Quantification of Tripeptidyl-peptidase II

Uppsala Universitet Institutionen för Medicinsk Biokemi och Mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15hp, vt 2010 Quantification of Tripeptidyl-peptidase II Optimisation and evaluation of 3 assays Sabina Gyllenfjärd Handledare: Birgitta Tomkinson Institutionen för Medicinsk Biokemi och Mikrobiologi Uppsala Universitet 1

Abstract Tripeptidyl-peptidase II (TPPII), is present in most eukaryotic cells. It cuts tripeptides from the N- terminus of peptides and is especially important for degrading peptides longer than 15 amino acids. TPPII also tailors long peptides into suitable substrates for the enzymes which transport and produce the peptides that MHC I present. Increased levels of TPPII have also been found in certain cancer cells, thus it is of interest to determine if TPPII could be used as a tumour marker. The aim of this study was to optimise and evaluate 3 different methods for quantifying TPPII. Western blot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and fluorophore-linked immunosorbent assay (FLISA) protocols were optimised regarding incubation times and antibody dilutions. Sensitivity and linearity were the most important parameters when evaluating the results. The coefficient of determination of western blot was R 2 =0.98-1 within the range of 1.29-250ng TPPII/well and ELISA had a coefficient of determination of R 2 =0.96 within the range of 0.03-250ng TPPII/well. Presently western blot is the only one of these methods to yield reliable results with impure samples, but ELISA is superior regarding sensitivity and throughput. Thus further optimisation of ELISA is interesting to pursue. Keywords protein quantification, odyssey 2.1, tppii, assay, western blot 2

Introduktion I levande celler pågår en cykel av syntes och nedbrytning av proteiner där aminosyrorna ständigt återanvänds. TPPII (Tripeptidylpeptidas II) är ett enzym som avskiljer tripeptider från N-terminalen av peptidkedjor. Enzymet får troligen sina substrat från proteosomerna som klyver proteiner till peptider, som peptidaser sedan kan klyva i allt mindre segment tills fria aminosyror återstår. TPPII är speciellt viktigt för nedbrytning av peptidkedjor som har fler än 15 aminosyror eftersom dessa är för långa för att vara substrat för andra peptidaser. Enzymet har också en svag endopeptidasaktivitet, vilket innebär att det klyver vissa peptider längre in i aminosyrasekvensen. Det största substrat som TPPII rapporterats degradera är 41 aminosyror långt [1, 2]. Vid muskelförtvining orsakad av sepsis ses en ökad aktivitet och uttryck av TPPII i muskelcellerna vilket visar sambandet mellan halten TPPII och hastigheten vid degradering av proteiner [3]. TPPII är med sin molekylmassa på ca 6MDa det största kända proteaskomplexet i eukaryota celler [4]. Subenheterna som bygger upp komplexet är på 150kDa hos bananfluga och 138kDa hos människa. Bilder tagna med elektronmikroskopi av TPPII både från bananflugor samt humana röda blodkroppar visar omväxlande hantelformer och båtformer, vilket beror på att komplexen som bildas består av två tuber som vrider sig runt varandra [5, 6]. När enzymet bildar komplex ökar aktiviteten hos TPPII upp till 10 gånger. Aktiviteten ändras utan att mängden enzym i cellen ökas eller minskas och det är därför möjligt att aktiviteten hos TPPII regleras av hur mycket enzym som är fritt gentemot uppbundet i komplex [7]. Elektronmikroskopibilder av TPPII i olika grader av dissociation, tagna för att illustrera hur beroende aktiviteten var av denna komplexbildning, publicerades redan 1987 i Biochemical Journal [6]. En omdiskuterad egenskap hos TPPII är om enzymet är nödvändigt för att producera substrat för antigen som ska presenteras av MHC I. Proteasomerna är det proteas som till största delen klyver 3

