismer för att aktivera T-cellernas proliferation, bland annat förändras aktiviteten hos jon-kanalerna, vilket skapar en miljö för delning. Detektionen sker med 5-bromo-2 -deoxyuridine (BrdU) ELISA, där BrdU byggs in i DNAt hos cellerna som prolifererar istället för tymin. Hypotesen är att den polyklonala stimuleringen från Phytohemagglutinin (PHA) och Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB) kommer ge en större och snabbare proliferation än med det konventionella antigenet Purified Protein Derivative (PPD) både efter 4 och 6 dygn. Syftet med laborationen var att studera skillnaden i proliferationen hos T-lymfocyter med stimulans från PHA, SEB och PPD, efter 4 och 6 dygns inkubation, med hjälp av BrdU ELISA. Resultatet visade att celler som stimulerats med PHA hade den starkaste och snabbaste proliferationen, och SEB var de som hade näst starkast. Koncentrationen celler minskade från dygn 4 till dygn 6, vilket kan förklaras med anergi eller otillräckligt med näring. PPD hade en långsam proliferation som dock ökade från dygn 4 till dygn 6. Nyckelord: Proliferation, konventionellt protein, mitogen, superantigen, BrdU ELISA 1

Introduktion När kroppen invaderas av mikroorganismer, avsett deras patogenicitet, är virulensfaktorerna hos patogenen och värdens immunförsvar avgörande för resultatet. Mikroorganismers virulensfaktorer kan vara till exempel ytproteiner, toxiner eller invasiner som kan underlätta vid infektionen eller för att undkomma försvaret (1). Immunförsvaret är uppdelat i två delar ett medfött och ett inducerat försvar. Det medfödda är ospecifikt och agerar direkt mot en patogen men på samma sätt varje gång, till skillnad från det adaptiva som tar längre tid på sig att mobilisera, men är antigenspecifikt. Efter en infektion kan det adaptiva försvaret upprätta ett minne för att snabbare kunna bekämpa patogenen vid nästa infektionstillfälle (2). Just det adaptiva, cellmedierade immunförsvaret startar när en bakterie infekterar kroppen och den plockas upp av en antigenpresenterande cell (APC). APC sönderdelar och presenterar proteiner från bakterien på sin MHC klass II för T-cellsreceptorn (TCR) på T-cellerna, som då aktiveras. Men för att T-cellen ska stimuleras och frisätta cytokiner, för att bland annat aktivera andra typer av celler, så krävs det att TCR är specifik för just det antigenet som visas upp på MHC klass II. Som virulensfaktor kan vissa typer av bakterier producera toxiner. Toxinerna kan vara lipopolysaccharider, så kallade endotoxiner, och frisätts då från bakteriens cellvägg. De kan också bestå av proteiner som frisätts vid bakterietillväxt och lys, och benämns då som exotoxiner (3). Toxinerna verkar på olika delar av kroppen och kan till exempel vara cytotoxiska, enterotoxiska, neurotoxiska eller helt enkelt dödliga (3). De exotoxiner som aktiverar T-cellernas proliferation kallas för superantigener, och finns hos några grampositiver såsom staphylokock enterotoxin (serotyperna A- E, G, och H), grupp A streptokock pyrogenisk exotoxin (serotyperna A-C), staphylokock exfoliatin toxin och staphylokock TSST-1 (3). Dessa pyrogeniska exotoxin stimulerar till frisättning av cytokiner som kan leda till feber och i värsta fall orsaka chock hos individen (3). Ett superantigen behöver inte samma specificitet som ett konventionellt antigen gör, utan inducerar en massiv T-cellsaktivering genom att selektivt binda in till utsidan av den variabla delen hos TCR β-kedja (vβ-kedja) och MHC klass II (4,5). Ett superantigen kan alltså aktivera fler T-celler än vad ett konventionellt antigen kan (5). Som följd av stimuleringen sker en massiv frisättning av cytokiner (4) såsom IL-1, IL-6, TNF och GM-CSF (5). Förutom aktiveringen av T-cellerna kan responsen leda till en vβ-specifik deletion av celler eller anergi (6,7). Ett tillstånd av paralysering där T-cellerna inte svarar på stimuli till följd av en ofullständig co-stimulering, men är förknippat med upprepade stimulanser av superantigen (8,7). För att studera proliferationen av CD4+ T-celler in-vitro, används ett konventionellt protein; Purified Protein Derivative (PPD), ett mitogen; Phytohemagglutinin (PHA) och ett superantigen; Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)(9). PPD används vid Mantoux test (10) och fungerar som ett konventionellt antigen. Om specificiteten överensstämmer sker en monoklonal stimulering av T- cellerna och det blir en begränsad aktivering, som vid en normal infektion in-vivo. PHA, ett mitogen som kommer från röda kidney bönor (11), stimulerar T-cellerna till polyklonal expansion (4,12), och aktiverar utan specificitet. PHA agerar bland annat genom att förändra aktiviteten hos jon-kanalerna, vilket ökar den intracellulära koncentrationen av Ca 2+ och då även proliferationen (13). Superantigener kan verka utan specificiteten som krävs med konventionella antigen, dock måste vβ-kedjan hos TCR 2

passa för att bindningen ska kunna ske (14). SEB stimulerar till en polyklonal expansion och kan aktivera uppemot var femte T-cell, många fler än ett konventionellt protein som verkar på 1/10000 T- celler (14). Detta ger en onormalt hög frisättning av cytokiner, vilket kan ge upphov till Toxic Schock Syndrome (TSS). Hypotesen utgår ifrån antigenernas egenskaper där PHA kan aktivera utan specificitet och kommer därför att ha den snabbaste aktiveringen efter 4 dygn. SEB kommer också ha en snabb proliferation, men kräver ändå en viss specificitet och kan därför inte aktivera alla T-celler. Därför kommer koncentrationen vara högst hos SEB efter 6 dygn om inte cellerna går in i anergi. Eftersom PPD agerar som ett konventionellt antigen, kommer aktiveringen av T-cellerna att ta ett par dagar, såsom det adaptiva immunsvaret gör in-vivo. Därför kommer proliferationen öka från dygn 4 till dygn 6, men inte lika mycket som PHA och SEB. För att detektera proliferationen används 5-bromo-2 -deoxyuridine (BrdU) ELISA (15) som är ett icke-radioaktivt substitut till [ 3 H]-thymidine och inkorporeras i de prolifererande cellernas DNA istället för tymin. Efter cellerna har fixerats måste DNA denatureras för att antikropparna (anti-brdu- POD) ska kunna binda in till det BrdU som inkorporerats i DNAt. Substratet tetrametyl-benzidin (TMB) bildar en färgad produkt vid kontakt med immunkomplexen som bildats och genom att mäta absorbansen kan en kvantifiering göras. Den avlästa absorbansen korrelerar med proliferationen (15), där ett högre absorbansvärde innebär mer CD4+ T-celler. Blank-proverna kommer att ge information om ospecifik bindning av BrdU och då också antikropparna, medan bakgrunds-proverna avslöjar om det skett en ospecifik bindning av anti-brdu-pod, och fungerar därför som kontroller. Syftet med laborationen var att studera skillnaden i proliferationen hos T-lymfocyter med stimulans av PPD, PHA och SEB, efter 4 och 6 dygns inkubation, med hjälp av BrdU ELISA. Material och Metod Celler