Western blot BMA-09, VT-11, Termin 4 Ylva Hedberg Fransson
Laborationer I denna laboration ingår tre laborativa moment; 1) lösningsberedning 2) elektrofores med SDS-PAGE och transfer 3) immunodetektion För att bli godkänd på laborationerna krävs aktivt deltagande, att du för arbetsbok samt skriver en godkänd laborationsrapport. Laborationsrapport Laborationsrapporten ska skrivas som en fullständig labrapport. Den ska innehålla abstrakt, keywords, referenser på antikroppar mm, referenslista etc. I resultatdelen ska momenten detektion av totalprotein, samt optimering av antikroppskoncentrationen redovisas. Rapporten lämnas i forumet på Cambro, senast 23/9. Laborationens målsättning Målsättningen med laborationen är att du ska få planera och detektera proteiner samt utföra en optimering av western blot, dessutom får du träning i dokumentation. I gruppen kommer ni delvis att själva bestämma er exakta frågeställning och utifrån den ska ni sedan formulera ert syfte i laborationsrapporten. Gruppindelning Grupp 1A Grupp 2A Grupp 3A Grupp 1B Grupp 2B Grupp 3B Ni kommer att jobba i grupper, 2-3 personer/grupp. Varje grupp ansvarar för en gel/filter, men för att kunna utföra laborationen måste ni samarbeta då 2 geler körs samtidigt. Ni kommer att få bereda lösningar så att det räcker för 2 geler. Detta gör att grupp A och B ansvarar för varsin gel, men bereder lösningarna tillsammans och måste synka applicering av prover med varandra så att ni kan starta gelerna samtidigt. Blanda lösningar, planera geler 19/9 Under dessa timmar ska ni beräkna och planera hur ni ska gå till väga för att bereda era lösningar. beräkna slutkoncentration på lösningarna. bereda lösningar. planera hur ni vill applicera proverna och hur ni tänker utföra immunodetektionen. påbörja förberedelser inför det laborativa som krävs för western blot. Lösningsberedning Bered lösningar till grupp A+B enligt följande: Grupp A Grupp B 1 ml 2xLB-ME 800 ml Tvättlösning till immunodetektion 1 L runningbuffert 1 L transferbuffert Grupp 3B ska dessutom bereda 3 ml 10% APS (ammoniumpersulfat). 2
Recept på lösningar (stockkoncentrationen anges inom parentes) 2 x LB ME 4 ml 10% SDS 1 ml 1,0M Tris ph 6,8 2 ml 50% glycerol 2 ml dest vatten Färga med några korn bromfenolblått (BFB). Tvättlösning 1X PBS (10x lösning) 0,1 % Tween 20 (20% lösning) Späd med vatten, tillsätt tween 20 sist (annars blir det skumbad!). Runningbuffert (Förvaras i kylskåp) 0,3 % tris (pulver) 1,4 % glycine (pulver) 0,1 % SDS (10% lösning) Löses upp i vatten. Använd gärna magnetomrörare. Tillsätt SDS sist annars blir det skumbad! Transferbuffert (Förvaras i kylskåp) 0,3 % tris (pulver) 1,4 % glycine (pulver) 20 % metanol (100 % lösning) Löses upp i vatten. Använd gärna magnetomrörare. Tillsätt gärna metanolen då pulvret har löst sig. 10% APS Tillreds från pulver som löses i vatten. Beredning och applicering av prover Vi har tillgång till proteinextrakt från två olika cellinjer; o HeLa: celler som ni har odlat i termin 2. Cellerna är odlade från en livmoderhalscancer (från patienten Henrietta Lacks). HeLa 12,4 µg/µl o FaDu: köpt från ATCC (USA), odlat från en skivepitelcancer i huvud- och halsregionen, i detta fall belägen i oropharynx. Två olika extraktioner är gjorda, detta gör att proverna