proteiner intracellulärt, men substraten som bildas är för långa för att binda till MHC I och det är oftast endoplasmatiskt-retikulum-aminopeptidas I som färdigställer de peptider som kan bindas av MHC I. Det som diskussionen gäller är om TPPII behövs för att klyva peptidkedjorna innan de tas om hand av andra aminopeptidas. Kawahara et al. drog vid en studie på knock-out möss 2009 slutsatsen att så inte var fallet eftersom bara presentationen av substrat från ett fåtal, 14-17 aminosyror långa, peptider påverkades i deras försök. Vid jämförelser mellan knockout-möss med <10% uttryckt TPPII och vanliga möss som immuniserades var immunsvaret likvärdigt trots att något mindre mängd substrat för MHC I producerades av knockout-mössen [8]. TPPII påverkar även fettmetabolismen. McKay et al. visade 2007 hur TPPII-brist inducerad genom RNA-interferens ledde till minskade fettreserver hos Caenorhabditis elegans. Man har också sett hur fettinlagringen i däggdjursceller ökar med mängden TPPII, detta oavsett hur hög aktivitet enzymet har. En intressant upptäckt vid försök på möss är att mer fett lagras in hos individer där mycket TPPII uttrycks i cellerna än hos individer där lite TPPII uttrycks. Detta trots att födointaget är det samma [9]. En tidigare studie har visat att hormonet cholecystokinin 8, som styr mättnadskänslan, bryts ned av membranbundet TPPII [10]. Ökad aktivitet och uttryck av TPPII har uppmätts i vissa tumörceller, främst lymfom. Kännetecken för tumörceller är bland annat genetisk instabilitet, okontrollerat ökad cellproliferation samt skydd mot apoptos. Det senare dels genom nedreglering av MHC I, som gör att de undgår apoptosinducering från T-celler, dels genom överproduktion av antiapoptosproteiner [11]. Det verkar som om enzymet är viktigt både för cellproliferationen och för överlevnad hos maligna celler. Ökad halt TPPII har visat sig skydda tumörceller från apoptos och öka celldelningen [11, 12]. Vid en studie där man manipulerat mängden TPPII i tumörceller genom transfektion visade det sig att celler med högre halt TPPII delade sig fortare och 20-40% hade missformade kärnspolar eller för 4

många centrosomer. Det genomsnittliga antalet kromosomer var också högre än normalt. Gentemot tumörceller som transfekterats med tom vektor var variationen i antal kromosomer mer än 3 gånger högre [13]. Förmågan hos TPPII att skydda mot apoptos visas också av att brist på enzymet i normala celler leder till apoptos i flera celltyper inte bara på cellnivå utan även på organismnivå upptäcktes degenerativa effekter av TPPII-brist [4]. I samband med strålbehandling har man sett att inhibering av TPPII ger goda resultat vid låg stråldos vid försök på möss gick tumörerna helt tillbaka och ingen återväxt syntes efter avslutad behandling [14]. Resultaten från dessa studier gör det intressant att undersöka TPPII som tumörmarkör. För att kunna undersöka och jämföra olika egenskaper hos TPPII behöver man en metod som kan mäta enzymets koncentration. Ett sätt att göra detta på är att mäta halten av det mrna som kodar för TPPII, men korrelationen till koncentrationen TPPII i cellerna är osäker eftersom denna påverkas av faktorer som hastigheten av enzymets nedbrytning [15]. Aktiviteten hos enzymet är en faktor som kan mätas [16]. Eftersom komplexbildningen påverkar aktiviteten kan resultatet av denna aktivitetsassay dock inte användas för att bestämma hur mycket TPPII som finns i ett prov utan att man på förhand vet hur hög aktiviteten är per mängd enzym [6, 7]. Syftet med detta projekt var att se vilken metod som bäst kvantifierade mängden uttryckt TPPII. Metoderna, som modifierades genom att optimera antikroppsspädningar, buffertar och inkubationslängder just för detektion av TPPII, var western blot, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) och FLISA (fluorophore-linked immunosorbent assay). Western blot, eller immunoblot för proteiner, utvecklades i slutet av 1970-talet [17]. Metoden innebär att proteiner först separeras genom gelelektofores och sedan överförs till membran. Antikroppar tillsätts, vanligtvis först en primär antikropp riktad mot proteinet och sedan en sekundär antikropp riktad mot den primära antikroppen. Beroende på önskad detekteringsmetod kan den antikropp som tillsätts sist vara bunden till ett enzym eller en fluorofor. ELISA har använts sedan början av 1970-talet och mäter med hjälp av 5

spektrofotometri ett färgomslag. Om det är ett protein man detekterar får detta binda till en mikrotiterplatta varefter primära antikroppar mot proteinet tillsätts. Bundet till de sekundära antikropparna som därefter tillsätts, finns ett enzym som ger ett färgomslag hos det substrat som slutligen tillsätts. Enligt samma princip fungerar FLISA som kom i början på 2000-talet, skillnaden är att istället för ett enzym så är en fluorofor bunden till den sekundära antikroppen och man mäter sedan fluorescensen i en scanner [18]. Hög känslighet och god linearitet var de viktigaste faktorerna vid valet av den bästa metoden att använda. Om dessa faktorer var jämförbara blev tidsåtgång samt mängden material, reagenser och utrustning som krävdes utslagsgivande. Jämförande försök gjordes både inom varje metod och mellan metoderna. Material och metod Material: Till försöken användes TPPII av en koncentration på 0,50µg/mL som förvarats vid -80C <22 år. Enzymet var framrenat från utdaterade röda blodkroppar [19]. Även mätningar på lysat från E. coli-celler transfekterade med TPPII gjordes. Som tvättbuffertar och till spädningar användes, om annat inte nämns, TBS (Tris Buffered Saline, 20mM Tris, 1,37mM NaCl), TBST (TBS med 0,01% Tween-20), PBS (Phosphate Buffered Saline, 1,5mM KH 2 PO 4, 9,8mM Na 2 HPO 4, 1,37mM NaCl, 2,68mM KCl) och PBST (PBS med 0,01% Tween-20). Odyssey Blocking Buffer från Li-Cor Biosciences användes både till blockering av membran och mikrotiterplattor samt till antikroppsspädningar. Vid här ej visade försök konstaterades att funktionen hos Odyssey Blocking Buffer inte försämrades vid spädning 1:5 i PBS varför denna koncentration användes genomgående i de beskrivna försöken. Den primära antikroppen HαTPPII från Immunsystem var framtagen i höns. Som sekundära antikroppar användes HRPαChicken från Sigma, en antikropp riktad mot höns 6