Mononukleära celler från venprov i CPT-rör. Rening av celler CPT-röret centrifugerades i 30 minuter vid 1510 RCF utan broms och de mononukleära cellerna överfördes till ett sterilt 15 ml centrifugrör. Ca 14 ml steril PBS tillfördes cellerna och centrifugerades i 15 minuter vid 300 RCF med broms. Supernatanten avlägsnades och cellerna resuspenderades med vortex innan 10 ml steril PBS tillsattes och röret centrifugerades i 10 minuter vid 300 RCF med broms. Koncentrationsbestämning Efter supernatanten tagits bort resuspenderades cellerna upptill ca fem ml med RPMI-medium (RPMI-1640, 10% fetalt kalv serum (FCS), Penicillin/Streptomycin (100 units/ml penicillin och 100 µg/ml Streptomycin)). 10µl applicerades på Bürkers kammare och antalet mononukleära celler i 16 B- rutor räknades. Cellerna späddes 1:10 till slutkoncentrationen 0,3 * 10^5 celler/ml. 3

Utodling 50 µl celler tillsattes till varje brunn på de två cellodlingsplattorna enligt B2-B11, C2-C11 och 100 µl celler till brunnarna E4-E5 (bakgrund). 50 µl av SEB med koncentrationen 20 ng/ml tillsattes till brunn C2-C6, PHA och PPD, båda med koncentrationen 10 µg/ml, tillsattes till B2-B6 respektive C7- C11. Till brunn B7-B11 (noll-brunnar) tillsattes 50 µl RPMI-medium och till brunn E2-E3 tillsattes 100 µl (blank). 200 µl sterilt vatten applicerades i brunnarna runt provbrunnarna och plattorna inkuberades i 37 C i 5% CO 2 i 4 respektive 6 dygn. BrdU 10 µl BrdU labeling solution (10 mm 5-bromo-2 -deoxyuridine i PBS, Roche Diagnositics GmbH, Penzberg,Tyskland) applicerades till brunnarna innehållande celler, med en slutkoncentration på 10 µm BrdU. Plattan återinkuberades därefter i 37 C i 5% CO 2 i ungefär fyra timmar. Lösningen i brunnarna blandades om med en pipett och centrifugerades vid 300 g i 10 minuter. Lösningen dekanterades från brunnarna och cellerna torkades med en hårtork i ca 15 minuter innan plattan placerades i kylskåp för längre förvaring. ELISA 200 µl FixDenat applicerades till alla brunnarna och inkuberades i 30 minuter i rumstemperatur. FixDenat hälldes bort innan 100 µl anti-brdu-pod working solution (Anti-BrdU-POD Stock Solution spädd 1:100 med antibody dilution solution) applicerades till brunnarna och inkuberades i 90 minuter i rumstemperatur. Innehållet hälldes bort och brunnarna tvättades tre gånger med 200 µl Washing solution (Dilute Washing buffer concentrate spädd 1:10 med destillerat vatten). 100 µl Substrate solution tillsattes till brunnarna och inkuberades i rumstemperatur i 10 minuter innan 25 µl 1 M H2SO4 (stop solution) tillsattes och plattan avlästes i spektrofotometer (Labsystem Multiskan PLUS) vid 450 nm. Statistik Q-test utfördes för att undersöka om extremvärden kunde strykas. F-test och t-test användes för att undersöka om spridningen och medelvärdena för respektive antigen hade förändrats från dygn 4 till dygn 6. Ytterligare tester med Mann Whitney U-test analyserade om det fanns en signifikant skillnad i medelvärdena hos respektive antigen. Vid undersökning av alla antigen tillsammans användes Anova One Way test för att undresöka om det fanns en signifikant skillnad och Post Hoc (Bonferroni) fastställde var den signifikanta skillnaden fanns. SPSS Statisics 17.0 och Excel 2003 användes vid analyserna. 4