finns med två olika koncentrationer. FaDu 07 10,2 µg/µl FaDu 09 5,3 µg/µl Beräkna 30 µg protein/lane. Späd gärna extraktet så att ni får jobba med större volymer => mindre felkällor. Blanda lika delar LB och prov. Lämplig totalvolym (prov+lb) per lane är max 20 µl (helst > 12 µl). Tillsätt merkaptoetanol till LB: till 90 µl 2xLB-ME tillsätts 10 µl ME = 100 µl LB. Beräkna hur mycket LB ni behöver och gör sedan i ordning lämplig volym. Allt arbete med ME skall ske i dragskåp! Varje gel rymmer 10 prover. Molekylviktsstandard (Broad range, Bio-Rad) Molekylviktsstandarden späds alltid 10 µl LB + 0,6 µl standard. (Förvaras flytande i -20C, håll den kall!!!) Separationen mellan olika molekylvikter varierar mellan olika koncentrationer på gelen. Detta innebär att koncentrationen på gelen väljs utifrån den önskade separation. Nedan visas skillnaden i separation för 10 respektive 12 %-ig SDS-PAGE gel. Till höger i bilden ses hur separationen ser ut på filtret, efter ponceau röd-infärgningen, elektroforesen har gått i 42-43 minuter. 3
Proteiner som kan detekteras Vi har tillgång till 2 primärantikroppar, anti-actin (A2228, Sigma-Aldrich) och anti-cyclin D1 (Calbiochem). Actin Actin har en viktig roll i cytoskelettets uppbyggnad. Proteinet finns i ganska konstant mängd i alla celler, detta gör den lämplig som laddningskontroll vid analyser av western blot. Proteinet är 42 kda stort. Lämpliga antikroppsspädningar att testa är 1/500-1/10 000. Referens (review artikel) Saarikangas J, Zhao H, Lappalainen P. Regulation of the actin cytoskeleton-plasma membrane interplay by phosphoinositides.physiol Rev. 2010;90(1):259-89. http://physrev.physiology.org/content/90/1/259.full.pdf+html Cyclin D1 Proteinet cyklin D1 kodas av CCND1 genen som är en onkgen vilken uttrycks av de flesta tumörer och cancercellinjer. Cyklin D1 proteinet är 36 kda stort. Den rekommenderade spädningen för primärantikroppen är 1/500. Lämpliga spädningar att testa: 1/250-1/4000. Referenser (review artiklar) Kim JK, Diehl JA. Nuclear cyclin D1: an oncogenic driver in human cancer. J Cell Physiol. (2009) 220(2):292-6. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2874239/pdf/nihms202011.pdf Kim YT, Zhao M. Aberrant cell cycle regulation in cervical carcinoma. Yonsei Med J.(2005) 31;46(5):597-613. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2810564/?tool=pubmed Planering av immunodetektion Varje grupp disponerar över en gel. Varje grupp måste bestämma; Procentsats på gelen Vilka prover ska analyseras, bara HeLa eller även FaDu? Vilka proteiner ska detekteras, bara aktin eller även cyklin D1? Vilka antikroppsspädningar vill ni testa? Hur disponerar ni er gel? Om ni vill kan ni samarbete med en annan grupp (A/B) för att på så sätt kunna ta del av fler optimeringsförsök. Saker att beakta: Varje gel rymmer 10 brunnar, varav molekylviktsstandarden appliceras i en. De prover som kommer att analyseras med samma optimering bör placeras bredvid varandra för att minska antalet filterbitar. Vi har mest extrakt från FaDu 07 så planera så att flest analyser görs på de proverna. Actin finns i större mängd i cellerna jämfört med cyklin D1 varför det troligen är lättare att detektera aktin, därför bör anti-aktin spädas mer vid optimeringen. Tänk på att seriespädning av antikroppen gör det lättare att spädda antikroppen rätt. Planera hur ni ska göra för att späda proverna på ett smidigt sätt. Laborativa föreberedelser som kan göras i mån av tid Märka provrör Rengöra och montera glasplattor Kontrollera att lösningar är blandade 4