IgG som är konjugerad med HRP (Horse Radish Peroxidase) och IRDye 800CW Donkey anti- Chicken IgG från Li-Cor Biosciences. En ny antikropp mot TPPII framtagen inom HPR (Human Proteome Research) HPA021069 kaninαtppii från Sigma testades också. Denna var framtagen i kanin och som sekundär antikropp användes då IRDye 680 Donkey anti-rabbit IgG från Li-Cor Biosciences. Western Blot: TPPII seriespäddes 1:2 i provbuffert (10% glycerol, 5% βmerkaptoetanol, 2,3% SDS, 0,0625M Tris-HCl ph 6,8) till 0,3-40ng/12µl. Det spädda proteinet värmdes sedan under 5min vid 95C. 8µl markör, Biorad #161-0318, samt 12µl av valda koncentrationer TPPII och 8µl av valda koncentrationer lysat sattes på 8% polyakrylamidgeler. Elektroforesen genomfördes vid 200V under 45min och proteinbanden överfördes sedan till PVDF-membran vid 100V under 60min. Membranen gjordes först mottagliga genom att doppas 30-60sek i metanol. Membran som skulle genomgå ECL (Enhanced chemiluminescence) inkuberades och tvättades med hjälp av vakuum i SNAPid (Millipore) enligt tillverkarens protokoll. Först sögs 0,2% torrmjölk i H 2 O genom membranen, därefter TBST. Inkubationen med HαTPPII (1:200 i TBS) som primär antikropp skedde över natt i rullande kärl vid +4C. Tvätt av membranen skedde sedan i SNAPid med TBST och de inkuberades 10min med HRPαChicken (1:3333 i TBS) som sekundär antikropp. Efter följande tvätt med TBST inkuberades membranen under 1min med framkallningsreagens 1 och 2 (Amersham Biosciences) blandade enligt tillverkarens instruktion. Membranen exponerades på fotografisk film i 30s, 1min och 5min respektive. Resultatet avgjorde önskvärd längd på den sista exponeringen, 15-60min. Membran som skulle avläsas i Li-Cors Odyssey inkuberades med spädd Odyssey Blocking Buffer under 1h i rumstemperatur. Därefter tvättades membranen, vilket varje gång skedde på skak i TBST 4x5min. De inkuberades sedan med den primära antikroppen HαTPPII (1:200 i spädd Odyssey Blocking Buffer med 0,1% Tween-20) i rullande kärl över natt vid +4C. Efter tvätt inkuberades 7

membranen med den ljuskänsliga antikroppen IRDye 800CW (1:5000 i spädd Odyssey Blocking Buffer) under 45min i rumstemperatur i ljustät låda. Efter en sista tvätt sköljdes membranen slutligen i TBS och scannades i Odyssey 2.1 på standardinställning, intensitet 5.0 för 700nm och 800nm. Kontrast och ljusstyrka optimerades innan mängden TPPII i banden kvantifierades i mjukvaran för Odyssey 2.1. ELISA: En spädningsserie av TPPII i 50mM natriumkarbonatbuffert, ph 9,6, sattes till brunnarna i en mikrotiterplatta. 100µL av varje prov sattes i duplikat. Som blank sattes 100µL av samma buffert som använts till spädningen. Plattan inkuberades vid +4C över natt och brunnarna tvättades med 2x200µL PBST innan de inkuberades med 200µL spädd Odyssey Blocking Buffer under 1h i rumstemperatur. Efter tvätt med 2x200µL PBST inkuberades brunnarna med 100µL HαTPPII (1:100 i spädd Odyssey Blocking Buffer) under 30min vid +37C. Därefter tvättades brunnarna med 4x200µL PBST innan inkubation med 100µL HRPαChicken (1:3333 i spädd Odyssey Blocking Buffer) under 30min vid +37C. Efter tvätt med 4x200µL PBST tillsattes 50µL TMB (3,3',5,5'- tetramethylbenzidine från Sigma) per brunn som substrat. Reaktionen stoppades efter 30min med hjälp av 50µL 1M fosforsyra och plattan lästes av vid 450nm i plattavläsare. FLISA: Mikrotiterplattan behandlades som vid ELISA ovan, men som sekundär antikropp användes IRDye 800CW (1:5000 i spädd Odyssey Blocking Buffer). Inkubation skedde i ljustät låda under 60min i rumstemperatur. Därefter tvättades brunnarna med 4x200µL PBST och 1x200µL PBS med hjälp av multipipett för att minimera risken av spill mellan brunnarna. Avläsning med avslutande kvantifiering skedde i Odyssey 2.1 med 3mm 'focus offset' vid 700nm och 800nm. 8

