EKOLOGI MILJÖ OCH GEOVETENSKAP MIKROBIOLOGISK UNDERSÖKNING OCH KEMISKA ANALYSER AV LIVSMEDEL

EKOLOGI MILJÖ OCH GEOVETENSKAP MIKROBIOLOGISK UNDERSÖKNING OCH KEMISKA ANALYSER AV LIVSMEDEL

Schema för mikrobiologisk undersökning av livsmedel Dag 1 Principer för bakteriologisk undersökning av livsmedel Ansättning Dag 2 Avläsning Konfirmering Dag 3 Avläsning Konfirmering Dag 4 Avläsning Konfirmering Redovisning 2

ANSÄTTNING AV LIVSMEDEL, EX. FALUKORV MATERIAL 10 g prov 90 ml peptonvatten i flaska Steril plastpåse Spädningsrör med 9 ml peptonvatten Sterila petriskålar Smält TGE-agar Färdiga blodagarplattor Smält VRG-G-agar (gjuts i 2 lager) ETGP-platta/or Bacillus cereus-platta/or SFP-platta (gjuts i 2 lager) Skål med 70 % etanol Rackla Pipetter (sterila) UTFÖRANDE Väg upp 10 g (1 decimal) prov i en steril plastpåse. Tillsätt 90 ml peptonvatten i plast-påsen. Kör i stomacher 1 minut så att provet homogeniseras. Detta blir spädning 1:10. Vi kallar den 1, dvs. första spädningen. Gör därefter en spädningsserie i provrören genom att ta 1 ml direkt ur plastpåsen (spädning 1, till första spädningsröret. Du gör då åter igen en 1:10 spädning och får som resultat spädning 1:100, dvs spädning 2. Byt pipett och fortsätt likadant i alla rör. OBS! Byt pipett mellan varje rör och var noga med att alltid bränna av pipetten. Man får aldrig blåsa ur en pipett med munnen. OBS! MÄT ph FRÅN SPÄDNING 1. 3

DETTA ÄR ENDAST ETT EXEMPEL Märk upp plattor enligt spädningsschema sid 5 och 6. PLATTORNA Av de odlingssubstrat som används här är fyra av substraten färdiggjutna: ETGP (för Staphylococcus aureus) Cereus (för Bacillus cereus) SFP (för Cl. perfringens) Blodagarplattor ( hämolyserande bakterier och typ av bakterieflora) Två substrattyper gjuter du själv vid ansättningen: TGE (för Totalantal) VRG-G (för Enterobacteriaceae +37 och E-coli +44 C). Två av substraten skall gjutas i två lager: VRG-G (för Enterobacteriaceae +37, E-coli +44 ) SFP (för Clostridium perfringens) OBS! SFP-plattan är redan gjuten ett lager när du får den. Lager två görs av lab.personal. När du gjuter plattorna observera att agarlagret inte får vara för tunt utan gjut minst ett 5 mm tjockt lager så att inte agarn torkar. Detta är gäller framförallt TGEplattorna (för totalantal) eftersom de skall vara i odlingsskåp under 3 dygn. 4

