Neutropeni Uppdatering, utredning och handläggning

Neutropeni Uppdatering, utredning och handläggning VPH utbildningsdag 130212 Göran Carlsson Pediatrisk hematologi och onkologi Astrid Lindgrens barnsjukhus Karolinska Universitetssjukhuset hgp://www.blf.net/onko/page4/page29/files/ VpNEUTROPENI_GCAF_100802.pdf

Upplägg Vad gör neutrofilen - komplegering Up date forskning om Kostmanns sjukdom Utredning Fallbeskrivningar

Var (pus) Redan under an[ken insåg man betydelsen av pus för läkning av sår och infek[oner Man kallade det pus bonum et laudable, det goda och berömvärda puset Puset är därför en nobel substans: det består av modiga celler som inte smiter [llbaka [ll blodbanan utan de dör av sig uppdrag Puset står för infek[on men också ag kroppen kämpar väl Först på 1800 talet visste man ag puset bestod av leukocyter Dale et al 2008 The phagocytes: neutrophils and monocytes Blood

An[bakterialla pep[der Evolu[onärt konserva[vt finns i alla levande organismer Vik[g del i det medfödda immunförsvaret och för vår samlevnad med mikroorganismer Potens jämförbar med klassiska an[bio[ka Hos människan huvudsakligen i epitelceller, leukocyter speciellt neutrofiler Pro- LL- 37 (proform [ll ak[va pep[den LL- 37), kallas också cathelin- LL- 37 och hcap18 Pütsep et al. Deficiency of an[bacterial pep[des in pa[ents with morbus Kostmann: an observa[on study. Lancet 2002;360:1144-9

LL- 37 BreG an[bakteriellt spektrum Förvaras i sekundära (specifika) granula i neutrofilen LL- 37 verkar både i cellen och utsöndrat i blodbana och i vävnad Verkar bl.a. genom ag perforera bakteriens cellvägg Kan också bild nät som fångar mikroorganismer

B cell helper neutrofiler (N BH celler) N BH celler koloniserar marginalzonen (MZ) i mjälten [digt och s[mulerar IgM, IgG o IgA produk[onen hos MZ B- celler Pa[enter med kronisk neutropeni har färre MZ B- celler och kan då påverka an[kroppssvaret mot mikrobiella infek[oner Puga et al. B cell- helper neutrophils s[mulate the diversifica[on and produc[on of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nat Immunol. 2011;13:170-80.

Avsaknad av neutrofiler påverkar NK cellerna Möss som saknar neutrofiler utvecklar dåligt fungerande NK celler Neutrofiler behövs för normal utveckling av NK celler i både BM o i periferin Pa[enter med SCN och AIN har defekta NK celler, i antal, mognad och funk[on Jaeger et al. Neutrophil deple[on impairs natural killer cell matura[on, func[on, and homeostasis. J Exp Med. 2012;209:565-80

Kine[k 2 veckor Timmar Dagar Cartwright et al. The kinetics of granulopoiesis in normal man. Blood. 1964;24:780-803

The New England Journal of Medicine 2000;343:1. Delves & Roitt. Advances in Immunology: The Immune System.

Illustration: Tom DiCesare Whitehead Institute

Neutrofilens repertoar Fagocytos - fagosom Syreradikaler An[bakteriella ämnen Utsöndring av an[bakteriella ämnen Bildande av an[bakteriella fällor Kemotaxi B- cell helper neutrofils s[mulerar produk[on av immunoglobuliner i bl.a. mjälten Neutrofiler kontrollerar NK cells funk[on

Överkalix kommun, NorrboGen

1950 [ll1970 talet Rolf Kostmann LT 1950: Hereditär re[culos en ny systemsjukdom Avhandlingen 1956: Infan[le Gene[c Agranulocytosis Acta Paed Scand 1975: IGA - A Review with Presenta[on of Ten New Cases Totalt beskrev han 22 pa[enter från samma släkt Kostmanns sjukdom = SCN (svår kongenital neutropeni)