SDS-PAGE och transfer 20/9 Utförande 1. Diska, sprita och torka glasskivorna. 2 skivor med olika storlek behövs, alternativt en med och en utan fasta spacers beroende på vilket system ni använder. 2. Rengör kammar och ev spacers. 3. Montera glasen i behållarna enligt manual. 4. Använd 50 ml falconrör för att blanda gellösning till separationsgelen, se nedan (räcker till båda gelerna). Undvik att blanda i luft i lösningen. OBS! APS och temed tillsätts sist! Blanda lösningen i dragskåp - akrylamid i lösning är mycket farlig och cancerogen. Separationsgel Stackgel 10 % 12 % mqh 2 O 5,5 ml 4,2 ml 5,5 ml 30 % Acrylamid/Bis 37,5:1 6,7 ml 8,0 ml 960 L 1,0 M Tris ph 8,8 7,5 ml 7,5 ml - 1,0 M Tris ph 6,8 - - 900 L 10 % SDS 200 L 200 L 72 l 10 % APS 100 L 100 L 36 L TEMED tillsätts sist! 10 L 10 L 7,2 L 5. Gjut separationsgelen genom att hälla den mellan glasskivorna. Detta sker i dragskåp. Vid gjutningen lämnas en bit upp till kanten ca 2 cm, för att rymma kammen och stackgelen. Fyll det utrymmet med vatten, låt gelen polymerisera vilket tar ca 30 min. Kontrollera att glasen står vågrätt under polymeriseringen. 6. Medan gelen polymeriserar: Märk provrör. Kolla att värmeblocket (PCR-maskinen) är påslaget på 98C. Tillsätt ME till LB. OBS! Jobba i dragskåp! Ta fram proverna och låt dem tina på is proteiner degraderas i rumstemperatur. Pipettera LB (med ME) i 0,5 ml epp.rör. Späd ev. proverna, tillsätt sedan proverna och molekylviktsstandarden till rören med LB. 7. Gjut stackgelen (räcker till 3 geler), det är samma stackgel till alla separationsgeler, se recept ovan. Kom ihåg att sätta i kammen! 8. Medan stackgelen polymeriserar: Blanda klart proverna samt vortexa dem, försök att inte få så mycket luftbubblor i proverna. Denaturera proverna 2-3 minuter i värmeblock (98 C). Snabbfuga proverna för att få ned kondens från lockets undersida. 9. Medan proverna denatureras kontrolleras att stackgelen har polymeriserats. Förbered sedan gelerna för elektrofores, skölj ur brunnarna med runningbuffert. 10. Ladda molekylviktsstandarden och proverna på stackgelen. Använd långa tippar! 11. Varje brunn rymmer max 20 µl prov, var noga med att pipettera i allt prov. 12. Starta elforesen: 200 V (vilket ger ca 0,08 A), 40 minuter eller tills blåfärgen går ur gelen. 5
13. Plocka ned elforesen och märk gelerna genom att klippa av hörnen (anv. spacern eller glasdelaren) och skär bort stackgelen. Anvisningar till PVDF filtret. (PVDF: Polyvinylidenfluoridfilter) Vidrör inte filtret med händerna och helst inte med handskar. Använd en platt metallpincett utan tänder. MQ-vattnet måste vara fritt från alkaliskt fosfatas aktivitet, det ska vara autoklaverat eller ultra filrerat. Vid immunodetektionen är det viktigt att arbeta snabbt vid byte av lösningar eftersom PVDF filtret torkar fort. PVDF är mycket hydrofobt och kan inte blötas i vatten. Därför förblöter man alltid filtret i alkohol (vanligtvis i 50-100% metanol) vid Western blot och sedan blötläggs det i transferbuffert innan filtret används. 