TOTALANTAL (TGE) OCH ENTEROBACTERIACEAE +37 OCH E-COLI +44 (VRG-G) Tag 1 ml ur resp spädningsrör och överför till den uppmärkta plattan. Gjut därefter över med "handvarm" agar och blanda in provet ordentligt. Du skall använda TGE-agar till totalplattorna och VRG-G agar till Enterobacteriaceae +37 och E-coli +44 -plattorna (gjuts i två lager). BACILLUS CEREUS, STAF (ETGP) OCH CL. PERFRINGENS (SFP), BLODAGARPLATTOR Tag endast o,1ml ur respektive spädningsrör och överför till den uppmärkta färdiggjutna plattan. Ex: för att få spädning 3, tar du 0.1 ml ur spädningsrör 2 och överför till den uppmärkta plattan. Sprid provet över agarytan med hjälp av steril rackla genom att doppa racklan i sprit, bränn av försiktigt och låt den svalna. Snurra sedan plattan medan du håller racklan mot agarytan. Försök att få spridningen jämn över plattan. INKUBERING Ställ in alla plattor i termostat 30, 37 eller 44 (s 5-6). OBS! SFP-plattan skall gå anaerobt över natten, så att den kommer att samlas in och ställas i en anaerobklocka. Se till att alla plattorna är ordentligt märkta med namn eller gruppnummer. Märk plattorna i bottnen där agarn finns. Plattorna inkuberas upp- och nedvända. ANVISNINGAR FÖR SPRIDNING AV LIVSMEDEL (spädningsschema) VÄRMEBEHANDLADE PRODUKTER ex falukorv Totalantal: TGE-agar, 3 dygn +30 C Spädningar: 3,4,5,6. Hämolyserande: Blodagar, 2 dygn +37 c Spädningar: 2,3,4. Enterobacteriaceae: VRG-G agar, 1 dygn +37 C Spädningar: 2,3,4. E-coli: VRG-G agar, 1dygn +44 C Spädning: 1,2. Staphylococcus aureus: ETGP-agar, 2 dygn +37 C Spädning: 2. Bacillus cereus: Cereus-platta, 2 dygn +30 C. Spädning: 2. Anaeroba sporbildare: SFP-agar, 2 dygn +37 C (anaerobklocka). Spädning: 3. 5

RÅA KÖTTPRODUKTER ex fläsk II, fett fläsk, nöt III Totalantal: TGE-agar, 3 dygn +30 C Spädningar: 4,5,6,7. Hämolyserande: Blodagarplatta, 2 dygn +37 C Spädningar: 3,4,5. Enterobacteriaceae +37 C: VRG-G agar, 1 dygn +37 C Spädningar: 3,4. E-coli +44 C: VRG-G agar, 1 dygn +44 C Spädningar: 2,3. Staphylococcus aureus: ETGP-agar, 2 dygn +37 C Spädning: 3. Bacillus cereus: Cereus-platta, 2 dygn +30 C. Spädning: 3,4. Anaeroba sporbildare: SFP-platta,, 2 dygn +37 C (anaerobklocka). Spädning: 3. MJUKGLASS Totalantal: TGE-agar, 3 dygn +30 C Spädningar 2,3,4 Enterobacteriaceae: VRG-G agar, 1 dygn +37 C Spädningar 1,2,3 Staphylococcus aureus: ETGP-agar, 2 dygn +37 C Spädningar 2 Bacillus cereus: Cereus-platta, 2 dygn +30 C. Spädningar 2,3,4,5 6

AVLÄSNING OCH KONFIRMERING Totalantal aeroba bakterier Alla bakterier räknas, oberoende av färg och form. Räkna platta med koloniantal mellan 30 och 300. Om det inte finns någon platta där antal kolonier ligger mellan 30-300 så får ni räkna på den platta där tillväxt finns. Använd lupp. Blodagarplatta Ger upplysning om antal och typ av eventuellt förekommande aeroba hemolyserande (ev patogena) bakterier samt en orientering om mikroflorans sammansättning i övrigt. Den kunnige mikrobiologen kan skilja patogena bakterier från icke patogena och genom att avläsa blodplattan "parallellt" med de selektiva substraten kan olika bakteriearter urskiljas, t.ex. S. aureus, B. cereus, ß-hemolyserande streptokocker. Betrakta och begrunda plattan. Eventuellt kan "misstänkta" kolonier gramfärgas. Enterobacteriaceae + 37 C Alla rosa till röda kolonier räknas. Räkna platta med koloniantal mellan 15 och 150. Om det inte finns någon platta där antal kolonier ligger mellan 15-150 så får ni räkna på den platta där tillväxt finns. Konfirmering: Fem kolonier med ovanstående kriterier uppfyllda överförs till en blodagarplatta. Inkubera i 37 C i 1 dygn. Konfirmera med oxidastest. Enterobakteriaceae är oxidasnegativa. Ingen färgförändring på stickan- oxidasenegativ Om blå färg på stickan oxidaspostiv- ingen enterobakteriaceae E-coli +44 C Alla rosa till röda kolonier räknas. Räkna platta med koloniantal mellan 15 och 150. Om det inte finns någon platta där antal kolonier ligger mellan 15-150 så får ni räkna på den platta där tillväxt finns. Fem kolonier med ovanstående kriterier uppfyllda överförs till var sitt förvärmt laktostryptofanbuljongrör (LTB) och inkuberas i 1 dygn i + 44 C. Läs av rören: Notera alla rör med gasbildning. Konfirmera dessa rör med indoltest. Håll till i dragskåp och använd hanskar. Indoltest: Tillsätt 0,5 ml Kovac s reagens till rör med gasbildning. Om det bildas en röd ring E-coli 7