Klassisk - Mb Kostmann Severe Congenital Neutropenia, SCN Sällsynt: 1-2/1.000.000 popula[on ANC < 0.5x10 9 /L I benmärgen typisk mognadsstopp i myelopoesen på promyelocyt- myelocyt mivå Svåra bakteriella infek[oner [digt i livet Risk för MDS/leukemi

Myelopoes och mognadsstopp vid SCN Maturation stop Myeloblast Myelocyte Promyelocyte Metamyelocyte Band cells Segmented cells

1980 [ll 1990 talet Upptäckten av G- CSF 1983 G- CSF behandling 1987 (Sverige 1990)

Vår forskning Svensk forskning kring Kostmanns sjukdom har hap stor betydelse för vår förståelse av sjukdomen men även av mer allmänna patofysiologiska kunskaper Kort redogörelse för milstolpar i svensk och interna[onell forskning fram [ll idag

The original Kostmann family 2001 5 pa[ents. Carlsson G, Fasth A. Infan[le gene[c agranulocytosis, morbus Kostmann: presenta[on of six cases from the original Kostmann family and a review. Acta Paediatr 2001;90: 757-764) 5 new pa[ents born between 1976 and 1993 Now total of 27 pa[ents

Kostmann family

Carlsson G, Fasth A. Infan[le gene[c agranulocytosis, morbus Kostmann: presenta[on of six cases from the original Kostmann family and a review. Acta Paediatr 2001;90: 757-764. Table 1. Six children with Kostmann`syndrome diagnosed aper 1970. Clinical data and laboratory findings 1 1973 F 2 0.1 No 12 ND ND Chronic gingivitis 2 1976 F 0,5 0,3 Yes 24 Normal Normal Normal Severe periodontitis 3 1977 M 0.2 0.2 No 0.5 ND ND 4 1983 F 5 0,3 Yes 17 Normal Normal Osteoporosis Chronic gingivitis and mild MR 5 1984 M 2 0 Yes 16 Normal Normal Normal BMT, ADHD and epilepsy 6 1993 M 5 0,1 Yes 7 Normal Normal Normal Chronic gingivitis and delayed psychomotor development F: female; M: male;nd=not done MR=mental retardation ADHD=attention deficit hyperactivaty disorder Vi hade också noterat att patient 4 hade försenad pubertet

2000 talet Muta[on i ELA2 (numera ELANE) vid dominant och sporadisk SCN 2000 Pro- LL- 37 2002 Apoptos 2004 Upptäckten av HAX1 muta[onen vid recessive SCN 2007

SCN - ELANE Heterozygot muta[on dominant och sporadisk Stor klinisk varia[on cyklisk neutropeni [ll SCN Risk utveckla MDS/leukemi vid SCN UPR unfolded protein response Dale DC, Person RE, Bolyard AA, Aprikyan AG, Bos C, Bonilla MA, et al. Muta[ons in the gene encoding neutrophil elastase in congenital and cyclic neutropenia. Blood 2000:96:2317-22.

Pütsep K, Carlsson G, Boman HG, Andersson M. Deficiency of an[bacterial pep[des in pa[ents with morbus Kostmann: an observa[on study. Lancet 2002;360:1144-9

Carlsson G, Aprikyan AAG, Tehranchi R, Dale DC, Porwit A, Hellström- Lindberg E, Palmblad J, Henter J- I, Fadeel B. Kostmann syndrome: severe congenital neutropenia associated with defec[ve expression of Bcl- 2, cons[tu[ve mitochondrial release of cytochrome с, and excessive apoptosis of myeloid progenitor cells. Blood 2004;103:3355-61.

