PD-L1-uttryck detekterat med PD-L1 IHC 28-8 pharmdx i icke-skvamöst NSCLC kan förknippas med ökad överlevnad från OPDIVO (nivolumab).

PD-L1 IHC 28-8 pharmdx SK005 50 tester för användning med Autostainer Link 48 Avsedd användning För in vitro-diagnostik. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx är en kvalitativ immunhistokemisk analys som använder Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 avsedd för upptäckt av PD-L1-protein i formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE), icke-skvamösa och icke-småcelliga lungcancervävnader (NSCLC) samt melanomvävnad med hjälp av EnVision FLEX visualiseringssystem på Autostainer Link 48. PD-L1-proteinuttryck definieras som andelen tumörceller som uppvisar positiv membranfärgning med olika intensitet. PD-L1-uttryck detekterat med PD-L1 IHC 28-8 pharmdx i icke-skvamöst NSCLC kan förknippas med ökad överlevnad från OPDIVO (nivolumab). Uttrycket av PD-L1 mätt med PD-L1 IHC 28-8 pharmdx i melanom kan användas som hjälpmedel vid bedömning av patienter som man överväger att ge en kombinationsbehandling med OPDIVO (nivolumab) och YERVOY (ipilimumab). Sammanfattning och förklaring Bindning av PD-1-liganderna PD-L1 och PD-L2 till receptor PD-1 på T-celler inhiberar proliferation av T-celler och cytokinproduktion. Uppreglering av PD-1-ligander förekommer i vissa tumörer och signaleringen genom den här reaktionsvägen kan bidra till att inhibera aktiva T-cellers immunövervakning av tumörer (1). OPDIVO (nivolumab) är en monoklonal antikropp mot humanimmunoglobulin G4 (IgG4) som binder till PD-1-receptorn och blockerar interaktionen med PD-L1 och PD-L2 och frigör banmedierad PD-1-inhibering av immunsvaret, inklusive immunsvar mot tumörer (2). I syngena mustumörmodeller resulterade blockering av PD-1-aktivitet i minskad tumörtillväxt (3). Kliniska fördelar med OPDIVO och klinisk nytta av PD-L1 IHC 28-8 pharmdx har undersökts i NSCLC och melanom. Icke-skvamöst NSCLC: Detektion av PD-L1-uttryckande tumörceller i ett patientprov med icke-skvamös, icke-småcellig lungcancer kan indikera en ökad överlevnad vid behandling av patienten med OPDIVO (nivolumab). Prover från kliniska studier av OPDIVO sponsrade av Bristol- Myers Squibb testades med hjälp av PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. I den kliniska studien CA209057 undersöktes den kliniska validiteten hos PD-L1 IHC 28-8 pharmdx för bedömning av PDL1-status hos patienter med icke-skvamös NSCLC som behandlas med OPDIVO (5,11). Melanom: Cytotoxiskt T-lymfocytassocierad antigen-4 (CTLA-4) är en negativ regulator av T-cellsaktivitet. YERVOY (ipilimumab) är en monoklonal antikropp som binder till CTLA-4 och blockerar interaktionen mellan CTLA-4 och dess ligander, CD80/CD86. Blockering av CTLA-4 har visats stärka T-cellsaktivering och proliferation, vilket bidrar till en generell ökning i antitumörimmunrespons (4). PD-1 och CTLA-4 inhiberar antitumörimmuniteten genom komplementära och icke-redundanta mekanismer. OPDIVO -monoterapi och en kombination av OPDIVO och YERVOY har visat sig signifikant förbättra den progressionsfria överlevnaden jämfört med enbart YERVOY hos patienter med framskridet melanom som inte tidigare behandlats (8-10). Melanomtumörprover från patienter som behandlats med OPDIVO i kliniska studier sponsrade av Bristol-Myers Squibb testades med hjälp av PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. I den kliniska studien CA209067 undersöktes den kliniska validiteten hos PD-L1 IHC 28-8 pharmdx för bedömning av PDL1-uttrycket i melanompatienter som behandlats med OPDIVO, OPDIVO i kombination med YERVOY samt YERVOY ensamt. OPDIVO och YERVOY är varumärken som tillhör Bristol-Myers Squibb. Procedurprincip PD-L1 IHC 28-8 pharmdx innehåller optimerad reagens och protokoll som krävs för att slutföra en IHC-färgningsprocedur av FFPEvävnadsprover med Autostainer Link 48 och PT Link förbehandlingsmodul (6). Efter inkubering med den primära monoklonala antikroppen till PD-L1 eller NCR (Negative Control Reagent) inkuberas vävnadsprov med en länkantikropp till värdarten för den primära antikroppen och inkuberas därefter med en färdig visualiseringsreagens som består av sekundära antikroppsmolekyler och pepparrotsperoxidasmolekyler sammankopplade med en stomme av dextranpolymer. Enzymkonverteringen av den tillagda kromogenen resulterar i en fällning bestående av en synlig reaktionsprodukt vid antigenen. Färgen på den kromogena reaktionen modifieras av en kromogen förbättringsreagens. Vävnadsprovet kan därefter kontrastfärgas och förses med täckglas. Resultat tolkas med hjälp av ett ljusmikroskop. Kontrollobjektglas innehållande två formalinfixerade, paraffininbäddade humana cellinjer tillhandahålls för validering av färgningskörningarna. Medföljande material PD-L1 IHC 28-8 pharmdx (kod SK005) Materialet nedan räcker för 50 tester (50 objektglas inkuberade med Primary Antibody till PD-L1 och 50 objektglas inkuberade med motsvarande Negative Control Reagent, sammanlagt 100 testobjektglas). I satsen ingår ytterligare Primary Antibody för PD-L1 för infärgning av 15 kontrollcellinjer på objektglas. Antal tester baseras på användningen av 2 x 150 µl per objektglas för varje reagens förutom DAB+ och Target Retrieval Solution. (129105-002) P03914SE_02/SK00521-2/2016.04 s. 1/17

Satsen innehåller material för högst 15 individuella färgningskörningar. Kvantitet Beskrivning 1 x 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Buffrad lösning innehållande väteperoxid, rengöringsmedel och 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 19,5 ml Primary Antibody: Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 MONOCLONAL RABBIT ANTI-PD-L1 CLONE 28-8 Monoklonal kanin-anti-pd-l1 i en buffrad lösning innehållande stabiliseringsprotein och 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 15 ml Negative Control Reagent* NEGATIVE CONTROL REAGENT Kontroll-IgG-antikropp från monoklonal kanin i en buffrad lösning innehållande stabiliseringsprotein och 0,015 mol/l natriumazid. * Kontroll-IgG från monoklonal kanin säljs på licens från Cell Signaling Technology. 1 x 34,5 ml LINKER, Anti-Rabbit LINKER, ANTI-RABBIT Sekundär kaninantikropp mot kaninimmunglobuliner i en buffrad lösning innehållande stabiliseringsprotein och 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextran bundet med peroxidasmolekyler och sekundär getantikroppsmolekyler mot kanin- och musimmunglobuliner i en buffrad lösning innehållande stabiliseringsprotein och ett antimikrobiellt medel. 15 x 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Buffrad lösning innehållande väteperoxid och ett antimikrobiellt medel. 1 x 5 ml DAB+ Chromogen DAB+ CHROMOGEN 3,3 -diaminobenzidin tetrahydroklorid i en organisk lösning. 1 x 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Kopparsulfat i vatten. 6 x 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Buffrad lösning, ph 6,1, innehållande rengöringsmedel och ett antimikrobiellt medel. 15 objektglas PD-L1 IHC 28-8 pharmdx-kontrollobjektglas KONTROLLOBJEKTGLAS Varje objektglas innehåller snitt av två pelleterade och paraffininbäddade cellinjer fixerade i formalin: NCI-H226** med positivt PD-L1-proteinuttryck och MCF-7 med negativt PD-L1-proteinuttryck. PD-L1, SK005 pharmdx XXXXX MCF-7: PD-L1-negativt NCI-H226: PD-L1-positivt ** Dr. AF Gazdar och Dr. JD Minna vid NIH uppmärksammas för deras bidrag till utvecklingen av NCI-H226 (ATCC-nummer: CRL-5826 ) (7). (129105-002) P03914SE_02/SK00521-2/2016.04 s. 2/17

