IFM/Kemi Linköpings Universitet Maj 2008/LGM Laboration i genteknik
Restriktionskarta av pcantab Restriktionsklyvning samt separation av DNA-fragment mha agarosgelelektrofores Material: pcantab (minst 35 L med konc. 100 ng/ L) Restriktionsenzymer: EcoRI, BamHI samt HindIII med konc. 2U/ L. OBS! Förvaras hela tiden på is. 10x Multi-Core restriktionsbuffert (M-C buffert) 6x Laddningsbuffert (50 glycerol, 50 10xTBE + 0.25 BFB) Sterilt avjoniserat/destillerat vatten Molekylviktsstandard (Pharmacia: 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 8, 10 kilobaspar) Sterila eppendorfrör samt automatpipettspetsar 70 etanol Skyddshandskar Värmeblock Bordscentrifug Agaros 10xTBE (1 L:108 g Tris, 7.2 g EDTA, 55 g Borsyra, ph 8.4) Etidiumbromid (0.5 g/ml i vatten) OBS! cancerogent, använd handskar! 1. Provberedning för restriktionsklyvning (totalvolym 20 L): Prov nr. 1 2 3 4 5 6 BamHI EcoRI HindIII BamHI+EcoRI BamHI+HindIII HindIII+EcoRI Vatten 12 L 12 L 12 L 11 L 11 L 11 L M-C buffert 2 L 2 L 2 L 2 L 2 L 2 L p-cantab 5 L 5 L 5 L 5 L 5 L 5 L Enzym 1 L 1 L 1 L 1 +1 L 1 +1 L 1 +1 L Tillsätt lösningarna uppifrån och ner i tabellen samt blanda vid varje tillsats. Märk rören väl! Blanda och centrifugera i 15 sek. Inkubera vid 37 C i 1 h. Gjutning av agarosgel: 1. Väg upp 1 g agaros och lös i 100 ml 1xTBE. 2. Värm försiktigt i mikrovågsugnen tills lösningen är helt flytande (1-1½ min). 3. Låt lösningen svalna till ca 60 C och gjut agarosgelen ( ca 5 mm tjock). 4. Låt gelen svalna i minst 30 min. Nu är det dags att börja med plasmidpreparationen!
Elektroforetisk separation av DNA-fragmenten Provberedning för elektroforetisk separation på agarosgel: Blanda 2 L laddningsbuffert med 10 L klyvd plasmid. Blanda 2 L laddningsbuffert 2 L oklyvplasmid och 2 μl H 2 O. Blanda 2 L laddningsbuffert med 5 μl molekylviktstandard och 5 L H 2 O. Blanda 2 μl laddningsbuffert med 5 μl av den preppade plasmiden. - Lägg agarosgelen i elektroforesapparaten och fyll på med 1xTBE, så att det täcker gelen. - Applicera sakta och försiktigt proverna i provbrunnarna med en automatpipett. Kom ihåg att notera var på gelen vilket prov appliceras. - Separera DNA-fragmenten genom att lägga på en spänning motsvarande ca 10 V/cm. (Kom ihåg att DNA är negativt laddat.) - Avbryt separationen när BFB-markören har vandrat ca 2/3 ner på gelen. - Färga in DNA-fragmenten med etiduimbromid (ca 10 min). Etidiumbromid som interkalerar med DNA kan ses genom att belysa gelen med 300-360 nm ljus på en transluminator. Skydda ögonen genom att använda skyddsglasögen för att undvika grå starr i förtid! EtBr cancerogent, använd handskar! - Fotografera av gelen och mät vandringen av DNA-fragmenten med linjal. Redovisning: Rita en graf där log baspar är avsatt mot vandringslängden för molekylviktsstandardfragmenten. Bestäm storleken (antal baspar) på fragmenten från klyvningen av pcantab samt bestäm storleken på den oklyvda plasmiden Sammanställ en restriktionskarta för pcantab med klyvningställenas relativa positioner. Varför uppför sej inte oklyvd plasmid och enkelklyvd plasmid likadant på agarosgelen?
Preparation av plasmid Material: 25 ml Odlingskolvar LB-medium Ampicillin (stamlösning) Qiaprep spinnkolonnkitts Autoklaverade eppendorfrör och pipettspetsar Sterilt vatten Utförande Preparation av plasmid För preparationen av plasmid kommer ett färdigt kit att användas (QiaPrep spinnkit). Detta kit bygger på att plasmid DNA:t renas på en minikolonn där DNAt binds upp på en scilicagel. Dagen innan plasmidpreparationen har övernattskulturer av E. Coli med den önskade plasmiden i iordningställs. Odlingskolvar innehåller 10ml odlingsmedium och ampicillin. Till detta har satts en bakteriekoloni, innehållande önskad plasmid, från en LB-Amp platta från en tidigare transformation. Odlingarna har fått växa över natt i 37 C med skak. Den plasmid som preppas på denna kurs kommer att användas till liknande laborationer på andra kurser längre fram! 1) Varje grupp fyller två 1,5 ml eppendorfrör med övernattskultur av E. coli med den plasmid som ni ska preparera. 2) Centrifugera i bordcentrifug 10 000 rpm i 5 min 3) Sug av all supernatant med pasteurpipett alternativt dekantera. 4) Resuspendera pelleten i totalt 250 l (125 l i varje epp.rör) Buffer 1. Lös upp cellerna helt och för samman de båda rören till ett. 5) Sätt till 250 l Buffer 2. 6) Blanda genom att vända röret ett par gånger, cell suspensionen ska klarna nästan omedelbart. 7) Tillsätt 350 l N3 buffer och blanda genast genom att vända röret några gånger. Det ska bildas vita moln i röret. 8) Centrifugera 13 000 rpm 10 minuter för att samla molnet på rörväggen. 9) Dekantera supernatanten ner i kolonnen. Inget vitt får följa med. (Det går också bra att använda en pipett med steril pipettspets för att föra över supernatanten.) Se till att kolonnen sitter i ett plaströr. 10) Centrifugera 13 000 rpm i 1 minut. 11) Tillsätt 750μl PE-buffer och centrifugera 13 000 rpm 1 min.
12) Häll bort bufferten från röret och centrifugera en gång till. 13) Flytta över kolonnen till ett rent (sterilt) eppendorfrör. 14) Tillsätt 50 l EB (elution buffer) och låt stå 1 minut. 15) Centrifugera 13 000 rpm 1 min. Glöm inte att använda skyddslocket på centrifugen, ifall locket på epp. röret flyger av! Plasmiden är nu eluerad och finns i epp.röret! Återvänd till restriktionsklyvningen! Renhet och kvalite på plasmiden anlyseras på agarosgel tillsammans med klyvningsprodukterna. Redovisning: Enkelt flödesschema som visar vad som händer i de olika stegen och var de olika komponenterna (celler, cellrester, kromosomalt DNA och plasmid) befinner sig. Appendix Restriktionsenzymer typ II Hind III (Haemophilus influenzae Rd, 3:e) Igenkänningssekvens (Palindromsekvens) samt klyvningsställe ( ) 5 A A G C T T 3 3 T T C G A A 5 (komplementära strängen) BamHI 5 G G A T C C 3 3 C C T A C C 5 (komplementära strängen) EcoRI 5 G A A T T C 3 3 C T T A A C 5 Samtliga enzym ger klyvning med "sticky ends" (single stranded overhang). Om klyvningen sker på samma ställe bildas blunt ends (utan single stranded overhang).