Resultat Western Blot: Med känsligheten hos ECL för detektion av TPPII som utgångsläge utvecklades en metod att detektera TPPII med IR-antikroppar och scanning i Odyssey 2.1. Målet var minst lika hög känslighet samt enklare hantering och kvantifiering. För att optimera metoden gjordes försök med bland annat olika koncentration antikroppar. I Fig 1 visas vilken kombination av koncentrationer för primära och sekundära antikroppar som gav bäst känslighet med lägst bakgrund. Proverna med lägst halt av TPPII sattes närmast membranets mitt. Hög koncentration av den primära antikroppen gav hög bakgrund utan att öka känsligheten, se Fig 1: A-B. När det gällde den sekundära antikroppen krävdes den högre koncentrationen för att optimera känsligheten, jämför Fig 1:C och D där provet med den svagaste koncentrationen TPPII bara är synlig i D. I fortsatta försök användes därför koncentrationen 1:200 för den primära och 1:5000 för den sekundära antikroppen. Ingen kvantifiering gjordes vid detta försök. Fig 1. Grundläggande försök med western blot för att se vilken kombination av antikroppskoncentrationer som gav bäst känslighet och lägst bakgrund. Jämför antalet synliga band på TPPII nivå med hur grön bakgrunden är. A: primär antikropp HαTPPII 1:100 och sekundär antikropp IRDye 800CW Donkey anti-chicken IgG 1:10000; B: primär antikropp 1:100 och sekundär antikropp 1:5000; C: primär antikropp 1:200 och sekundär antikropp 1:10000; D: primär antikropp 1:200 och sekundär antikropp 1:5000. Straxt under 138kDa som är nivån för banden av TPPII kan man svagt se markörens band för 100kDa. 9

För att fastställa om högre koncentration sekundär antikropp skulle öka känsligheten ytterligare gjordes ett kompletterande försök där den bästa kombinationen ur försöket ovan jämfördes med en dubblerad koncentration sekundär antikropp. Höjningen av bakgrunden och styrkan hos banden tog dock ut varandra och i fig 2 ser man att kvantifieringen i Odyssey 2.1 blev i det närmaste identisk. För att försöka sänka bakgrunden gjordes ett senare, här ej visat, försök där 0,1% SDS tillsattes till den sekundära antikroppen, men känsligheten gick då ner. Vad gäller bakgrunden framkom i ännu ett här ej visat försök att metoden att i SNAPid skynda på inkubationstider och blockning för membran som scannades i Odyssey 2.1 gjorde bakgrunden hög. 100 10 Integ. intensity 1 1 10 100 0,1 TPPII ng/brunn Fig 2. Lineariteten efter western blot och kvantifiering i Odyssey 2.1 av 2 membran inkuberade med primär antikropp 1:200. Koncentrationen av den sekundära antikroppen var 1:5000 för membran och trendlinjen hade bestämningskoefficient R 2 =0,98. Antikroppskoncentrationen var 1:2500 för membran och dess trendlinje hade bestämningskoefficient R 2 =0,99. 10

Den nya primära antikroppen HPA021069 kaninαtppii(sigma), jämfördes med HαTPPII som användes i övriga försök för att detektera TPPII. Fig 3 visar de scannade membranen från detta försök och lineariteten efter kvantifieringen i Odyssey 2.1. Båda antikropparna är lika känsliga men den nya antikroppen visade ingen korsreaktivitet. Som synes i fig 3 A saknas band i de brunnar L2 och L3 där lysat utan TPPII tillsattes. C 100 Integ. intensity 10 1 0,1 1 10 100 TPPII/brunn Fig 3. Jämförelse av två primära antikroppar vid western blot. Membran A inkuberades med primär antikropp HPA021069 1:200 och sekundär antikropp IRDye 680 Donkey anti-rabbit IgG 1:1000. Membran B inkuberades med primär antikropp HαTPPII 1:200 och sekundär antikropp IRDye 800CW Donkey anti-chicken IgG 1:5000. M: markör de tre starkast framträdande banden uppifrån är 150kDa, 100kDa respektive 75kDa L1: lysat med påvisad aktivitet av TPPII, L2 och L3: olika lysat utan uppmätt aktivitet; T2: 20ng TPPII/brunn, T4: 5ng TPPII/brunn, T6: 1,25ng TPPII/brunn. Trendlinjerna för A ( ) och B ( ) hade bestämningskoefficient R 2 =1 respektive R 2 =0,98. 11