Obs! All inkluderad reagens är specifikt formulerade för användning av den här satsen. För att testet ska fungera enligt specifikationen kan inga utbyten göras, förutom EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, (50x) (kod K8005). PD-L1 IHC 28-8 pharmdx har tagits fram särskilt för användning med Autostainer Link 48. Se användarhandböckerna för Autostainer Link 48 och PT Link för mer information. Material som behövs men inte ingår PT Link förbehandlingsmodul (kod PT100/PT101) Autostainer Link 48 (kod AS480) EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (kod K8007) EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (kod K8008) Destillerat eller avjoniserat vatten (vatten av reagenskvalitet) Timer Positiva och negativa vävnader för processkontroll (se avsnittet Kvalitetskontroll och tabell 1) Mikroskopobjektglas: Dako FLEX IHC objektglas för mikroskop (kod K8020) eller Fisherbrand Superfrost Plus laddade objektglas. Täckglas Permanent monteringsmedium och hjälpreagens krävs för monteringstäckglas Ljusmikroskop (4x 40x objektivförstoring) Försiktighetsåtgärder 1. För in vitro-diagnostik. 2. För yrkesmässigt bruk. 3. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN3), en kemikalie som är mycket giftig i ren form. I produktkoncentrationer kan NaN3, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten när det kastas bort så att inte metallazider ackumuleras i avloppet (12). 4. Primary Antibody, Negative Control Reagent, Linker och Visualization Reagent innehåller material med animaliskt ursprung. 5. Vävnadsprover och alla substanser utsatta för dem, både före och efter fixering, ska hanteras som om de kan överföra infektion och kasseras med rätt försiktighetsåtgärder (13). 6. Inkuberingstider, temperaturer eller metoder förutom de särskilt föreskrivna, kan ge felaktiga resultat. 7. Reagens har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan leda till sämre antigenfärgning. 8. Visualization Reagent, Liquid DAB+ kromogen och förberedd DAB+ Substrate-Chromogen Solution kan påverkas negativt om de utsätts för starkt ljus. Förvara inte systemkomponenter och utför inte färgning i starkt ljus, som direkt solljus. 9. Paraffinrester kan leda till falska negativa resultat. 10. Användning av reagensvolymer andra än rekommenderade kan resultera i utebliven synlig PD-L1-immunreaktivitet. 11. Stora snitt ( 2/3 av objektglaset) av vävnadsprov kan behöva 3 x 150 µl av reagens. 12. Som huvudregel får personer under 18 år inte arbeta med denna produkt. Användare måste vara ordentligt utbildade i lämpliga arbetsprocedurer, produktens farliga egenskaper samt nödvändiga säkerhetsinstruktioner. Ytterligare information finns i säkerhetsdatabladet (SDS). 13. Använd lämplig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögon och hud. 14. Oanvänd lösning måste kasseras enligt lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 15. Datablad för materialsäkerhet för yrkesanvändare kan erhållas på begäran. Fara DAB+ Chromogen: 1 5 % bifenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetraklorid H350 Kan orsaka cancer. H341 Misstänks kunna orsaka genetiska defekter. P201 Inhämta särskilda instruktioner före användning. P202 Använd inte produkten innan du har läst och förstått säkerhetsanvisningarna. P280 Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. P308 + P313 Vid exponering eller misstanke om exponering: Sök läkarhjälp. P405 Förvaras inlåst. P501 Kassera innehåll/behållare i enlighet med alla lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. Varning EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1 5 % citronsyra H319 Orsakar allvarlig ögonirritation. H411 Giftigt för vattenlevande organismer med långtidseffekter. P280 Använd ögon- eller ansiktsskydd. P273 Undvik utsläpp till miljön. P264 Tvätta händerna grundligt efter användning. P305 + P351 + P338 VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj noggrant med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. P337 + P313 Vid bestående ögonirritation: Sök läkarhjälp. P501 Kassera innehåll/behållare i enlighet med alla lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. (129105-002) P03914SE_02/SK00521-2/2016.04 s. 3/17

Förvaring Förvara alla komponenter av PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, inklusive kontrollobjektglas, i originalbehållaren mörkt vid 2 8 C när de inte används i med Autostainer Link 48. Använd inte satsen efter utgångsdatumet på utsidan av satsens förpackning. Användaren måste validera alla förvaringsförhållanden som avviker från de som specificerats i det här bipacksedeln. Det finns inga tydliga sätt att upptäcka instabilitet hos den här produkten. Därför bör positiva och negativa kontroller köras samtidigt med vävnadsprover från patient. Provberedning Prov måste förberedas så att vävnaden bevaras för IHC-färgning. Standardmetoder för vävnadsbehandling ska användas för alla prover. Paraffininbäddade snitt Paraffininbäddade vävnader fixerade i formalin lämpar sig för användning. Rekommenderade hanterings- och bearbetningsförhållanden: < 30 minuters ischemi innan vävnaden sänks ner i fixeringsmedel samt 24 48 timmars fixeringstid i 10 % neutralbuffrat formalin. Alternativa fixeringsmedel har inte validerats och kan ge upphov till felaktiga resultat. Prover bör blockeras till en tjocklek på 3 eller 4 mm, fixeras i 10 % neutralbuffrat formalin och torkas och klargöras i en serie av alkoholer och xylen, följt av infiltrering med smält paraffin. Paraffinets temperatur bör inte överskrida 60 C. Vävnadsprover ska snittas i 4-5 µm. Efter sektion ska vävnadsprover monteras på Fisherbrand Superfrost Plus laddade objektglas eller Dako FLEX IHC-mikroskopobjektglas (kod K8020) och sedan placeras i ugn vid 58 ± 2 C i 1 timme. För at t bevara antigenicitet ska vävnadssnitt som monterats på objektglas förvaras mörkt vid 2 8 C eller i rumstemperatur upp till 25 C och färgas inom 4 