Death receptor Fas Caspase-8 ( initiator ) Bid Bcl-2 Cellular stress G-CSF Caspase-3 ( effector ) cyt c Bax Caspase-9 Apaf-1 Death

SCN HAX1 HAX1 (HS- 1- associerat protein X), eg mitokondrie- bundet protein med Bcl- 2 homologi, antas kontrollera apoptos Autosomal recessiv Risk utveckla MDS/leukemi Svenska och japansk muta[onen har neurologisk symtomatologi Klein C, Grudzien M, Appaswamy G, Germeshausen M, Sandrock I, Schäffer AA, Rathinam C, Boztug K, Schwinzer B, Rezaei N, Bohn G, Melin M, Carlsson G, Fadeel B, Dahl N, Palmblad J, Henter JI, Zeidler C, Grimbacher B, Welte K. HAX1 deficiency causes autosomal recessive severe congenital neutropenia (Kostmann disease). Nat Genet. 2007;39:86-92.

Hypotes hur HAX1 är involverad i apoptos

Carlsson G, Van't Hoop I, Melin M, Entesarian M, Laurencikas E, Nennesmo I, Trębińska A, Grzybowska E, Palmblad J, Dahl N, Nordenskjöld M, Fadeel B, Henter JI. Central nervous system involvement in severe congenital neutropenia: neurological and neuropsychological abnormali[es associated with specific HAX1 muta[ons. J Intern Med 2008;264:388-400 Nr Family Birth year Neurologic deficits Associated HAX1 ELA2 SCN Therapy Outcome /gender findings 1 Kostmann 1973/F Disabled after varicellae meningoencephalitis at 8 y None reported Q190X nd No G-CSF Died at 15 y (generalized septicemia) 2 Kostmann 1976/F None G-CSFR WT L121H* G-CSF prior to Alive, 30 y mutations HSCT at 28 y 3 Kostmann 1977/M None reported None reported Q190X nd No G-CSF Died at 6 mo 4 Kostmann 1983/F IQ <-2 SD below average for age Short stature, Q190X WT G-CSF Alive, 23 y delayed puberty, osteoporosis 5 Kostmann 1984/M IQ <-1 SD below average for age, ADHD, epilepsy at 14 y, treatment with valproat None reported Q190X WT HSCT at 7 mo, G-CSF Alive, 22 y 6 Kostmann 1993/M Cognitive disabilities, epilepsy at 11 y 7 Sporadic case 8 SCN patient with Kurdish origin 1988/F IQ around 1 SD below average for age, epilepsy at 11 y, treatment with valproat 1990/M Attention problems and aggression bursts. Acute lymphoblastic leukemia Short stature, delayed puberty, G- CSFR mutations Q190X WT G-CSF prior to HSCT at 12 y Died at 13 y, 10 mo post HSCT Q190X WT G-CSF Alive, 18 y None reported W44X WT G-CSF Alive, 17 y

Fig. 2. Alterna[ve splicing of the human HAX1 gene Carlsson et al, J Intern Med. 2008

Carlsson G, Winiarski J, Ljungman P, Ringdén O, MaGsson J, Nordenskjöld M, Touw I, Henter JI, Palmblad J, Fadeel B, Hägglund H. Hematopoie[c stem cell transplanta[on in severe congenital neutropenia. Pediatr Blood Cancer. 2011;56:444-51 Patient number Age at HSCT (year) Sex Age at diagnosis (mo) 1 28 F 0.5 2 12 M 5 3 14 M 3 4 2.8 F 12 Mutation ELANE (L121H) HAX1 (Q190X) 4 3.2 - - - - 5 7 M 1 week 6 19 F 12 7 18 M 18 Associated findings Indication of HSCT Donor Donor age (year) and sex Match Stem cell source CSF3R mutations Sibling 23/M ABDR id PBSC Neurological deficits ALL MUD 22/F ABDR id BM ELANE (H89del) MDS/AML MUD 36/F ABDR id PBSC wt for ELA2, HAX1, GFI1 and G-CSF CSF3R resistance Sibling 0/M ABDR id Cord ELANE (C151S) HAX1 (Q190X) HAX1 (W44X) Neurological deficits Retransplantation due to rejection Same sibling 0.7/M - - G-CSF resistance and MDS MUD 0/M B mismatch BM + MSC Cord CSF3R mutation MUD 22/F ABDR id BM The patient wishes Sibling 5/M ABDR id BM