Immunoassay: De första försöken med ELISA, enligt standardbetingelser, gav alltför låga absorbanser. Ett försök gjordes då där inkubationstiden för substratet, TMB, ökades. Reaktionen stoppades i 2 rader i taget på mikrotiterplattan med 5min mellanrum. Högst absorbans och bäst linearitet uppnåddes efter 25-30min. Inkubationstid längre än 30min gav, vilket kan ses i fig 4 B, försämrad linearitet. Alla serier visade god linearitet vid Abs 650 vid mätningarnas start då substratet fått verka i 20min. A B 1 1 Abs 450 0,1 Abs 450 0,1 0,01 1 10 100 1000 0,01 1 10 100 1000 TPPII/brunn TPPII ng/brunn Fig 4. Diagram över jämförelse av stopptid av substratets inkubation vid ELISA. A visar absorbansen hos mätserie och stoppade vid 25min samt mätserie och stoppade vid 30 min. B visar absorbansen hos mätserie och stoppade vid 35min samt mätserie och stoppade vid 40 min. Nämnvärt är att den lägsta punkten som visas i B inte hade lägst koncentration, utan näst lägst, i sin serie (serien var däremot linjär vid avläsning vid 650nm vid försökets början). 12

För att se om det gick att få högre känslighet med ELISA än med western blot sattes 0,03-125ng per brunn. Figur 5 visar trendlinjen för serien i duplikat. 1,00 Abs 450nm 0,10 0,01 0,00 0,01 0,1 1 10 100 1000 TPPII ng/brunn Fig 5. Lineariteten vid ELISA för medelvärdet av dubbelprov med koncentration 0,03-125ng/brunn, spädningsserie 1:4. Trendlinjen har bestämningskoefficient R 2 =0,96. FLISA jämfördes med ELISA för att se vilken av metoderna som var känsligast och gav bäst underlag för standardkurvor. Resultatet av det första testet ses i fig 6A-B nedan. Den lägsta mängden TPPII som användes var ~4ng/brunn. B 10 Integ. intensity 1 1 10 100 1000 0,1 TPPII ng/brunn Fig 6. Resultat av FLISA: A visar del av mikrotiterplatta scannad i Odyssey 2.1. Kolumn 2: Blank, därefter TPPII i spädningsserie 1:2 från 250ng/brunn. Bestämningskoefficienten av trendlinjen efter kvantifiering i Odyssey 2.1 som visas i B var R 2 =0,88. 13

Därefter jämfördes olika blockningsbuffertar och antikroppsspädningar. Figur 7 A visar hela mikrotiterplattan där man tydligt kan se dels effekten av val av buffert dels svårigheten att tvätta bort obunden IR-antikropp. Man ser också tydligt återskenet från brunnarnas väggar. I figur 7 B visas trendlinjen baserad på kolumn 7 och 8 där Odyssey Blocking Buffer och sekundär antikropp IRDye 800CW Donkey anti-chicken IgG 1:2500 använts. B 100000 Integ. intensity 10000 1 10 100 1000 TPPII ng/brunn Fig 7. Resultat av FLISA. A: Mikrotiterplatta scannad i Odyssey 2.1; A1-10: Blank, B-H: Spädningsserie av TPPII 1:2 från 250ng/brunn i rad H till ~4 i rad B. För kolumn 9-10 användes en spädningsserie som förvarats i -20C i 48h. Blockningsbuffert i kolumn 1-4 och 9 var POT (1% ovalbumin, 0.5% Tween-20 i PBS ph 7.4). Blockningsbuffert i kolumn 5-8 och 10 var spädd Odyssey Blocking Buffer. Primär antikropp var HαTPPII 1:100. Den sekundära antikroppen IRDye 800CW Donkey anti-chicken IgG var spädd 1:5000 i kolumn 1-2 och 5-6. I kolumn 3-4, 7-8 och 9-10 späddes den 1:2500. B: Trendlinje baserad på kolumn 7-8. Bestämningskoefficienten var R 2 =0,97. För att se hur prover innehållande fler proteiner än TPPII förhåller sig till standardkurvor baserade på rent TPPII gjordes ett försök både med ELISA och FLISA. Två spädningsserier av TPPII gjordes med samma koncentrationer, varav den ena med tillsats av 50µl lysat som saknade TPPII. Serierna sattes som duplikat på mikrotiterplattor för ELISA respektive FLISA. Båda metoderna visade en 14