månader efter sektion. Förhållandena för förvaring och hantering av objektglas bör inte överskrida 25 C efter monte ring för att säkerställa vävnadens integritet och antigenicitet. Användning av PD-L1 IHC 28-8 pharmdx på avkalkade vävnader har inte validerats och rekommenderas inte. Reagensberedning Följande reagens måste beredas innan färgning: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) Förbered en tillräcklig mängd 1x Target Retrieval Solution, Low ph genom att späda Target Retrieval Solution, Low ph, 50x 1:50 med vatten av reagenskvalitet. ph-värdet för 1x Target Retrieval Solution bör vara 6,1 ± 0,2. En 30 ml-flaska med Target Retrieval Solution, Low ph, 50x utspädd 1:50 ger 1,5 L av 1x reagens, tillräckligt för att fylla en PT Link-tank som kan behandla upp till 24 objektglas per gång. Kassera 1x Target Retrieval Solution efter tre användningar och inte senare än 5 dagar efter spädning. Ytterligare EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) finns tillgängligt under kod K8005. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Förbered en tillräcklig mängd tvättbuffert genom att späda Wash Buffer 20x 1:20 med vatten av reagenskvalitet för tvättstegen. Förvara inte oanvänd 1x-lösning vid 2 8 ºC längre än en månad. Kassera bufferten om den är grumlig. Se användarhandboken för Autostainer Link 48 för mer information. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) finns tillgängligt som kod K8007. DAB+ Substrate-Chromogen Solution Lösningen ska blandas ordentligt före användning. Eventuell fällning som utvecklas i lösningen påverkar inte färgningens kvalitet. För att förbereda DAB+ Substrate-Chromogen Solution, lägg till 1 droppe Liquid DAB+ Chromogen per ml av DAB+ Substrate Buffer och blanda. Förberedd Substrate-Chromogen är stabil i 5 dagar om den förvaras mörkt vid 2 8 C. Viktigt: Vid användning av en hel flaska DAB+ Substrate Buffer tillsätts 9 droppar DAB+ Chromogen. Trots att det står 7,2 ml på etiketten är det den användbara volymen och tar inte hänsyn till den döda volymen i flaskan. Färgen på Liquid DAB+ Chromogen kan variera mellan klar till brunlila. Detta kommer inte påverka produktens effekt. Späd enligt instruktionerna ovan. Om för stor mängd Liquid DAB+ Chromogen läggs till DAB+ Substrate Buffer kommer det att resultera i försämrad positiv signal. Färgningsprocedur på Autostainer Link 48 Procedurnoteringar Före användning ska användaren läsa dessa instruktioner noggrant och vara förtrogen med alla komponenter och all instrumentering (se försiktighetsåtgärder). All reagens ska anta rumstemperatur (20 25 C) före immunfärgning. På samma sätt ska alla inkuberingssteg utföras vid rumstemperatur. Låt inte vävnadssnitt torka under färgningsproceduren. Torkade vävnadssnitt kan uppvisa icke-specifik färgning. Alla nödvändiga steg och inkuberingstider är förprogrammerade i programvaran Dako Link. Se användarhandböckerna för Autostainer Link 48 och PT Link för mer information om programmeringsprotokoll och laddning av objektglas och reagens. (129105-002) P03914SE_02/SK00521-2/2016.04 s. 4/17

Obs! Reagens och instruktionerna i det här systemet har utformats för optimalt resultat vid användning av rekommenderade reagens och material. Ytterligare spädning av reagens eller ändring av inkuberingstider eller temperaturer kan ge felaktiga eller motstridiga resultat. Färgningsprotokoll Välj färgningsprotokollet PD-L1 IHC 28-8 pharmdx från alternativen på menyn i DakoLink. Alla nödvändiga steg och inkuberingstider är förprogrammerade i DakoLink. Om lämpliga PD-L1 IHC 28-8 pharmdx-protokoll inte finns på servern kontaktar du den lokala tekniska kundtjänsten. Steg 1: Avparaffinering, rehydrering och procedur för målåtervinning (3-i-1) Rekommenderad procedur: Ytterligare information finns i användarhandboken för PT Link. Ställ in PT Links (kod PT100/PT101) förvärmning och nedkylning till 65 C. Ställ in värmen till 97 C i 20 minuter. Fyll PT Link-tankarna med 1,5 L med Target Retrieval Solution, Low ph, 1x arbetslösning för att täcka vävnadssnitten. Förvärm Target Retrieval Solution till 65 C. Sänk ned Autostainer-ställ med monterade FFPE-vävnadssnitt i förvärmd Target Retrieval Solution, Low ph (1x arbetslösning) i PT Link-tanken. Inkubera i 20 minuter vid 97 C. När målåtervinningsinkuberingen har slutförts och temperaturen sänkts till 65 C, ta bort Autostainer- ställen med objektglasen från PT Link-tanken och placera omedelbart Autostainer-ställen med objektglas i en tank (t.ex. PT Link Rinse Station, kod PT109) innehållande spädd, rumstempererad tvättbuffert (kod K8007). Lämna de inkuberade objektglasen i spädd, rumstempererad tvättbuffert i 5 minuter. Steg 2: Färgningsprocedur Efter avparaffinering, rehydrering och procedur för målåtervinning (3-i-1) placeras Autostainer-ställen med objektglas på Autostainer Link 48. Se till att objektglasen hålls fuktiga med buffert vid laddning och före initiering av körning. Instrumentet kommer att utföra färgningsprocessen genom att applicera nödvändiga reagens, övervaka inkuberingstiden och skölja objektglasen mellan reagens. Reagenstiderna är förprogrammerade i programvaran Dako Link. Steg 3: Kontrastfärg Objektglasen ska kontrastfärgas i 7 minuter med EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (kod K8008). Inkuberingstiden med hematoxylin är förprogrammerad i protokollet. Steg 4: Montering Icke-vattenhaltigt, permanent monteringsmedium krävs. Obs! Blekning av färgade objektglas kan förekomma över tid beroende på flera faktorer, inklusive, men inte begränsat till, kontrastfärgning, monteringsmaterial och metoder, samt förvaringsförhållandena för objektglasen. Förvara objektglasen i mörkt i rumstemperatur för att minimera blekning (20 25 C). Kvalitetskontroll Reagens i PD-L1 IHC 28-8 pharmdx har kvalitetskontrollerats genom immunhistokemi med den målåtervinning och de färgningsprocedurer som anges ovan. Avvikelser från de rekommenderade procedurerna för vävnadsfixering, bearbetning och inbäddning i användarens laboratorium kan ge upphov till signifikanta avvikelser i resultatet. Kvalitetskontroller ska ingå i varje färgningskörning. Kvalitetskontrollerna specificeras i tabell 1 och innefattar: ett H&E-färgat patientvävnadsprov, positiva och negativa kontrollvävnader från laboratoriet och kontrollobjektglas från Dako (15). För USA: se riktlinjerna för kvalitetskontroll från CAP:s (College of American Pathologist) certifieringsprogram för immunhistokemi. Se även riktlinjerna för CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry (14) för ytterligare information. Analysverifiering Före initial användning av ett färgningssystem i en diagnostisk procedur bör användaren verifiera analysens funktion