Resultat De beräknade värden för medelvärde och median var jämna för PHA och PPD för både 4 och 6 dygn, och för SEB och Noll efter 6 dygn. Medelvärdet och medianen visade på en ojämn fördelning hos SEB och Noll efter 4 dygns inkubation, och absorbansvärdet 0,157 kunde strykas från resultatet för Noll, vilket gav ett nytt medelvärde på 0,0583, median 0,0585 och standardavvikelse 0,0097. Vid analys av skillnaden i spridningen hos absorbansvärdena för varje antigen mellan dygn 4 och dygn 6, fanns ingen signifikant skillnad (p>0,05). En signifikant skillnad i medelvärde (p<0,05) fanns hos PHA, PPD och SEB, men inte hos Noll. PHA hade signifikant högre medelvärde dygn 4 än dygn 6 (p=0,009), vilket även SEB (p=0,047) hade, till skillnad från PPD vars medelvärde var signifikant högre dygn 6 än dygn 4 (p=0,016). Ett högre medelvärde kunde ses dygn 6 än dygn 4 för Noll, men det fanns ingen signifikant skillnad (p=0,065), Tabell 2. Vid jämförelse av alla antigen mot varandra fanns en signifikant skillnad i medelvärde (p=7*10^-15), där största skillnaden fanns mellan PHA och Noll (p=2,34*10^-14), och minsta skillnaden mellan PHA och SEB (p=0,004), Figur 1. Inga Blank- eller Bakgrundsprover kontrollerades för ospecifik inbindning. Diskussion Medelvärdet och medianen visade på fördelningen av absorbansvärdena, ju närmre varandra de ligger desto jämnare är fördelningen. Eftersom värdena för SEB och Noll efter 4 dygn var ojämn så utfördes Q-test, där 0,157 kunde strykas och den nya beskrivande statistiken visade på en jämnare fördelning. När respektive antigens absorbansvärden från dygn 4 och dygn 6 jämfördes så fanns en signifikant skillnad för PHA, PPD och SEB, men inte för Noll. Det innebär att förändringen i medelvärdet mellan dygnen i Noll brunnarna berodde på slumpen. Detta eftersom det egentligen inte borde vara någon skillnad eftersom det inte skett någon aktivering i Noll brunnarna för de innehöll endast celler och odlingsmedium. Om ett absorbansvärde för utgångskoncentrationerna i brunnarna funnits, hade man kunnat se om det skett någon proliferation i Noll brunnarna. Proliferationen hade i sånt fall kunnat bero på redan aktiverade T-celler in-vivo eller IL-2 i provet som aktiverade in-vitro. Den minskning som skett från dygn 4 till dygn 6 kan förklaras med näringsbrist och den celldöd som sker naturligt. Den största skillnaden fanns mellan Noll och PHA, vilket innebär att den största proliferationen skett bland cellerna som aktiverats med PHA, såsom i hypotesen. Mitogenet stimulerar utan specificitet och kan därför snabbt aktivera alla T-celler i brunnarna, till skillnad från SEB, som också hade en snabb proliferation, som kräver en specificitet i vβ-kedjan hos TCR. PPD verkar som ett konventionellt antigen och hade därför en mindre och långsammare aktivering än både PHA och SEB. Normalt tas antigenen upp via APC innan det visas upp i MHC klass II för TCR, vilket dels ger ett fördröjt immunsvar, men också ett kontrollerat sådant, tills cellerna har förstört det främmande antigenet. Därför skedde aldrig den massiva ökningen av T-celler som man kunde se för PHA och SEB. Däremot skedde en ökning från dygn 4 till dygn 6 med PPD, medan en minskning kunde ses för både mitogenet och superantigenet. Detta kan bero på att den massiva cellproliferationen gjorde slut på näringen i odlingsmediumet och cellerna går in i apoptos, vilket inte förutsågs i hypotesen. Minskningen kan 5