tydlig skillnad i lutning på trendlinjerna (Fig 8), varför prover som inte är rena kommer att ge ett för högt resultat vid låga halter och ett för lågt resultat vid höga halter. A 1 B 100000 Abs 450 raw intensity 0,1 1 10 100 1000 TPPII ng/brunn 10000 1 10 100 1000 TPPII ng/brunn Fig 8. Hur standardkurvor av rent TPPII förhåller sig till prov med innehåll av andra proteiner. A visar trendlinjerna efter ELISA för en spädningsserie av rent TPPII i duplikat: med bestämningskoefficient R 2 =0,97 och med bestämningskoefficient R 2 =0,98, samt där 50µl lysat som saknade TPPII tillsatts: med bestämningskoefficient R 2 =0,91 och med bestämningskoefficient R 2 =0,84. B visar trendlinjerna efter FLISA för samma spädningsserier: med bestämningskoefficient R 2 =0,94 och med bestämningskoefficient R 2 =0,91 samt med bestämningskoefficient R 2 =0,38 och med bestämningskoefficient R 2 =0,86. 15

Diskussion Specifika proteiner kan kvantifieras med många olika metoder, alla med sina fördelar och nackdelar. Färgningarna i vissa metoder kan interagera på ett ofördelaktigt sätt med de buffertar som man använder eller också behöver man en metod som ger goda resultat för vissa provmängder eller koncentrationsintervall [20]. Vissa metoder, som till exempel Bradfordmetoden, mäter bara den totala mängden protein vilket gör metoden oanvändbar i ett prov som innehåller fler sorters protein än det man söker. Immunologiska metoder, där antikroppar binder specifikt till det aktuella proteinet, är då lämpligare att använda. Western blot och ELISA, som använts i detta projekt, fungerade båda väl för prover med rent TPPII. FLISA däremot behöver förbättras för att man ska kunna utnyttja det större antal prover som kan analyseras samtidigt i en mikrotiterplatta jämfört med genom western blot. Western blot var den enda metod som gav goda resultat för prover som förutom TPPII innehöll andra proteiner vilket även skulle vara fallet med prover från framtida försök för att undersöka TPPII som tumörmarkör. Western blot med IR-antikroppar och scanning i Odyssey 2.1, som var den första metoden som jämfördes med ECL, var redan före optimering lika känslig som ECL. Lineariteten var mycket god och här visade försök hade en bestämningskoefficient på R 2 =0,98-1 vid koncentrationer mellan ~1-20ng TPPII/brunn. Andra fördelar med western blot var att man efter scanningen genom bildbehandling kunde ändra intensitet och bakgrund samt kvantifiera proteinet direkt i dator, dessutom undveks hela mörkrumsarbetet som ingår i ECL och resultatet består över tid. Nackdelar med den nya metoden var att den tidsbesparande vakuumhanteringen av membran i SNAPid gav högre bakgrund och därför måste uteslutas samt att IR-antikropparna ska skyddas från ljus. För att se effekten av att utsätta antikropparna för ljus inkuberades ett membran som redan scannats i Odyssey 2.1 i fullt dagsljus i TBS under 90min och scannades sedan ännu en gång. Resultaten gick inte att skilja åt varför slutsatsen blev att trots att det är viktigt att skydda antikroppsbehållaren från 16

ljus i mesta möjliga mån kan man hantera membranen i laboratoriebelysning när de flyttas mellan olika tvättar utan att påverka resultatet negativt. Initialt gav ELISA, där HRP-konjugerade antikroppar fick reagera med TMB och sedan skapa färgomslag med 1M fosforsyra, alltför låga absorbanser. Gentemot rekommenderad inkubationstid för TMB på 10min krävdes en ökning upp till 25-30min innan utslaget blev tillfredställande för TPPII med de testade antikropparna. Den lägsta koncentration TPPII som testades var 0,03ng/brunn, bestämningskoefficienten blev då R 2 =0,96. Bara ett försök med prov i duplikat gjordes med dessa låga koncentrationer. Det vore intressant att se resultatet av ett utvidgat försök. Även med ELISA testades IR-antikroppar och scanning i Odyssey 2.1, så kallad FLISA. Det första försöket som bara omfattade 8 brunnar var mycket lovande och resultatet efter kvantifiering blev en bestämningskoefficient på R 2 =0,96. Den lägsta koncentrationen TPPII var då ~4ng/brunn. Vidare större försök visade dock på svårigheten att tvätta bort överskottet av obunden IR-antikropp samt risken att stöta i någon av brunnarna med multipipettens spetsar vilket kunde resultera både i fläckvis mer eller mindre bunden IR-antikropp. Tidsåtgången för att använda vanlig pipett för en hel mikrotiterplatta är dock alltför stor. Det vore intressant att se hur resultatet skulle bli i en automatisk plattvätt. Ett annat outforskat alternativ är att använda svarta mikrotiterplattor där bara bottnarna är genomskinliga. Enligt Li-Cors rekommendationer kan detta i stor utsträckning eliminera återskenet från brunnarnas väggar. Detta återsken ger annars en bakgrund som kan störa kvantifieringen. Både ELISA och western blot utförs över två dagar. Western blot har dock flera timmar längre tidsåtgång under den första dagen. I jämförelse med ELISA behövs mindre mängd prov när man utför en western blot, däremot är åtgången på övrigt material som buffertar och antikroppar mycket högre vid western blot. Per brunn används ungefär 10 gånger mer prov vid ELISA än vid western blot. Tittar man däremot på mängden tvättbuffert som går åt till en hel 96-hålsplatta är det knappt 20mL/tvätt för ett membran med 10 brunnar vid western blot kan det beroende på tvättkärl gå åt 17