genom att testa den på en serie av vävnader från laboratorium med kända IHC-egenskaper som motsvarar kända positiva och negativa vävnader. Se kvalitetskontrollprocedurerna som tidigare angetts i det här avsnittet av produktbladet. Kvalitetskontrollprocedurerna bör upprepas för varje ny sats och vid ändring av analysparametrarna. Felsökningsalternativ för eventuella problem, deras orsaker och föreslagna korrigeringsåtgärder beskrivs i tabell 12. Tolkning av infärgning icke-skvamös NSCLC och melanom Utvärdering av objektglas bör utföras av en patolog med hjälp av ett ljusmikroskop. Vid utvärdering av den immunhistokemiska färgningen av PD-L1 samt poängsättning kan 4x objektivförstoring användas för en inledande bedömning av hela provet, följt av 10-20x objektivförstoring för poängsättning (40x kan användas för verifiering, om det behövs). PD-L1-färgning indikeras med en brun (3,3 -diaminobenzidin, DAB) reaktionsprodukt. Positiv PD-L1-färgning definieras som komplett omgivande och/eller partiell linjär plasmamembranfärgning av tumörceller med olika intensitet. Hela provet måste utvärderas. Alla livsdugliga tumörceller på hela det PD-L1-färgade patientobjektglaset måste utvärderas och inkluderas i poängutvärderingen för PD-L1. Det bör finnas minst 100 livsdugliga tumörceller på det PD-L1-färgade patientobjektglaset för att bestämma andelen färgade celler. Cytoplasmisk färgning, om sådan förekommer, räknas inte i poängsättningssyfte. Icke-maligna celler och immunceller (t.ex. infiltrerande lymfocyter eller makrofager) kan också färgas med PD-L1 men de ska inte inkluderas i poängsättningen vid bestämning av PD-L1-positivitet. (129105-002) P03914SE_02/SK00521-2/2016.04 s. 5/17

Obs! Brun pigmentering kan förekomma vid tolkning av prover från melanompatienter. Melanin ska exkluderas vid poängsättni av plasmamembranfärgning. Det bli lättare att identifiera och utesluta melanininnehåll genom att jämföra med ett påföljande objektglas som färgats med NCR. Om mycket förhöjda melaninhalter förekommer innan poängsättning av plasmamembranfärgning av tumörceller kan provet uteslutas från tolkningen och bedömas som obestämt. För varje färgningskörning ska objektglasen undersökas i den ordning som visas i tabell 1 för att bestämma färgningskörningens validitet och möjliggöra utvärdering av vävnadsprovets färgning. Se PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Interpretation Manual for Non-Squamous Non-Small Cell Lung Cancer or for Melanoma för ytterligare information. Tabell 1: Rekommenderad ordning för utvärdering av objektglas Prover Förklaring Krav 1. H&E (från laboratorium) En hematoxylin- och eosinfärgning (H&E) av vävnadsprovet utvärderas först för att bedöma vävnadens histologi och bevarandekvalitet. 2. Kontrollobjektglas (från Dako) Kontrollobjektglaset som färgats med PD-L1 Primary Antibody från PD-L1 IHC 28-8 pharmdx bör undersökas för att säkerställa att alla reagens fungerar korrekt. Kontrollobjektglaset innehåller den PD-L1-positiva cellinjepelleten och den PD-L1-negativa cellinjepelleten. Färgning med PD-L1 IHC 28-8 pharmdx och H&E bör utföras på seriesnitt från samma paraffinblock som provet. Vävnadsproverna ska vara intakta, välbevarade och ska bekräfta tumörtypen. Ett kontrollobjektglas bör färgas med Primary Antibody till PD-L1 i varje färgningskörning. NCI-H226 (PD-L1-positiv kontrollcellinje) acceptanskriterier: Plasmamembranfärgning av 80 % av celler vid 2+ normal färgningsintensitet. Icke-specifik färgning < 1+ intensitet. MCF-7 (PD-L1-negativ kontrollcellinje) acceptanskriterier: Ingen specifik färgning. Icke-specifik färgning < 1+ intensitet. Notera att färgning av fåtal celler i cellpelleten MCF-7 kan förekomma. Följande acceptanskriterier gäller: förekomst av totalt 10 celler med tydlig plasmamembranfärgning eller cytoplasmisk färgning med 1+ intensitet inom MCF-7-cellpelletens gränser är godtagbart. 3. Objektglas med positiv kontrollvävnad (från laboratorium) 4. Objektglas med negativ kontrollvävnad (från laboratorium) Därefter undersöks objektglasen med positiv kontrollvävnad som färgats med både PD-L1 Primary Antibody och Negative Control Reagent. Objektglasen verifierar att fixeringsmetoden och målåtervinningsprocessen är korrekta. Kända positiva vävnadskontroller bör endast användas för övervakning av korrekt resultat från bearbetade vävnader och testreagens, inte som hjälp i formulering av en specifik diagnos i patientvävnadsprov. Objektglasen med negativ kontrollvävnad (som är känt PD-L1-negativ) som färgats med både PD-L1 Primary Antibody och Negative Control Reagent ska därefter undersökas för att verifiera specificiteten hos den primära antikroppens märkning av målantigenen. Alternativt kan negativa delar av den positiva kontrollvävnaden användas som negativ kontrollvävnad, men detta bör verifieras av användaren. Om ingen av kontrollcellinjerna uppfyller dessa kriterier bör alla resultat med patientproverna anses ogiltiga. Kontrollerna bör vara biopsiprover/kirurgiska prover av samma tumörtyp som patientprovet, fixerade, bearbetade och inbäddade så snart som möjligt på samma sätt som patientproverna. Använd intakta prover för att tolka färgningsresultat eftersom nekrotiska eller degenererade celler ofta färgas icke-specifikt. Vävnaderna som väljs till den positiva vävnadskontrollen bör ge svag till måttlig positiv färgning med PD-L1 för att underlätta upptäckt av små skillnader i analyskänslighet. Två kontrollobjektglas med positiv vävnad ska inkluderas i varje färgningskörning. Objektglas färgat med PD-L1: närvaro av brun plasmamembranfärgning bör observeras. Icke-specifik färgning bör vara 1+. Objektglas färgat med Negative Control Reagent: ingen membranfärgning. Icke-specifik färgning bör vara 1+. Om de positiva vävnadskontrollerna inte uppvisar lämplig positiv färgning bör resultaten från testvävnaderna anses ogiltiga. Kontrollerna bör vara biopsiprover/kirurgiska prover av samma tumörtyp som patientprovet, fixerade, bearbetade och inbäddade så snart som möjligt på samma sätt som patientproverna. Två kontrollobjektglas med negativ vävnad ska inkluderas i varje färgningskörning. Objektglas färgat med PD-L1: ingen membranfärgning i tumörceller. Ickespecifik färgning bör vara 1+. Objektglas färgat med Negative Control Reagent: ingen membranfärgning. Icke-specifik färgning bör vara 1+. Om specifik plasmamembranfärgning förekommer på objektglasen med negativ kontrollvävnad bör resultat från patientprov anses ogiltiga. (129105-002) P03914SE_02/SK00521-2/2016.04 s. 6/17