Carlsson G, Winiarski J, Ljungman P, Ringdén O, MaGsson J, Nordenskjöld M, Touw I, Henter JI, Palmblad J, Fadeel B, Hägglund H. Hematopoie[c stem cell transplanta[on in severe congenital neutropenia. Pediatr Blood Cancer. 2011;56:444-51 Patient number Cell dose (CD34+ cells/106/kg) Conditioning regime ATG GVHD prophylaxis Engraftment ANC >0.5x109/L Day Platelets >50x109/L Day G-CSF post-sct Acute GVHD grade Chronic GVHD grade Rejection Donor lymphocyte infusion 1 19.1 Flu+Bu Camp Fk+Rapa Yes 22 14 No 0 0 0 56 2 4.48 Bu+Cy ATG CsA+MTX Yes 17 18 No II 0 0 Yes 3 26.8 Bu+Cy+Mel ATG LowCsA+MTX Yes 12 13 No I Yes 0 27 4 0.6 Flu+Treo ATG CsA+Pred Yes 54 26 Yes 0 0 Yes Yes 4 9.0 Flu+Cy ATG LowCsA+MTX Yes 25 1 No 0 0 Partial Yes 22 5 0.07 Bu+Cy+Mel ATG CsA+Pred No No No No IV 0 0 6 2.4 Flu-Treo ATG CsA+MTX Yes 20 25 Yes I 0 0 20 Follow up time (mo) Retranspl day 119 Outcome / Clinical status Well. Hyperthyreosis (radiojod and levothyroxin). Normal ANC. Died 10 mo post HSCT of unknown cause. Severe cgvhd. Normal ANC. Well. Recipient chimerism, subnormal ANC. Died day 70 of agvhd. Quite well. Nutrition and respiratory problems. Valproat. Normal ANC. 7 1.0 Flu-Treo ATG CsA+Rapa Yes 23 170 Yes II after DLI 0 0 Yes 16 Well. Normal ANC.

Carlsson G, Fasth A, Berglöf E, Lagerstedt- Robinson K, Nordenskjöld M, Palmblad J, Henter JI, Fadeel B. Incidence of severe congenital neutropenia in Sweden and risk of evolu[on to myelodysplas[c syndrome/leukaemia. Br J Haematol. 2012;158:363-9 1987-1996 Numbers Sex Female/M ale Age of diagnosis Months/Years MDS/L HSCT Dead ELANE 4 2/2 0-3 mo 1 1 HAX1 4 2/2 1-7 mo 1 3 1 Unknown mutajon 3 2/1 12 mo - 3½ y 0 SCN, total 11 1997-2006 ELANE 5 0/5 0 mo - 6 y 1 1 1 HAX1 0 Unknown mutajon 5 2/3 1 mo - 2½ y 1 1 1 SCN, totalt 10 Total, 1987-2006 21 8/13 4 6 3