50-200mL/tvätt. När det gäller antikroppar går det åt knappt 10mL antikroppslösning för 96 brunnar vid ELISA och 5mL för 10 brunnar vid western blot. En fördel med western blot gentemot ELISA är att man inte bara kvantifierar proteinet utan också ser vilken storlek det har. Genom att jämföra proteinbandets läge på membranet med storleksmarkören kan man vara säker på att det är rätt protein som mäts. Det låga antal prover som kan sättas på varje gel är den största nackdelen med western blot och en av anledningarna till att fortsätta utveckla främst ELISA. Nya antikroppar med mindre risk för korsreaktioner skulle kunna ge resultat där okända prover kan kvantifieras mot en standardkurva oavsett vilka proteiner som proverna innehåller utöver TPPII. Om inte de nya antikropparna ger tillräckligt bra resultat i en traditionell ELISA så är det möjligt att de kan användas för att utveckla en sandwich-elisa. Tyvärr har detta inte varit möjligt med de antikroppar som idag används. Vid en sandwich-elisa får först en antikropp specifik för antigenet binda till mikrotiterplattan, sedan antigenet och slutligen ännu en antikropp som är specifik för en annan del av antigenet. Den sista antikroppen kan konjugeras med exempelvis HRP eller biotin för att ge ett färgomslag när streptravidin med alkaliskt fosfatas tillsätts. En sandwich-elisa av detta slag framtagen för keratansulfat visade sig tillräckligt känslig för att kunna kvantifiera halter på 10ng/mL i serum och synovialvätska [21]. Om en sandwich- ELISA optimerad för TPPII skulle ha samma känslighet som den för keratansulfat motsvarar detta den känslighet som i denna studie uppnåddes för western blot. Eftersom känsligheten vid ELISA för TPPII gjorde det möjligt att detektera halter ner till 0,3ng/mL för rent TPPII drar jag slutsatsen att det med en välutvecklad sandwich-elisa skulle gå att få högre känslighet och snabbare hantering av en större mängd prover än med western blot. Hög känslighet och god linearitet var de viktigaste parametrarna för detta projekt. En ny metod som presenterades i maj 2010 som kallas digital-elisa visade mycket goda resultat för båda dessa parametrar [22]. Vid metoden mäts varje molekyl av proteinet för sig. Proteinet binds till kulor som inte har plats för mer än en molekyl och utfallet blir därför antingen positivt eller negativt därav 18

namnet digital-elisa. Den tumörmarkör som undersöktes var PSA och vid kvantifiering var bestämningskoefficienten R 2 =0,997 vid halter på 14fg/L. Om framtida försök visar att TPPII är en tumörmarkör som är signifikant redan vid låga halter så kanske detta kan vara en metod som blir aktuell på lång sikt. Referenser 1. Tripeptidyl-peptidase II: a multi-purpose peptidase, Tomkinson B, Lindås AC. Int J Biochem Cell Biol. 2005 Oct;37(10):1933-7. 2. A major role for TPPII in trimming proteasomal degradation products for MHC class I antigen presentation, Reits E, Neijssen J, Herberts C, Benckhuijsen W, Janssen L, Drijfhout JW, Neefjes J. Immunity. 2004 Apr;20(4):495-506. 3. Tripeptidyl-peptidase II expression and activity are increased in skeletal muscle during sepsis, Wray CJ, Tomkinson B, Robb BW, Hasselgren PO, Biochem Biophys Res Commun. 2002 Aug 9;296(1):41-7. 4. Activation of cellular death programs associated with immunosenescence-like phenotype in TPPII knockout mice, Huai J, Firat E, Nil A, Million D, Gaedicke S, Kanzler B, Freudenberg M, van Endert P, Kohler G, Pahl HL, Aichele P, Eichmann K, Niedermann G, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Apr 1;105(13):5177-82. 5. A giant protease with a twist: the TPP II complex from Drosophila studied by electron microscopy, Rockel B, Peters J, Kühlmorgen B, Glaeser RM, Baumeister W, EMBO J. 2002 Nov 15;21(22):5979-84. 6. Supramolecular structure of tripeptidyl peptidase II from human erythrocytes as studied by electron microscopy, and its correlation to enzyme activity, Macpherson E, Tomkinson B, Bålöw RM, Höglund S, Zetterqvist O, Biochem J. 1987 Nov 15;248(1):259-63. 7. Association and dissociation of the tripeptidyl-peptidase II complex as a way of regulating the enzyme activity, Tomkinson B, Arch Biochem Biophys. 2000 Apr 15;376(2):275-80. 8. Analysis of the role of tripeptidyl peptidase II in MHC class I antigen presentation in vivo.kawahara M, York IA, Hearn A, Farfan D, Rock KL, J Immunol. 2009 Nov 15;183(10):6069-77. 19