5. Objektglas med patientvävnad färgad med Negative Control Reagent 6. Objektglas med patientvävnad färgad med PD-L1 primär antikropp Undersök patientprov som färgats med Negative Control Reagent från PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Negative Control Reagent används i stället för Primary Antibody och underlättar tolkningen av specifik färgning vid antigenen. Undersök hela objektglasen med patientvävnad som färgats med PD-L1 Primary Antibody från PD-L1 IHC 28-8 pharmdx sist. Se sammanfattning och förklaring, begränsningar och prestandaegenskaper för specifik information om immunreaktivitet från PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Avsaknad av plasmamembranfärgning verifierar den specifika märkningen av målantigenen av PD-L1 Primary Antibody. Icke-specifik färgning bör vara 1+. Intensiteten av positiv färgning ska bedömas med hänsyn till eventuell ickespecifik färgning som observerats på objektglaset med Negative Control Reagent i samma körning. På samma sätt som för alla immunhistokemiska tester betyder ett negativt resultat att antigenen inte upptäcktes, och inte nödvändigtvis att antigenen inte fanns i de celler eller den vävnad som analyserades. Alla livsdugliga tumörceller på hela det PD-L1-färgade patientobjektglaset måste utvärderas och inkluderas i poängutvärderingen för PD-L1. Det bör finnas minst 100 livsdugliga tumörceller på det PD-L1-färgade patientobjektglaset för att bestämma andelen färgade celler. Allmänna begränsningar 1. Immunhistokemi är en diagnostisk process i flera steg som kräver specialistutbildning för val att lämpliga reagens, vävnadsurval, fixering, bearbetning och beredning av IHC-objektglasen och tolkning av färgningsresultaten. 2. Vävnadsfärgning är beroende av hantering och bearbetning av vävnaden före färgning. Felaktig fixering, nedfrysning, upptining, tvättning, torkning, uppvärmning, sektion eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan orsaka artefakter, antikroppsinfångning eller falska negativa resultat. Inkonsekventa resultat kan bero på variationer i fixerings- och inbäddningsmetoder, eller på naturliga oregelbundenheter i vävnaden. 3. Överflödig eller ofullständig kontrastfärgning kan leda till inkorrekt tolkning av resultaten. 4. Den kliniska tolkningen av positiv färgning eller avsaknad därav måste utvärderas med hänsyn till klinisk presentation, morfologi och andra histopatologiska kriterier. Den kliniska tolkningen av färgning eller avsaknad därav måste kompletteras av morfologiska undersökningar eller korrekta kontroller samt andra diagnostiska tester. En kvalificerad patolog som är förtrogen med antikropparna, reagens och metoderna som används måste ta ansvar för tolkningen av det färgade preparatet på objektglaset. Färgning måste utföras i ett auktoriserat laboratorium under överinseende av en patolog som ansvarar för att granska de färgade objektglasen och för att se till att positiva och negativa kontroller är korrekta. 5. Vävnader från personer infekterade med hepatit B-virus och med hepatit B-ytantigen (HBsAg) kan uppvisa icke-specifik färgning med pepparrotsperoxidas (15). 6. Sannolikheten för oväntade reaktioner även i testade vävnadstyper kan inte fullständigt elimineras på grund av biologisk variation av antigenuttryck i neoplasma eller andra patologiska vävnader. Kontakta Dakos tekniska support med dokumenterade oväntade reaktioner. 7. Falskt positiva resultat kan uppstå på grund av icke-immunologisk bindning av proteiner eller substratreaktionsprodukter. De kan även orsakas av pseudoperoxidas aktivitet (erytrocyter) och endogen peroxidasaktivitet (cytokrom c) (14). 8. Reagens och instruktionerna som medföljer det här systemet har utformats för bästa möjliga prestanda. Ytterligare spädning av reagens eller ändring av inkuberingstider eller temperaturer kan ge felaktiga eller motstridiga resultat. Produktspecifika begränsningar 1. Falskt negativa resultat kan orsakas av försämring av antigenet i vävnaderna med tiden. Vävnadssnitt som monterats på objektglas ska förvaras mörkt vid 2 8 C eller i rumstemperatur up p till 25 C och färgas inom 4 månader efter sektio n. Förhållandena för förvaring och hantering av objektglas bör inte överskrida 25 C e fter montering för att säkerställa vävnadens integritet och antigenicitet. 2. För optimala och reproducerbara resultat kräver PD-L1-proteinet förbehandling med målåtervinning när vävnaderna är rutinfixerade (neutralbuffrat formalin) och paraffininbäddade. 3. Ersätt inte reagens från andra lotnummer av den här produkten eller från satser från andra tillverkare. Det enda undantaget är EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph 50x, som vid behov finns tillgängligt som kod K8005. 4. Färgade kontrollcellinjer ska endast användas för validering av färgningskörningen och inte användas för att poängsätta färgreaktionen i vävnadssnitt. 5. Användning av PD-L1 IHC 28-8 pharmdx på vävnad med andra fixeringsmedel än 10 % neutralbuffrat formalin har inte verifierats. 6. Excisions-, incisions-, punktions- eller nålbiopsier betraktades som godkända provtyper för de kliniska studierna med PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Finnålsaspirat eller andra cytologiprover var otillräckliga för analys av biomarkörer och exkluderades från de kliniska studierna med PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Icke-klinisk prestandautvärdering Analytisk specificitet för PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Den primära antikroppen för PD-L1 IHC 28-8 pharmdx är en monoklonal kaninantikropp mot humant PD-L1 av klon 28-8. Immunogenen som används för att generera antikroppar är ett renat rekombinant humant PD-L1 som innehåller den extracellulära domänen (Phe19- Thr239) av humant PD-L1. IHC-färgning med PD-L1 Primary Antibody visade ingen korsreaktivitet för exogent uttryckt PD-L2 i ovarieceller från kinesisk dvärghamster (CHO). PD-L1 IHC 28-8 pharmdx detekterar specifikt PD-L1-membranprotein uttryckt i tumörceller i FFPE-vävnader, vilket helt kan upphävas genom att tillsätta PD-L1-antigen. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx detekterar inget PD-L1-membranprotein i PD-L1-knockout-tumörceller där PD-L1-genen tagits bort genetiskt. (129105-002) P03914SE_02/SK00521-2/2016.04 s. 7/17