även bero på att cellerna gick in i anergi på grund av den ofullständiga co-stimuleringen, men med SEB har forskning visat att det krävs upprepade behandlingar med superantigenet innan cellerna går in i anergi (8). Trots att den starkaste proliferationen skedde med mitogenet, så användes en högre koncentration av PHA (10 µg/ml) än för SEB (20 ng/ml), vilket skulle kunna vara anledningen till den större aktiveringen. Om man däremot applicerade samma koncentration av SEB till cellerna finns en risk att det skulle varit direkt letalt på grund av den massiva stimuleringen och bristen på näring som då skulle uppstå. Om man istället skulle använt en lägre koncentration av PHA och PPD, finns en risk att proliferationen blivit så liten att den inte kunnat detekteras alls. Så frågan är ifall resultaten för PHA och PPD i överhuvudtaget är jämförbara med SEB. Ett fastställande av vilka koncentrationer av PHA, PPD och SEB som är jämförbara krävs innan laborationen. En felkälla till laborationen var själva detektionsmetoden med BrdU ELISA. Detta eftersom det finns två sorter; colormetric och chemiluminescence, där forskning visat att chemiluminescence metoden är känsligare vid mätningar av cellers proliferation (16). Kanske kunde laborationen utförts med båda typer av detektionssystem för att kunna jämföra resultaten. Som slutsats kan man se att den starkaste proliferationen av T-celler skedde med PHA och SEB, eftersom de kan aktivera T-celler utan specificitet respektive mindre specificitet. SEB kräver en viss specificitet i vβ-kedjan hos TCR och kan därför inte aktivera alla T-celler, men för både mitogenet och superantigenet fås en polyklonal ökning. De sjunkande absorbansvärdena visade på anergi eller otillräcklig näringsmängd i brunnarna med PHA, SEB och Noll. PPD verkade som ett konventionellt antigen, vilket kräver en specificitet mellan antigenet och TCR, och endast en monoklonal stimulering skedde. Men man kunde se en ökning från dygn 4 till dygn 6. Noll brunnarna innehöll förutom celler endast odlingsmedium, där proliferationen förklardes med redan aktiverade T-celler in-vivo eller IL-2 cytokiner från blod som aktiverade in-vitro. Dock användes en högre koncentration av både PHA och PPD, än SEB. Men varken en ökad koncentration av SEB eller en minskad koncentration av PHA eller PPD skulle varit gynnande för laborationen. 6

Tabeller och Figurer Tabell 1. Visar uppmätta absorbansvärden för respektive antigen vid 4 och 6 dygns inkubation. Beskrivande statistik i form av medelvärde, median och standardavvikelse har inkluderats. Antigen Dygn Absorbans (450nm) Medelvärde Median Std.av 1 2 3 4 5 PHA 4 1,178 1,091 0,997 0,947 0,889 1,020 0,997 0,115 6 0,823 0,745 0,856 0,888 0,679 0,798 0,823 0,085 PPD 4 0,198 0,257 0,143 0,317 0,099 0,203 0,198 0,087 6 0,427 0,394 0,299 0,412 0,345 0,375 0,394 0,053 SEB 4 0,849 0,934 0,522** 0,978 0,812 0,819 0,849 0,179 6 0,455 0,399 0,644 0,602 0,534 0,527 0,534 0,101 Noll 4 0,065 0,048 0,068 0,157* 0,052 0,078 0,065 0,045 6 0,044 0,039 0,056 0,048 0,029 0,043 0,044 0,01 *) Absorbansvärde som kunde strykas med Q-test, vilket ger det nya medelvärdet 0,0583, medianen 0,0585 och standardavvikelsen 0,0097. **) Absorbansvärde som inte kunde strykas med Q-test. Tabell 2. Beräknade p-värden för F-test, t-test och Mann Whitney U-test, för respektive antigen. Signifikant skillnad gäller för p<0,05. p-värden F-test t-test U-test PHA 0,461 0,008 0,009 PPD 0,295 0,005 0,016 SEB 0,477 0,013 0,047 Noll 0,782 0,059 0,065 7

