Labratinsrapprt Receptrfarmaklgi glattmuskulatur Anna Ed, Filip Järbur, Måns Perssn, Susanne Svenssn Basgrupp 9, T3 Läkarprgrammet, Linköpings universitet, VT2014 Syfte Syftet med labratinen är att undersöka effekten av agnisten nradrenalin (NA) vid lika dser på glattmuskulatur, samt hur antagnisterna prazsin ch yhimbin påverkar denna effekt. Intrduktin En drgs ptens anger den ds sm krävs för en viss effekt. Dess efficacy anger drgens förmåga att framkalla respns när den binder in till en receptr. Ptens ch efficacy för en drg kan plttas i en ds-respnskurva. EC50-värdet anger den kncentratin sm krävs för att uppnå 50% av maxrespns. (1,2) Agnisten NA stimulerar adrenerga receptrer i glattmuskulatur varvid det sker kntraktin. Receptragnister kan vara antingen fulla agnister eller partiella agnister. Fulla agnister kan rsaka maximalt bilgiskt svar, medan partiella agnister endast kan rsaka submaximalt svar. (1,2) Receptrantagnister minskar eller mtverkar effekterna av agnister ch kan vara antingen kmpetitiva eller icke-kmpetitiva. Kmpetitiv innebär att antagnisten binder in reversibelt till samma site sm agnisten. På detta sätt hindras agnisten från att binda in ch aktivera receptrn. Maxrespns för agnisten kan ändå uppnås genm att öka dess kncentratin. Kmpetitiva antagnister rsakar en högerförskjutning av ds-respns-kurvan ch minskar alltså agnistens ptens. Icke-kmpetitiv innebär antingen att antagnisten binder in irreversibelt på samma site sm agnisten eller att antagnisten binder in allsteriskt ch därigenm hindrar agnisten från att aktivera receptrn även m agnisten binder in. Ickekmpetitiva antagnister minskar agnistens efficacy ch vid närvar av spare receptrs, även dess ptens. (1,2)
Material Artärpreparat Prazsin Yhimbin Nradrenalin Krebsbikarbnatbuffert Gluks Pipetter Prvrör Tensinsgivare Förstärkare Metd I labratinen användes artärpreparat från kr där dessa tgs precis efter slakt av kssrna för att minska degradering av vävnaden. Dessa preparat hade preparerats så att så lite fett ch bindväv fanns kvar sm möjligt. Preparaten spändes sedan upp i en tensinsgivare sm användes sm mätinstrument för att känna av ökad eller minskad tensin i vävnadspreparatet. Tensinsgivaren var kpplad till en förstärkare sm kunde amplifiera resultatet ch skriva ut resultaten i frm av kurvr på ett papper. För att vävnadspreparatet inte skulle degradera tillsattes krebs bikarbnatbuffert för att få till en så autentisk miljö sm möjligt. Vätskan värmdes upp till ca 37⁰C ch tillsattes syre ch kldixid (95 % ch 5 %). Till vätskan tillfördes även lite gluks för att vävnadspreparatet skulle få näring. I labratinen användes 5 lika kncentratiner av 2 lika läkemedel sm skulle påverka kntraktinen av vävnadpreparaten. För att få ett jämförbart resultat mättes även kntraktinen på ett behandlat preparat för att ha ett kntrllpreparat. Till tre av preparaten tillsattes prazsin i kncentratinerna 10^-9M, 10^-8M ch 3x10^-8M. Till två av preparaten tillsattes yhimbin i kncentratinerna 10^-8 ch 3x10^-8. Efter att antagnisterna fått verka i ett par minuter tillsattes nradrenalin till samtliga preparat i ökande ds. Slutkncentratinerna i bufferten gick från den lägsta 10^-9M, 3 10^-9M, 10^-8M, 3 10^-8M, 10^-7M, 3 10^-7M, 10^-6M, 3 10^-6M, 10^-5M, 3 10^-5M, 10^-4M, 3x10^-4M, 10^-3M till den högsta 3x10^-3M. Dessa kncentratiner späddes i så kallade spädningsserier då man utnyttjar tidigare preparerade kncentratiner för att få fram nästa ds. Dessa slutkncentratiner tillsattes utan hänsyn till tidigare dser. Det vill säga med kumulativ dsering. Detta gjrdes för att skillnaden mellan dserna var stra vilket gör att slutkncentratinen inte påverkas så mycket ch att preparatet bryter ner nradrenalinet så delar av den tidigare dsen är inaktivt. Efter varje ds nradrenalin väntades 2 min innan nästa ds nradrenalin tillsattes. Undantaget till detta var att m kntraktinskurvan frtfarande steg efter 2 min fick preparatet stå till dess att kurvan planat ut. Dessa kntraktinskurvr gav sedan upphv till våra resultat.