Normala och neoplastiska vävnader Tabell 2 sammanfattar antikroppsimmunreaktiviteten från Monoclonal Rabbit Anti-Human PD-L1 för den rekommenderade panelen med normala vävnader. Tabell 3 sammanfattar antikroppsimmunreaktiviteten från Monoclonal Rabbit Anti-Human PD-L1 för neoplastiska vävnader i vävnadsmikroarrayer med flera tumörer. Alla vävnader formalinfixerades, paraffininbäddades och färgades med PD-L1 IHC 28-8 pharmdx enligt instruktionerna i det här produktbladet. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx detekterade PD-L1-protein i plasmamembran i celltyper som man vet uttrycker PD-L1-antigen, som immunceller och celler av epitelursprung, huvudsakligen tumörceller. Tabell 2: Sammanfattning av PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, normal vävnadsreaktivitet Vävnadstyp (antal testade) Positiv plasmamembranfärgning: Vävnadselement Positiv cytoplasmisk färgning: Vävnadselement Benmärg (3) 3/3 Megakaryocyter 3/3 Megakaryocyter Binjure (3) 3/3 Medullära celler 3/3 Medullära celler Bisköldkörtel (3) 3/3 Epitel 0/3 Bröst (3) 0/3 0/3 Bukspottkörtel (3) 3/3 Epitel (huvudsakligen ö-celler) 3/3 Epitel (huvudsakligen ö-celler) Cerebellum (3) 0/3 0/3 Cerebrum (3) 0/3 0/3 Cervix (3) 1/3 Epitel 1/3 Epitel Esofagus (3) 0/3 0/3 Hud (3) 0/3 1/3 Epitel Hypofys (3) 1/3 Främre adenohypofysen 1/3 Främre adenohypofysen 3/3 Bakre neurohypofysen Lever (3) 2/3 Immunceller 2/3 Immunceller Livmoder (3) 0/3 0/3 Lunga (3) 3/3 Alveolära makrofager 0/3 Mage (3) 0/3 0/3 Mesotelceller (3) 0/3 0/3 Mjälte (3) 1/3 Makrofager 0/3 3/3 Littorala celler Muskel, hjärta (3) 0/2 0/2 Muskel, skelett (3) 0/2 0/2 Nerv, perifer (3) 0/3 0/3 Njure (3) 3/3 Tubulärt epitel 3/3 Tubulärt epitel Prostata (2) 0/2 0/2 Sköldkörtel (3) 0/3 0/3 Spottkörtel (3) 0/3 0/3 Testikel (3) 0/3 1/3 Leydigceller Tjocktarm (3) 2/3 Makrofager 0/3 Tonsill (3) 3/3 Kryptepitel 0/3 3/3 Germinalcentrum (immunceller) Tunntarm (2) 0/2 0/2 Tymus (3) 3/3 Medullär epitel 0/3 Äggstock (3) 0/3 0/3 Tabell 3: Sammanfattning av PD-L1 IHC 28-8 pharmdx neoplastisk vävnadsreaktivitet Tumörtyp Plats/organ PD-L1-positiv/total (N=162) Appendix 1/1 Bronkoalveolärt karcinom, lunga 0/1 Bröst, DCIS 0/2 Bröst, invasiv duktal 3/7 Bröst, invasiv duktal metastasering till lymfkörtlar 1/1 Bukspottkörtel 1/2 Bukspottkörtel, duktal 0/3 Cervix, endocervikal typ 0/1 Esofagus 1/1 Gallblåsa 2/4 GI, metastasering till lunga 0/1 Adenokarcinom Huvud och hals, hårda gommen 0/1 Kolon 2/5 Livmoder, endometrium 1/3 Livmoder, klarcell 1/1 Lunga 2/5 Mage, mucinös 0/1 Magsäck 1/6 Prostata 2/4 Sköldkörtel, follikulär 0/1 Sköldkörtel, follikulär-papillär 0/1 Sköldkörtel, papillär 0/3 Spottkörtel/öronspottkörtel 0/2 Tjocktarm, metastasering till lever 1/1 (129105-002) P03914SE_02/SK00521-2/2016.04 s. 8/17

Tumörtyp Plats/organ PD-L1-positiv/total (N=162) Tjocktarm, mucinös 0/1 Tunntarm 0/2 Äggstock 0/1 Äggstock, endometrioid 0/1 Äggstock, mucinös 0/1 Äggstock, serös 0/1 Ändtarm 2/4 Adrenocortikalt karcinom Binjure 0/1 Astrocytom Cerebrum 0/3 Basalcellskarcinom Hud 0/1 Embryonalt karcinom Testikel 0/1 Ependymom Hjärna 0/1 Glioblastom Hjärna 0/1 Hepatoblastom Lever 0/1 Hepatocellulärt karcinom Lever 1/5 Kolon 0/1 Interstitialom Tunntarm 0/1 Ändtarm 0/1 Karcinom Öron, näsa, hals 0/1 Kordom Bäckenhåla 0/1 Liposarkom Bukhåla, mucinös 0/1 Lymfom Anaplastisk stor cell Lymfkörtel 1/1 Diffus B-cell Lymfkörtel 2/4 Hodgkin Lymfkörtel 2/2 Icke-Hodgkin Lymfkörtel 1/1 Medullablastom Hjärna 0/1 Medullärt karcinom Sköldkörtel 0/1 Melanom Näshåla 0/1 Ändtarm 0/1 Meningiom Hjärna 0/2 Mesoteliom Peritoneum 0/1 Neuroblastom Retroperitoneum 0/1 Neurofibrom Mjuk vävnad, ländryggen 0/1 Njurcellskarcinom Klarcell Njure 0/6 Papillär Njure 0/1 Primitiv neuroektodermal Retroperitoneum 0/1 Sarkom Klarcell Bukvägg 0/1 Kondrosarkom Ben 0/1 Leiomyosarkom Mjuk vävnad, bröstvägg 0/1 Urinblåsa 0/1 Liposarkom Bukhåla, mucinös 0/1 Osteosarkom Ben 0/2 Mjuk vävnad, embryonal 0/1 Rhabdomyosarkom Prostata 0/1 Retroperitoneum 0/1 Synovialsarkom Bäckenhåla 0/1 Seminom Testikel 0/2 Signetringcellskarcinom Kolon 0/1 Signetringcellskarcinom Metastatisk tjocktarmssignetringcellskarcinom till äggstock 0/1 Cervix 2/4 Esofagus 4/7 Hud 1/2 Skivepitelcellskarcinom Huvud och hals 0/2 Livmoder 1/1 Lunga 1/3 Metastatisk esofagal skvamöscellskarcinom till lymfkörtel 1/1 Småcelligt karcinom Lunga 1/2 Spermatocytom Testikel 0/2 Storcelligt karcinom Lunga 1/1 Tymom Mediastinum 1/1 Ö-cellstumör Bukspottkörtel 0/1 Övergångsepitelkarcinom Njure 0/1 Urinblåsa 3/6 (129105-002) P03914SE_02/SK00521-2/2016.04 s. 9/17

Analytisk sensitivitet: icke-skvamöst NSCLC Analytisk sensitivitet för PD-L1 IHC 28-8 pharmdx testades på 112 unika fall av FFPE-prover med icke-skvamöst NSCLC i stadium I till IV med en tillverkad produktionslot. Bedömning PD-L1-uttryck demonstrerade färgning över 0 100 % positiva tumörceller och färgintensitet 0 3. Repeterbarhet: icke-skvamöst NSCLC Repeterbarheten för PD-L1 IHC 28-8 pharmdx utvärderades av Dako. Prestandadata finns i tabell 4. Negativ procentuell överensstämmelse (NPA), positiv procentuell överensstämmelse (PPA) och total överensstämmelse (OA) för oberoende parvis jämförelse av testerna bestämdes för varje utvärderad PD-L1-uttrycksnivå. Den vanligast förekommande observationen användes som referens för att beräkna NPA, PPA, OA samt motsvarande 95 % konfidensintervall enligt Wilson Score och därför uteslöts ett av resultaten från observationen från de parvisa jämförelserna. Tabell 4: Repeterbarhet för PD-L1 IHC 28-8 pharmdx icke-skvamöst NSCLC Repeterbarhet Mellan instrument Metod Vart och ett av 10 icke-skvamösa NSCLC-prover med olika PD-L1 IHCuttryck testades med tre upprepningar på vardera av tre Autostainer Link 48-instrument. Totalt 60 oberoende parvisa jämförelser genomfördes. Mellan analytiker Vart och ett av 12 icke-skvamösa NSCLC-prover med olika PD-L1 IHCuttryck testades med tre upprepningar av tre analytiker på ett Autostainer Link 48-instrument. Totalt 72 oberoende parvisa jämförelser genomfördes. Mellan dagar Mellan loter Inom körningar Vart och ett av 10 icke-skvamösa NSCLC-prover med olika PD-L1 IHCuttryck testades med tre upprepningar under fem ej på varandra följande dagar på Autostainer Link 48- instrumentet. Totalt 80 oberoende parvisa jämförelser genomfördes. Vart och ett av 20 icke-skvamösa NSCLC-prover med olika PD-L1 IHCuttryck testades med två upprepningar med vardera av fem reagensloter på Autostainer Link 48-instrumentetet. Totalt 160 oberoende parvisa jämförelser genomfördes. Vart och ett av 10 icke-skvamösa NSCLC-prover med olika PD-L1 IHCuttryck testades med åtta upprepningar inom en körning på Autostainer Link 48-instrumentet. Totalt 70 oberoende parvisa jämförelser genomfördes. % överensstämmelse (95 % CI) 1 % uttrycksnivå 5 % uttrycksnivå 10 % uttrycksnivå NPA 100 (82,4, 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (94,3, 100) PPA 100 (96,2, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (84,5, 100) PPA 100 (92,7, 100) OA 100 (94,8, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (90,4, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (88,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (89,3, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (95,4, 100) PPA 100 (95,4, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (87,9 