Figur 1. Visar de uppmätta absorbansvärdena grupperade efter respektive antigen; Noll, PHA, PPD och SEB, och inkubationstiden; 4 dygn och 6 dygn. p-värden för den signifikanta skillnaden mellan Noll och PHA respektive PHA och SEB är inkluderade. *) En outlier, men som inte kunde strykas med Q-test. Referenser 1. Todar K, Ph.D. 2011. Staphylococcus aureus. Todar s Online Textbook of Bacteriology. < http://www.textbookofbacteriology.net/staph_2.html> (Hämtad 2011-03-15) 2. Todar K, Ph.D. 2011. Immune Defence against Bacterial Pathogens: Innate Immunity. Todar s Online Textbook of Bacteriology. <http://www.textbookofbacteriology.net/innate.html> 3. Todar K, Ph.D. 2011. Bacterial Protein Toxins. Todar s Online Textbook of Bacteriology. <http://www.textbookofbacteriology.net/proteintoxins.html> (Hämtad 2011-03-06) 4. Norrby-Teglund A et al. 1994. Superantigenic properties of the group A streptococcal exotoxin SpeF (MF). Infect Immun. 62(12): 5227 5233. <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7960098> 5. Hemalatha V et al. 2004. Superantigens Concepts, clinical disease and therapy. Indian Journal of Macrobiology. 22(4): 204 211. <http://www.ijmm.org/article.asp?issn=0255-0857;year=2004;volume=22;issue=4;spage=204;epage=211;aulast=hemalatha> 6. Watson AR och Lee. 2006. Defective T cell receptor-mediated transduction in memory CD4 T lymfocytes exposed to superantigen or anti-t cell receptor antibodies. Cell Immunol. 242(2): 80 90. <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17083922> 8

7. Vaishnani J. 2009. Superantigen. Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 75(5): 540 544. <http://www.ijdvl.com/article.asp?issn=0378-6323;year=2009;volume=75;issue=5;spage=540;epage=544;aulast=vaishnani> 8. Huang Y et al. 2007. Response of T cells in vivo induced by repeated superantigen treatments at different time intervals. Acta Biochim Biophys Sin. 39(7): 467 474. <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17622466> 9-. Dinges M et al. 2000. Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clinical Microbiology Reviews. 13(1): 16 34. <http://cmr.asm.org/cgi/content/full/13/1/16?view=full&pmid=10627489> 10. Todar K, Ph.D. 2011. Immune Defence against Bacterial Pathogenes: Adaptive or Acquried Immunity. Todar s Online Textbook of Bacteriology. <http://www.textbookofbacteriology.net/adaptive_6.html> (Hämtad 2011-03-06) 11. Kosti O et al. 2010. Phytohemagglutinin-induced mitotic index in blood lymphocytes: a potential biomarker for breast cancer risk. Breast Cancer (Auckl). 15(4): 73 83. <http://proxy.ub.umu.se:2061/pubmed/21234289> 12. Houghton Mifflin Company. 2004. Mitogen. The American Heritage Medical Dictionary. <http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/mitogen> (Hämtad 2011-03-06) 13. Pieri C et al. 1992. The response of human lymfocytes to phytohemagglutinin is impaired at different levels during aging. Ann N Y Acad Sci. 26(673): 110 119. <http://proxy.ub.umu.se:2061/pubmed/1485708> 14. Todar K, Ph.D. 2011. Staphylococcus. Todar s Online Textbook of Bacteriology. <http://textbookofbacteriology.net/staph_4.html> (Hämtad 2011-03-06) 15. Roche Diagnostics. Product Page: Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric). Roche Applied Sciences. <https://www.roche-applied- science.com/servlet/rcproductdisplay?storeid=10151&catalogid=10151&langid=- 1&countryId=se&forCountryId=se&productId=3.5.3.21.1.8> (Hämtad 2011-03-08) 16. Profit S och Unteregger G. 2001. Quantitative Measurement of Cell Proliferation Using the BrdU ELISA: A Comparison Between Colorimetric and Chemiluminesent Detection. BIOCHEMICA. 4. 9