Resultat I diagrammet nedan visas ds-respns-kurvr av genmförda experiment. På x-axeln visas kncentratinen (M) av nradrenalin (NA) i lgaritmisk skala. På y-axlen visas % av glattmuskulaturpreparatets maximala kntraktinskraft. 100 80 60 40 20 A1=kntrll B3=Yhimbin 10-8 B2=Yhimbin 3x10-8 A3=prazsin 3x10-8 B0=prazsin 10-8 B1=prazsin 10-9 0-20 I nedanstående tabell redvisas EC 50 -värden för NA vid lika antagnistkncentratiner. EC 50 -värdena avlästes ur vanstående diagram. Antagnistkncentratin (M) Prazsin 10^-9 Prazsin 10^-8 Prazsin 3x10^-8 Yhimbin 10^-8 Yhimbin 3x10^-8 Kntrll EC 50 -värde (M) 7,59x10^-4 8,2x10^-4 9,07x10^-4 7,82x10^-4 8,91x10^-4 7,36x10^-4
Diskussin Nradrenalin (NA) verkar sm agnist på α- ch β-adrenerga receptrer ch rsakar glattmuskelkntraktin (1, 2). Eftersm prpranll (β-antagnist) är tillsatt i samma mängd i alla rganbad kmmer β-receptrerna på glattmuskulaturpreparatet vara blckerade. Studiens fkus ligger därför på effekter av α-adrenerga receptrers antagnister. Prazsin är en selektiv α 1 -receptr-antagnist ch yhimbin är en α 2 -receptr-antagnist (2). Vi förväntar ss att dessa antagnister ska mtverka effekten av nradrenalin. Respnsen kan dck ber på flera lika faktrer t ex mängden α 1 -receptrer ch α 2 -receptrer i den aktuella vävnaden, aktivering av receptrerna kan trigga lika starkt cellsvar ch inverkan av antagnsiternas selektivitet/affinitetet för respektive receptr. Vid högre kncentratiner av antagnister minskar selektiviteten för respektive receptr, vilket medför att antagnisten kan binda även till övriga receptrer. Glattmuskulatur i kärl innehåller större andel α 1 -receptrer än α 2 -receptrer (1). α- receptrerna invlverade i glattmuskelkntraktin är främst av typ α 1 (2), vilket skulle kunna medföra att prazsin har starkare antagnistisk effekt. För att kunna jämföra de lika glattmuskulaturpreparaten på ett krrekt sätt behövde vi ta hänsyn till att preparaten hade lika strlek ch därmed lika kntraktinsförmåga. Preparaten nrmaliserades mt maximal kntraktinsrespns. NA kan inte trigga maximal kntraktil respns, därför tillsattes en lösning med hög kncentratin av kalium. Vi plttade ds-respns-kurvr för alla genmförda experiment, dvs med lika kncentratiner av antagnister. För att en ds-respns-kurva ska vara användbar för att estimera EC 50 -värden måste den maximala effekten av agnisten uppnås ch därmed ge en utplaning av kurvan. Vi kan se i vårt resultat att de flesta kurvrna har en sigmidal frm ch planar ut. Diagrammet visar att prazsin förskjuter ds-respns-kurvan åt höger. Med ökande kncentratin prazsin förskjuts kurvan ytterligare åt höger ch EC 50 -värdet ökar. Hela kurvan för den högsta kncentratinen av prazsin är tydligt högerförskjuten medan kurvans lutning är parallell med kntrllkurvan. Detta tyder på att prazsin är en reversibel kmpetitiv antagnist. Genm att efterhand höja kncentratinen av agnisten kmmer antagnisten trängas undan ch få mindre effekt, dvs vi kmmer att erhålla en ökad muskelkntraktin. För att kunna bekräfta att antagnisten är reversibelt kmpetitiv hade det varit bra med ytterligare högre kncentratiner av NA för att kunna undersöka m kurvan når upp till maxrespns. Vad gäller yhimbin är resultaten inte lika tydliga. Vi har enbart två lika kncentratiner av yhimbin, vilket gör det svårt att se ett mönster ch medför svårigheter att dra slutsatser m vilken typ av antagnistisk verkan yhimbin har. Vi kan dck fastställa att yhimbin inte uppvisar samma tydliga högerförskjutning sm prazsin, utan det verkar snarare sm m kurvan har en svagare lutning. Detta kan tyda på att yhimbin är en icke-kmpetitiv antagnist eller irreversibel kmpetitiv anatagnist.
Felkällr Vävnaden Utrustning Preparatin Mntering Vävnadsnekrs Skrivare: bläck tg slut, penna lssnade Organbad : svårt att reglera mängden tillförd gas, vilket kan få till följd att phbalansen mellan baden kan ha varit jämn samt att en sämre mrörning kan givit fördröjd respns. Pipetter: kalibrering Mänskliga faktrn Spädningsserie Pipettering Applicering Avläsning Kemikalier NA relativt instabil mlekyl Referenser 1. Basic and Clinical Pharmaclgy, Katzung, Trevr and Masters (2009), 12th Editin 2. Pharmaclgy, Elsevier, Rang and Dale (2012), 7th editin