14. Förbered transfer: klipp till 2 st MM-papper och 1 PVDF filter per gel, ibland finns färdiga papper som följer med utrustningen. Blöt PVDF-filter i metanol, sedan i transferbuffert. Allt övrigt material blöts direkt i transferbuffert. Montera sandwichen ; svart plastsida, vit padd, MM-papper, gel, filter, MMpapper, stryk bort luft, vit padd, genomskinlig plastsida. Sätt ned sandwichen med den svarta sidan mot svarta sidan i transferdelen!!! Placera en magnetloppa + is i tanken och fyll upp med transferbuffert. 15. Kör transfer (1h): 100 V (vilket ger ca 0,2 A) och med magnetomrörare (hög omrörning). Skölj av den utrustning ni har använt med vatten. Var försiktig så att ni inte skadar elektroderna. 16. Montera ner transfern, lägg filtrena i Ponceau-röd (0,5 % Ponceau-S röd, 1 % ättiksyra). Färga filtrena några minuter, diska och plocka undan under tiden. Obs! Ponceau-röd återanvänds så häll tillbaka den i flaskan. Avfärga med Milli Q vatten tills lagom färgning erhålls. Lägg filtrena på MM-papper, låt dem lufttorka på bänken. Fota filtret med digitalkamera efter Ponceau-röd färgningen. Då filtret har torkat, viks ett kuvert av MM-papper som filtret förvaras i, förvara i kylskåp. Kom ihåg att märka kuvertet. För att förbereda inför immunodetektionen kan filtret märkas och delas redan nu. För att dela filtret används en skalpell. Märk med bläckpenna, diskret i ena hörnet. Bläcket kan ge kontamineringar. Immunodetektion 21/9 Utförande 1. Blanda 100 ml mjölkblocklösning (5% mjölkpulver, 0,2% Tween 20 (stock: 20%), späds i tvättlösning). 2. Skär ut det aktuella området på filtret med skalpell. Märk filtren med bläckpenna. Märk så lite som möjligt eftersom bläcket kan ses som artefakter vid detektionen. 3. Blötlägg filtren i metanol, tvätta sedan i MQ-vatten 2x5 minuter. 4. Spara blocklösning för antikroppsspädningarna. Blockera filtret på skak med blocklösning (40 min). 5. Späd primärantikroppen i mjölkblocklösning. Beräkna att det går åt 200 μl/lane som ska inkuberas, blanda inte mer antikropp än det ni beräknar att använda. Gör helst seriespädning. 6. Inkubera filtret med primärantikroppen i fuktkammare i 40 min. Så här görs en fuktkammare: plastlåda med lock, i botten läggs en bit MM-papper rejält fuktad med vatten, därpå läggs parafilm, sedan filtrena och antikroppen, avsluta med att lägga på locket. Det är viktigt att trycka bort ev. luftbubblor under servetten och parafilmen. Inkubera plant. 7. Tvätta med tvättlösning i små skålar/petriskålar (25 min, byt tvättlösning 2 gånger under den tiden). 8. Inkubera med färdigspädd sekundärantikropp (1/1000, Invitrogen) i fuktkammare (30 min). Beräkna att det går åt 200 μl/lane. 9. Tvätta som i punkt 6. 10. Tvätta filtrena med MQ-vatten i 3x2 minuter. 11. Blanda NBT/BCIP arbetslösning (NBT/BCIP Stock Solution (Roche) späd 1:50 i detektionslösning (0.1 M Tris-HCl, ph 9.5, 0.1 M NaCl), görs precis innan användning. Beräkna att det går åt 200 μl/lane. Inkubera filtret med NBT/BCIP arbetslösning tills lila band framträder på filtrerna, vänta max 60 min. 12. Vid lagom signal tvättas filterna med MQ-vatten i 3x2 minuter. Lufttorka och fotografera sedan filtrena. 13. Städa undan, summera era fynd och stäm av med läraren att ni har dragit rätt slutsats. 6