Staphylococcus aureus För att preliminärt bedömas som S. aureus skall kolonierna uppfylla fyra kriterier: 1. svart färg 2. inre grumlig zon 3. yttre klar zon 4. kolonierna är oljeskimrande Konfirmering: Fem kolonier som uppfyller ovanstående kriterier stryks på en blodplatta som inkuberas ett dygn i 37 C. Kolonierna testas sedan på koagulasbildning (Se separat metodbeskrivning). Jämför med blodplatta. Bacillus cereus Stora ojämna, skära kolonier med en oregelbunden kant omgivna av en bred skär precipitationszon bedöms som Bacillus cereus. Konfirmering: Gramfärga samt jämför med blodplatta Clostridium perfringens Svarta kolonier omgivna av en grumlig utfällningszon bedöms preliminärt som Cl. perfringens. Konfirmering: Fem kolonier konfirmeras på två blodplattor, som inkuberas aerobt respektive anaerobt ett dygn i 44 C. Cl. perfringens växer med stora genomskinliga kolonier med oregelbunden kant och dubbla hemolyszoner. De växer endast på den anaeroba plattan. BEDÖMNING Se (EG) 2073 Mikrobiologiska kriterier för livsmedel Vägledning: Livsmedelsprovtagning i offentlig kontroll och mikrobiologisk bedömning av livsmedelsprov. Resultat, Bakteriologisk undersökning Provtyp: Ditt resultat: Totalantal aeroba bakt. 30 C 3 dygn Enterobacteriaceae 37, 2 dygn E-coli 44 C, 2 dygn Staphylococcus aureus 37 C, 2 dygn Bacillus cereus 30, 2 dygn Clostridium perfringens 44 C, 2 dygn log ant/g log ant/g log ant/g log ant/g log ant/g log ant/g ph 8