9. Tripeptidyl peptidase II promotes fat formation in a conserved fashion, McKay RM, McKay JP, Suh JM, Avery L, Graff JM, EMBO Rep. 2007 Dec;8(12):1183-9. 10. Characterization and inhibition of a cholecystokinin-inactivating serine peptidase, Rose C, Vargas F, Facchinetti P, Bourgeat P, Bambal RB, Bishop PB, Chan SM, Moore AN, Ganellin CR, Schwartz JC, Nature. 1996 Apr 4;380(6573):403-9. 11. TPPII promotes genetic instability by allowing the escape from apoptosis of cells with activated mitotic checkpoints, Stavropoulou V, Vasquez V, Cereser B, Freda E, Masucci MG, Biochem Biophys Res Commun. 2006 Jul 28;346(2):415-25. 12. Tumors acquire inhibitor of apoptosis protein (IAP)-mediated apoptosis resistance through altered specificity of cytosolic proteolysis, Hong X, Lei L, Glas R, J Exp Med. 2003 Jun 16;197(12):1731-43. 13. Mitotic infidelity and centrosome duplication errors in cells overexpressing tripeptidylpeptidase II, Stavropoulou V, Xie J, Henriksson M, Tomkinson B, Imreh S, Masucci MG, Cancer Res. 2005 Feb 15;65(4):1361-8. 14. Tripeptidyl-peptidase II controls DNA damage responses and in vivo gamma-irradiation resistance of tumors, Hong X, Lei L, Künert B, Naredla R, Applequist SE, Grandien A, Glas R. Cancer Res. 2007 Aug 1;67(15):7165-74. 15. Overlapping regional distribution of CCK and TPPII mrnas in Cynomolgus monkey brain and correlated levels in human cerebral cortex (BA 10), Radu D, Tomkinson B, Zachrisson O, Weber G, de Belleroche J, Hirsch S, Lindefors N, Brain Res. 2006 Aug 9;1104(1):175-82. 16. Association and dissociation of the tripeptidyl-peptidase II complex as a way of regulating the enzyme activity, Tomkinson B. Arch Biochem Biophys. 2000 Apr 15;376(2):275-80. 17. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure, Renart J, Reiser J, Stark GR, Proc Natl Acad Sci U S A. 1979 Jul;76(7):3116-20. 18. Fluorochrome-linked immunoassay for functional analysis of the mannose binding lectin complement pathway to the level of C3 cleavage, Walsh MC, Shaffer LA, Guikema BJ, Body SC, Shernan SK, Fox AA, Collard CD, Fung M, Taylor RP, Stahl GL, J Immunol Methods. 2007 Jun 30;323(2):147-59. 19. Purification, substrate specificity, and classification of tripeptidyl peptidase II, Bålöw RM, Tomkinson B, Ragnarsson U, Zetterqvist O, J Biol Chem. 1986 Feb 15;261(5):2409-17. 20. Quantitation of protein, Noble JE, Bailey MJ, Methods Enzymol. 2009;463:73-95. 20

21. A new sandwich-elisa method for the determination of keratan sulphate peptides in biological fluids employing a monoclonal antibody and labelled avidin biotin technique, Kongtawelert P, Ghosh P, Clin Chim Acta. 1990 Dec 31;195(1-2):17-26. 22. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations, Rissin DM, Kan CW, Campbell TG, Howes SC, Fournier DR, Song L, Piech T, Patel PP, Chang L, Rivnak AJ, Ferrell EP, Randall JD, Provuncher GK, Walt DR, Duffy DC, Nat Biotechnol. 2010 May 23. (ej i tryck ännu) 21