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,8, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (93,4, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 98,2 (90,6, 99,7) PPA 100 (86,2, 100) OA 98,8 (93,3, 99,8) NPA 100 (96,4, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (92,7, 100) PPA 100 (84,5, 100) OA 100 (94,8, 100) Extern reproducerbarhet: icke-skvamöst NSCLC Den externa reproducerbarheten för PD-L1 IHC 28-8 pharmdx har utvärderats vid tre externa testplatser. Blindurval och randomisering av färgade snitt utfördes innan de poängsattes. Prestandadata finns i tabell 5. Negativ procentuell överensstämmelse (NPA), positiv procentuell överensstämmelse (PPA) och total överensstämmelse (OA) för oberoende parvis jämförelse av testerna bestämdes för varje utvärderad PD-L1-uttrycksnivå. Den vanligast förekommande observationen användes som referens för att beräkna NPA, PPA, OA samt motsvarande 95 % konfidensintervall enligt Wilson Score och därför uteslöts ett av resultaten från observationen från de parvisa jämförelserna. (129105-002) P03914SE_02/SK00521-2/2016.04 s. 10/17

Tabell 5: Reproducerbarhet för PD-L1 IHC 28-8 pharmdx icke-skvamöst NSCLC, testad på tre externa platser Reproducerbarhet Analys mellan platser (tre platser) Analys inom platser Mellan observatörer (en observatör på vardera av tre platser) Bland observatörer (en observatör på vardera av tre platser) Metod Vart och ett av 10 icke-skvamösa NSCLC-prover med olika PD-L1 IHC-uttryck testades under fem ej på varandra följande dagar. Analys mellan platser utfördes mellan tre platser med totalt 140 oberoende parvisa jämförelser. Vart och ett av 10 icke-skvamösa NSCLC-prover med olika PD-L1 IHC-uttryck testades under fem ej på varandra följande dagar vid tre olika studieplatser. Analys inom platser utfördes för tre platser med totalt 120 oberoende parvisa jämförelser. Poängsättning av 15 icke-skvamösa NSCLC-prover med olika PD-L1 IHC-uttryck som färgats med PD-L1 IHC 28-8 pharmdx genomfördes av tre patologer, en på varje studieplats, under tre ej på varandra följande dagar. Analys mellan observatörer utfördes mellan tre platser med totalt 120 oberoende parvisa jämförelser. Poängsättning av 15 icke-skvamösa NSCLC-prover med olika PD-L1 IHC-uttryck som färgats med PD-L1 IHC 28-8 pharmdx genomfördes av tre patologer, en på varje studieplats, under tre ej på varandra följande dagar. Analys bland observatörer utfördes på tre platser med totalt 90 oberoende parvisa jämförelser. 1 % uttrycksnivå NPA 100 (93,6, 100) PPA 98,8 (93,6, 99,8) OA 99,3 (96,1, 99,9) NPA 100 (92,6, 100) PPA 98,6 (92,5, 99,8) OA 99,2 (95,4, 99,9) NPA 96,9 (89,3, 99,1) PPA 100 (93,6, 100) OA 98,3 (94,1, 99,5) NPA 95,8 (86,0, 98,8) PPA 100 (91,6, 100) OA 97,8 (92,3, 99,4) % överensstämmelse (95 % CI) 5 % uttrycksnivå NPA 91,4 (82,5, 96,0) PPA 97,1 (90,2, 99,2) OA 94,3 (89,1, 97,1) NPA 96,4 (87,9, 99,0) PPA 95,3 (87,1, 98,4) OA 95,8 (90,6, 98,2) NPA 100 (94,3, 100) PPA 89,3 (78,5, 95,0) OA 95,0 (89,5, 97,7) NPA 100 (93,1, 100) PPA 100 (90,8, 100) OA 100 (95,9, 100) Klinisk prestandautvärdering: icke-skvamöst NSCLC Den kliniska användbarheten utvärderades för PD-L1 IHC 28-8 pharmdx i studien CA209057, en öppen, randomiserad, fas 3-studie av nivolumab i jämförelse med docetaxel hos vuxna ( 18 år) försökspersoner med framskridet eller metastatiskt icke-skvamöst NSCLC efter misslyckad platinadubblettbaserad kemoterapi. Totalt 582 försökspersoner randomiserades vid 112 platser i 22 länder (Argentina, Australien, Brasilien, Chile, Frankrike, Hongkong, Italien, Kanada, Mexiko, Norge, Peru, Polen, Rumänien, Ryssland, Schweiz, Singapore, Spanien, Tjeckien, Tyskland, Ungern, USA och Österrike). Försökspersonerna randomiserades 1:1 och stratifierades enligt 1) före användning av underhållsbehandling jämfört med ingen användning av underhållsbehandling, och 2) andrahandsterapi jämfört med tredjehandsterapi. Tumörvävnadsprover samlades in före studien (baslinjen), före randomisering och före första behandling för att utföra förplanerade analyser av effektivitet enligt fördefinierade PD-L1-uttrycksnivåer vid baslinjen (sekundärt mål). Det primära effektmåttet var total överlevnad (OS). Andra sekundära effektmått var objektiv svarsfrekvens (ORR), progressionsfri överlevnad (PFS) och förbättring av sjukdomsrelaterade symtom under 12 veckor, mätt med hjälp av LCSS-skalan (Lung Cancer Symptom Scale). De demografiska egenskaperna och sjukdomsegenskaperna vid baslinjen var i allmänhet balanserade mellan de randomiserade försökspersonerna i nivolumab- och docetaxel-grupperna. Medelåldern var 62 år (intervall: 21 till 85) med 34 % 65 år och 7 % 75 år. Merparten av patienterna var vita (92 %) och män (55 %). ECOG-prestandastatus vid baslinjen var 0 (31 %) eller 1 (69 %). 79 % av patienterna var tidigare/nuvarande rökare. Tumörprover samlades in från icke-skvamösa NSCLC-tumörer, i enlighet med inklusionskriterierna för studien. Frekvenserna av PD-L1-uttryck vid vardera av de fördefinierade uttrycksnivåerna vid baslinjen, för alla randomiserade försökspersoner i CA209057 visas i tabell 6. Tabell 6: Frekvens av PD-L1-uttryck före studien hos alla randomiserade försökspersoner med icke-skvamöst NSCLC CA209057 Baslinjepopulation PD-L1-uttryckskategori Nivolumab 3 mg/kg Docetaxel Totalt Sammanlagt 292 290 582 PD-L1 kvantifierbart, N (%) 231 (79,1) 224 (77,2) 455 (78,2) PD-L1-uttryck 1 % 123/231 (53,2) 123/224 (54,9) 246/455 (54,1) PD-L1-uttryck < 1 % 108/231 (46,8) 101/224 (45,1) 209/455 (45,9) PD-L1-uttryck 5 % 95/231 (41,1) 86/224 (38,4) 181/455 (39,8) PD-L1-uttryck < 5 % 136/231 (58,9) 138/224 (61,6) 274/455 (60,2) Baslinje för PD-L1-uttryck 10 % 86/231 (37,2) 79/224 (35,3) 165/455 (36,3) PD-L1-uttryck < 10 % 145/231 (62,8) 145/224 (64,7) 290/455 (63,7) PD-L1 ej kvantifierbart, N (%) 61 (20,9) 66 (22,8) 127 (21,8) Patienter med PD-L1-uttryck vid alla fördefinierade uttrycksnivåer i OPDIVO -gruppen förknippades med ökad överlevnad jämfört med docetaxel. Hos patienter utan PD-L1-uttryck var överlevnaden däremot densamma som för docetaxel. Meningsfulla skillnader i median-os observerades för nivolumab-undergrupperna i förhållande till docetaxel-undergrupperna när de analyserades per PD-L1-uttrycksnivå. Median- OS var 17,1, 18,2 och 19,4 månader för försökspersoner som behandlades med nivolumab jämfört med 9,0, 8,1 och 8,0 månader för försökspersoner som behandlades med docetaxel, med 1 %, 5 % respektive 10 % PD-L1-uttrycksnivåer. Det fanns inga skillnader i total överlevnad (OS) mellan behandlingsgrupperna för försökspersoner med uttrycksnivåerna < 1 %, < 5 % och < 10 %, där median-os låg inom intervallen 9,7 till 10,4 månader för nivolumab och 10,1 till 10,3 månader för docetaxel. De ostratifierade riskförhållandena (HR) och medianvärdena för total överlevnad (OS) visas i figur 1. Kaplan-Meier-kurvan för undergrupper per PD-L1-uttrycksnivå visas i figur 2 och figur 3. (129105-002) P03914SE_02/SK00521-2/2016.04 s. 11/17