SUBSTRATFÖRTECKNING Blodagarplatta: Innehåller BAB (Blood agar base) och 5-10 % nötblod. Substratet används bl a för att studera hemolysformer. alfa- hemolys: ej fullständig uppklarning i substratet, grönskimrande beta- hemolys: fullständig uppklarning i substratet gamma- hemolys: ingen uppklarning i substratet Cereus-platta: Cereus Selective Agar by Mossel, innehåller bl a fenolrött och mannitol. Vid gjutning tillsätts polymyxin-b-sulfat och äggula.specialsubstrat för Bacillus Cereus Fenolrött - indikator, röd i basisk miljö, gul i sur Mannitol - bryts ned av vissa bakterier till sura produkter. Bacillus Cereus är mannitol-negativt (bryter ej ned mannitol) Polymixin-B-sulfat - antibiotika som hindrar växt av andra bakterier Äggula - medför att substratet blir ogenomskinligt. Bacillus Cereus producerar lecitinas. Nedbrytningsprodukter av lecitin i substratet bildar utfällningszoner runt kolonierna, s k egg-yolk reaction. ETGP-platta: Baird-Parker medium, innehåller bl a glycin, litiumklorid och pyruvat. Vid gjutning tillsätts kaliumtellurit och äggula. Specialsubstrat för Staphylococcus aureus Glycin och pyruvat - stimulerar tillväxt av stafylokocker Kaliumtellurit och litiumklorid - hämmar växt av övriga bakterier. Tellurit reduceras av stafylokocker till tellur som är svart Äggula - medför att substratet blir ogenomskinligt. Bakterier som bryter ned fett och proteiner bildar karaktäristiska utfällnings- och uppklarningszoner runt kolonierna i substratet, s k egg-yolkreaction. SFP-platta: Shahidi-Ferguson Perfringens agar, innehåller bl a järnammoniumcitrat och natriumdisulfit. Vid gjutning tillsätts D-cykloserin och äggula. Specialsubstrat för Clostridium perfringens. D-cykloserin - antibiotika som hindrar växt av andra bakterier Järnammoniumcitrat - järnet reduceras och bildar järnsulfid som är svart. Äggula - medför att substratet blir ogenomskinligt. Fettnedbrytande bakterier bildar utfällningszoner runt kolonierna i substratet s k egg-yolk reaction LTB-buljong: Selektivt medium som används som presumtivt test för coliforma bakterier. Innehåller laktose, trypton, lauryl sulfat. Vid konfirmering av misstänkt e.coli odlas provet i LTB-buljong 1 dygn +37 o. Om det bildats gas i durhamröret tillsätts 0,5 ml Kovac s indolreagens till buljongen. Om det är positiv reaktion så färgas den överförda indolen rosaröd. Detta innebär att det är e.coli. 9

Näringsvärdesberäkning av korv Syfte: Bestämma vatten- och askhalt, fett och protein genom kemiska analyser. Halten kolhydrater är den mängd som kvarstår när man har dragit bort vattenhalt, aska, fett och protein. Samtliga värden ska redovisas och jämföras med innehållsförteckningen. Provberedning: Dela upp 250 g korv (ca 1 dm) i mindre bitar och anteckna om det är ändbit eller mittbit. Homogenisera provet i matberedare. Överför homogenatet till en honungsburk. 1 burk/2 grupper Förvara provet i kylskåp. Använd samma våg för samtliga vägningar. Schema Dag 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4 Vatten-, ask-, fett- och proteinhalt Vatten-, ask-, fett- och proteinhalt Fett- och kolhydrathalt Förberedelser för laborationsredovisning Redovisning av kemlaborationer Fakta om näringsämnet; kemiskt, näringsförändringar vid tillagning och förvaring samt näringsrekommendationer. Beskriv analysmetoden schematiskt och beskriv teorin bakom samt ange eventuella för- och nackdelar med metoden. Kort om alternativa analysmetoder och deras för- och nackdelar. Ange max, medel, median och minvärden för näringsämnet samt ange eventuella felkällor. Redovisa med PP i 10 min 10

Bestämning av vattenhalt i korv DAG 1 DAG 2 1. Väg en märkt, torkad aluminiumdosa med lock och anteckna vikten. OBS! Ta inte i dosan med fingrarna. Använd tång eller papper. 2. Placera botten av dosan på vågen och nollställ. 3. Väg in ca 2-3 g korvhomogenat med 3 decimalers noggrannhet. Anteckna korvhomogenatets vikt. 4. Bred ut provet över botten. 5. Placera aluminiumdosan med locket under dosan i värmeskåpet över natten i 100-105 o C. 6. Provet tas ut med tång/pappershandduk och locket sätts på. Låt svalna i exsickator. 7. Aluminiumdosan med lock och prov vägs. 8. Låt inte provet stå för länge iom att fettoxidation kan ske. 9. Provets vattenhalt i anges i % samt i g/100g korv med en decimals noggrannhet. Vattenhaltsbestämning Provslag Al-dosa inkl.lock väger Provmängd Al-dosa inkl.lock + prov efter torkning Vattenhalt Vatten g g g g g/100g livsmedel 11