Figur 1: Forest plot: total överlevnad (OS) baserad på PD-L1-uttryck hos patienter med icke-skvamöst NSCLC, CA209057 Median-OS (månader) PD-L1-uttrycksnivå Ostratifierat HR OPDIVO Docetaxel 1 % (n = 246) < 1 % (n = 209) 5 % (n = 181) < 5 % (n = 274) 10 % (n = 165) < 10 % (n = 290) 0,59 17,1 9,0 0,90 10,4 10,1 0,43 18,2 8,1 1,01 9,7 10,1 0,40 19,4 8,0 1,00 9,9 10,3 Obs! De ostratifierade riskförhållandena (HR) och motsvarande 95 % konfidensintervall (CI) beräknades i en Cox proportional hazardsmodell som använder den randomiserade grenen som enda kovariat. Figur 2: Sammanlagd överlevnad patienter med icke-skvamöst NSCLC med 1 % PD-L1-uttryck, CA209057 1,0 0,9 0,8 0,25 0,5 1,0 2,0 Stöder OPDIVO Sannolikhet för överlevnad 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 OPDIVO Docetaxel 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 Total överlevnad (månader) Antal under risk OPDIVO 123 98 86 77 73 65 27 13 5 0 Docetaxel 123 102 80 61 44 36 13 4 3 0 (129105-002) P03914SE_02/SK00521-2/2016.04 s. 12/17

Figur 3: Sammanlagd överlevnad patienter med icke-skvamöst NSCLC med < 1 % PD-L1-uttryck, CA209057 1,0 0,9 0,8 Sannolikhet för överlevnad 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 OPDIVO Docetaxel 0,0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 Total överlevnad (månader) Antal under risk OPDIVO 108 82 70 60 48 39 26 17 4 0 Docetaxel 101 87 69 53 38 30 13 5 2 0 (129105-002) P03914SE_02/SK00521-2/2016.04 s. 13/17

Analytisk sensitivitet: Melanom Analytisk sensitivitet för PD-L1 IHC 28-8 pharmdx testades på 104 unika fall av melanom-ffpe-prover i stadium I till IV. Bedömning PD-L1- uttryck demonstrerade färgning över 0 100 % positiva tumörceller och färgintensitet 0 3. Repeterbarhet: Melanom Repeterbarheten för PD-L1 IHC 28-8 pharmdx utvärderades av Dako. Blindurval och randomisering av färgade snitt utfördes innan de poängsattes. Prestandadata finns i tabell 7 och tabell 8. Genomsnittlig negativ procentuell överensstämmelse (ANA), genomsnittlig positiv procentuell överensstämmelse (APA) och total överensstämmelse (OA) för icke-redundant parvis jämförelse av testerna bestämdes för varje utvärderad PD-L1-uttrycksnivå. Tabell 7: Repeterbarhet för PD-L1 IHC 28-8 melanom Repeterbarhet Mellan instrument Mellan analytiker Mellan dagar Mellan loter Inom körningar Metod Vart och ett av 16 melanomprover med olika PD-L1 IHCuttryck testades med tre upprepningar på vardera av tre Autostainer Link 48-instrument. Totalt 160 parvisa jämförelser genomfördes. Vart och ett av 16 melanomprover med olika PD-L1 IHCuttryck testades med tre upprepningar av tre analytiker på ett Autostainer Link 48-instrument. Totalt 240 oberoende parvisa jämförelser genomfördes. Vart och ett av 16 melanomprover med olika PD-L1 IHCuttryck testades med tre upprepningar under fem ej på varandra följande dagar på Autostainer Link 48- instrumentet. Totalt 160 parvisa jämförelser genomfördes. Vart och ett av 16 melanomprover med olika PD-L1 IHCuttryck testades med två upprepningar med vardera av tre reagensloter på Autostainer Link 48-instrumentet. Totalt 640 oberoende parvisa jämförelser genomfördes. Vart och ett av 16 melanomprover med olika PD-L1 IHCuttryck testades med åtta upprepningar inom en körning på Autostainer Link 48-instrumentet. Totalt 160 parvisa jämförelser genomfördes. % överensstämmelse (95 % CI) 1 % uttrycksnivå 5 % uttrycksnivå ANA 89,5 (83,2, 93,6) APA 90,5 (84,8, 94,2) OA 90,0 (86,0, 92,9) ANA 96,4 (92,9, 98,2) APA 96,8 (93,8, 98,4) OA 96,6 (94,5, 97,9) ANA 95,5 (90,3, 97,9) APA 96,8 (93,1, 98,6) OA 96,3 (93,5, 97,9) ANA 98,6 (97,3, 99,3) APA 98,8 (97,8, 99,4) OA 98,7 (98,0, 99,2) ANA 97,1 (92,6, 98,9) APA 97,7 (94,1, 99,1) OA 97,4 (94,9, 98,7) ANA 90,8 (85,7, 94,2) APA 85,5 (77,6, 90,9) OA 88,8 (84,6, 91,9) ANA 91,3 (87,1, 94,2) APA 88,8 (83,4, 92,6) OA 90,2 (87,0, 92,7) ANA 90,0 (84,0, 93,9) APA 90,0 (84,0, 93,9) OA 90,0 (86,0, 92,9) ANA 92,6 (90,6, 94,2) APA 86,6 (83,1, 89,5) OA 90,5 (88,7, 91,9) ANA 93,6 (89,0, 96,4) APA 89,8 (82,7, 94,2) OA 92,2 (88,4, 94,8) Extern reproducerbarhet: Melanom Den externa reproducerbarheten för PD-L1 IHC 28-8 pharmdx har utvärderats vid tre externa testplatser. Blindurval och randomisering av färgade snitt utfördes innan de poängsattes. Prestandadata finns i tabell 8. Genomsnittlig negativ procentuell överensstämmelse (ANA), genomsnittlig positiv procentuell överensstämmelse (APA) och total överensstämmelse (OA) för icke-redundant parvis jämförelse av testerna bestämdes för varje utvärderad PD-L1-uttrycksnivå. Tabell 8: Reproducerbarhet för PD-L1 IHC 28-8 pharmdx melanom testad på tre externa platser % överensstämmelse (95 % CI) Reproducerbarhet Metod 1 % uttrycksnivå 5 % uttrycksnivå Vart och ett av 18 melanomprover med olika PD-L1 IHCuttryck testades under fem ej på varandra följande dagar. ANA 99,3 (98,8, 99,7) ANA 93,8 (92,5, 95,1) Analys mellan APA 99,3 (98,8, 99,7) APA 92,7 (91,2, 94,2) platser (tre platser) Analys mellan platser utfördes mellan tre platser med OA 99,3 (98,7, 99,7) OA 93,3 (91,9, 94,7) totalt 1 350 parvisa jämförelser. Analys inom platser Mellan observatörer (en observatör på vardera av tre platser) Bland observatörer (en observatör på vardera av tre platser) Vart och ett av 18 melanomprover med olika PD-L1 IHCuttryck testades under fem ej på varandra följande dagar vid tre olika studieplatser. Analys inom platser utfördes på tre platser med totalt 540 parvisa jämförelser. Poängsättning av 30 melanomprover med olika PD-L1 IHC-uttryck som färgats med PD-L1 IHC 28-8 pharmdx genomfördes av tre patologer, en på varje studieplats, under tre ej på varandra följande dagar. Analys mellan observatörer utfördes mellan tre platser med totalt 810 parvisa jämförelser. Poängsättning av 30 melanomprover med olika PD-L1 IHC-uttryck som färgats med PD-L1 IHC 28-8 pharmdx genomfördes av tre patologer, en på varje studieplats, under tre ej på varandra följande dagar. Analys bland observatörer utfördes på tre platser med totalt 270 parvisa jämförelser. ANA 99,3 (98,4, 99,8) APA 99,3 (98,5, 99,8) OA 99,3 (98,5, 99,8) ANA 90,4 (88,1, 92,5) APA 91,7 (89,7, 93,6) OA 91,1 (89,1, 93,1) ANA 99,2 (97,9, 100) APA 99,3 (98,2, 100) OA 99,3 (98,1, 100) ANA 97,3 (95,8, 98,5) APA 96,8 (95,1, 98,2) OA 97,0 (95,6, 98,3) ANA 93,2 (91,3, 94,8) APA 91,9 (89,8, 93,9) OA 92,6 (90,7, 94,3) ANA 97,9 (96,1, 99,4) APA 97,6 (95,4, 99,2) OA 97,8 (95,9, 99,3) (129105-002) P03914SE_02/SK00521-2/2016.04 s. 14/17