Bestämning av askhalt i korv Askhalt är halten icke förbränningsbart material som mineralämnen och salter. DAG 1 1. Använd alltid en tång eller papper när du tar i degeln. 2. Väg den torkade degeln, anteckna vikten och nollställ sedan vågen. 3. Väg in ca 5-6 g korvhomogenat med 3 decimalers noggrannhet. Anteckna vikten. 4. Ställ degeln på ett rutmärkt papper bredvid den elektriska ugnen. Notera numret för er ruta. Lab.ass ställer sedan in samtliga deglar i ugnen och detta förbränns över natt i 550 o C. DAG 2 5. Askan ska vara vit eller ljust grå när alla kolpartiklar är förbrända. 6. Degeln får svalna i exsickator i ca 30 minuter. Degel och prov vägs. 7. Provets askhalt anges i g/100g korv med en decimals noggrannhet. Askbestämning Provslag Degelns vikt Provmängd Degel + inaskat prov väger Askmängd Askhalt g g g g g/100 g livsmedel 12

Bestämning av fetthalt i korv DAG 1 1. Lägg en liten bit aluminiumfolie på vågskålen och nollställ vågen. 2. Väg ca 2 g korvhomogenat på aluminiumfoliet med 3 decimalers noggrannhet. Anteckna vikten. 3. Vik ihop aluminiumfolien med korvhomogenatet och för ner den i botten på oströret, utan att det blir smet på rörets vägg. Arbeta i dragskåp med skyddsglasögon. 4. Överför med pipett 10 ml 7,7 M saltsyra till provet. Försiktigt, på grund av häftig reaktion mellan syra och aluminium. 5. Märk röret och värm provet i 80-gradigt vattenbad under 1 h. Skaka provet då och då för att påskynda reaktionen. 6. Låt provet svalna i ett par minuter. 7. Pipettera över 10 ml etanol till oströret (sänker ytspänningen). 8. Sätt på en kokad kork och blanda försiktigt. 9. Kyl oströret under rinnande vatten. 10. Använd mätglas och tillsätt 25 ml dietyleter till oströret. 11. Sätt på korken igen och vänd den upp och ner. 12. Lätta på korken och upprepa proceduren tills det slutar pysa. 13. Skaka röret kraftigt. 14. Använd mätglas och tillsätt 25 ml petroleumeter till oströret. 15. Vänd oströret upp och ner c 20 ggr. 16. Blandningen får separera över natt, så att eterskiktet blir klart. Låt stå i dragskåp. 17. Märk en 150 ml E-kolv och lägg i 5 st kokstenar och torka denna över natt vid 105 o C. Ta inte i E-kolven med fingrarna efter torkning. 13

DAG 2 18. Väg E-kolven med 3 decimalers noggrannhet. Anteckna vikten. 19. Dietyl/petroleumskiktet häverteras ner i E-kolven tills att det återstår 3 cm av dietyleter/petroleumeterfasen i oströret. 20. Mellan häverteringarna ställs E-kolv med dietyletern/petroleumetern på varmt vattenbad för att dietyleter/petroleumeter ska avdunsta. 21. Använd mätglas och tillsätt 30 ml dietyleter/petroleumblandning till lösningen i oströret. Vänd oströret 2 ggr och hävertera eterfasen efter 1 timme, så att 3 cm av dietyleter/petroleumetern kvarstår. 22. Använd mätglas och tillsätt ytterligare 50 ml dietyleter/petroleumeterblandning till oströret. 23. Röret skakas. 24. När dietyleter/petroleumeterfasen är klart häverteras dietyleter/petroleumskiktet återigen på samma sätt som tidigare. 25. Då sista häverteringen gjorts, får E-kolven dietyleter/petroleumeter avdunsta till dess att lukten är borta. 25. Kolven ställs sedan in i 105 o C värmeskåp under natten. Sköts av personal. 14

DAG 3 26. Avsvalning av E-kolv, sker i exsickator. 26. E-kolven vägs och vikten antecknas. 27. Provets fetthalt beräknas och anges i g/100g korv med en decimals noggrannhet. Fettbestämning enligt SBR Provmängd Kolvens vikt Kolv + fett väger Fettmängd Fettmängd Fetthalt enligt innehållsdeklaration g g g g g/100 g livsmedel g/100 g livsmedel 15

Bestämning av proteinhalt i korv Teori för Kjeldahlmetoden: 1. Förbränning: Homogeniserad korv kokas i koncentrerad svavelsyra, då kväve bildar en ammoniumsulfatlösning. 2. Destillation: Överskott av NaOH tillsätts för att omvandla ammoniumsulfat till ammoniak. När ammoniak destilleras över till förlaget med indikatorer kommer det ske en färgförändring från grått till grönt. 3. Titrering av ammoniak med saltsyra. När all ammoniak har reagerat med saltsyra kommer indikatorn att ändra färg till grått. DAG 1 Förbränning 1. Ta en liten bit aluminiumfolie och nollställ vågen. 2. Väg upp 1 g korvsmet med 3 decimalers noggrannhet. Korvens vikt g 3. Överför det aluminiumtäckta provet till uppslutningsröret. 4. Tillför 1 Kjeltablett med pincett 5 ml 0,1 M CuSO 4 /kopparsulfat med pipett 16

Labbassistenten gör följande: 5. Tillsätter 15 ml konc H 2 SO 4 /svavelsyra med pipett i dragskåpet med förbränningsblocket. 6. Ställer ner rören i förbränningsblocket (c 420 o C) för våtföraskning i 3 timmar. DAG 2 Destillation 7. Uppslutningsröret sätts fast i destillationsapparaten (Kjehldahl). 8. Pipettera 25 ml av indikatorlösningen till E-kolv/förlaget. 8. E-kolv med indikatorlösningen placeras på plattan och programmet sätts igång. 9. Programmet kommer att späda provet med 80 ml vatten och tillsätta 50 ml 40% NaOH. 10. Destillationen kommer att ske under 4 minuter och förlaget kommer att skifta från grått till grönt när ammoniak (alkalisk) destilleras över. 17

Titrering 1. Fyll byretten med 0,1 M (mol/dm 3 ) HCl. 2. Tillför en magnetloppa till E-kolven med förlaget. 3. Titrera droppvis ned HCl i E-kolven under omröring. 4. Anteckna volymen HCl som har gått åt när lösningen fått grå färg. 5. Gör beräkningar av mängden protein i provet i procent samt protein/100 g livsmedel. 6. Beräkna sedan andel kolhydrater i g/100g eller i procent genom att dra bort vatten-, ask-, protein- och fetthalt från den totala vikten av korvhomogenatet. OBS! Första gruppen titrerar ett blankprov som har genomgått våtaskning och destillation, men saknar prov. Den volym saltsyra som åtgår vid denna titrering dras ifrån den mängd saltsyra som åtgår vid titrering av proverna. 18

Tips för att du lättare ska kunna räkna ut proteinhalten i korven: Tips 1: antalet mol N (kväve) = antalet mol HCl (titrerad) n (mol) = V (dm 3 ) x C (mol/dm 3 ) Tips 2: Hur många gram är x mol N? m (g) = n (mol) x M w (g/mol) Tips 3: 1 g kväve (N) = 6,25 g protein Uträkning av näringsvärde enligt recept på falukorv Råvara Vikt (kg) Vatten (vikt %) Fett (vikt %) Protein (vikt %) Kolhydrat (vikt %) Vatten/is 9,1 100 Nöt III 6,0 60 23 17 Fläsk II 3,7 60 23 16 Fläsk IV 4,7 25 67 7 Kryddor 0,17 78 Nitrit 0,4 Potatismjöl 0,9 20 80 Beräknad vikt och energi Total mängd 24,97 Vikts % _ Total energi Energi % Energiprocent (E%) = energin från ett näringsämne x 100 total energimängden i livsmedlet 1 g fett = 9 kcal/ 37 KJ 1 g protein/kolhydrat = 4 kcal/ 17 KJ 19