Pa[ents characteris[cs Patient 1987-1996 Age year Diagnosis Sex Time of diagnosis Maturation arrest Mutation G-CSF microg/kg/ day MDS/L HSCT Comments 1 24 SCN F 3 mo Yes ELANE 5,5 2 23 SCN F 13 mo Yes HAX1 3 Yes HSCT due to CSX3R mutation 3 22 SCN M Newborn Yes ELANE 8 4 21 SCN M 18 mo Yes HAX1 5 Yes HSCT due to patients own wish 5 20 Probable SCN M 12 mo Yes Neg ELANE, HAX1, G6PC3 3.8 6 19 SCN M 3 mo Yes ELANE 15 Yes Yes Severe GVHD 7 18 SCN M 5 mo Yes HAX1 6 Yes Yes Dead after HSCT 8 18 SCN M 3 mo Yes chax1 Sporadic 9 17 SCN F Newborn Yes ELANE 7.5 Mother ELANE mutation 10 16 Probable SCN F 3½ y Yes Neg ELANE, HAX1 13 11 15 Probable SCN F 3½ y No Not analyzed 1.2 1997-2006 12 13 Probable SCN M 1 mo Yes Not analyzed 60 Yes Died at 21 mo of age in malign histiocytosis/leukemia. Father and grandfather have agranulocytosis. 13 13 SCN M 4 mo Yes delane 12 14 13 SCN M Newborn Yes ELANE 5.3 Mother ELANE mutation 15 11 Probable SCN M 15 mo Yes Neg ELANE, HAX1, G6PC3 7 16 11 SCN M 2 mo Yes ELANE 50 Yes Yes Dead after HSCT 17 10 SCN M 5 mo Yes ELANE 4-5 18 9 Probable SCN F 1½ y Yes Neg ELANE, HAX1, G6PC3 3.2 19 8 SCN M 6 y No ELANE Sporadic Mother ELANE mutation 20 7 Probable SCN F 13 mo Yes Neg ELANE, HAX1, Gfi1, G6PC3 80 Yes HSCT due to GCS-F resistance 21 5 Probable SCN M 2½ y Yes Neg ELANE, HAX1 30

Distribu[on of the muta[ons 1987-2006 % ELANE 9 43 HAX1 4 19 Unknown mutation 8 38 21 100 Carlsson et al Incidence of severe congenital neutropenia in Sweden and risk of evolution to myelodysplastic syndrome/leukaemia. Br J Haematol. 2012;158:363-9

Figure 1b Cumulative incidence of MDS/leukaemia in 18 patients with SCN and regular G-CSF treatment, related to years of G-CSF treatment. Carlsson et al. Incidence of SCN

Incidens 1.0 SCN per 100 000 nyfödda i Sverige Cirka 1 barn föds med SCN per år i Sverige 4 utvecklade MDS/Leukemia (2 ELANE, 1 HAX1 och 1 okänd muta[on) 19 % 3 döda (alla med malignitet) 14 % Karl Welte har uppskagat en incidens i Tyskland på 1 SCN per 240 000 nyfödda = 0.4 per 100 000 nyfödda Jean Donadieu Frankrike har rapporterat en incidens i Frankrike på 8 fall per 1 million nyfödda, vilket ger en incidens på 0.8 per 100 000 nyfödda

37

Plasma pro- LL- 37 in chronic neutropenia, analyzed by immunoblot SCN: 34 samples analyzed, 20 patients IN: 30 patients AIN: 27 patients % pro- LL- 37 = % of referens plasma

Analysis of plasma pro- LL- 37 by ELISA Pro-LL-37 ng/ml Diagnos n Min Max Medi SCN 24 121 283 208 IN 17 303 1147 580 AIN 12 440 1949 714 HSCT 3 446 694 486 The ELISA standard was recombinant pro- LL- 37. In collabora[on with Niels Borregaard, Copenhagen. Kontroller 8 559 1053 687 n = number of samples analyzed Katrin Pütsep april 10, 2013 39

Pro- LL- 37 in plasma originates from the bone marrow neutrophil precursors Time course of plasma pro-ll-37 and ANC during allogenic BMT V Sørensen O, Cowland JB, Askaa J, Borregaard N. J Immunol Methods. 1997 ;206(1-2):53-9. april 10, 2013 Katrin Pütsep 40

Cyclic neutropenia Recieves G-CSF treatment occasionally: Arrow denotes G-CSF administration No G-CSF treatment Karlsson J, et al Br J Haematol. 2007 april 10, 2013 Katrin Pütsep 41

Sammanfattning pro-ll-37 Pro- LL- 37 i plasma är en indikator för myelopoesen Sjukdomar som påverkar myelopesen kan också påverka nivån av pro- LL- 37 Plasma pro- LL- 37 kan vara eg hjälpmedel i differen[al diagnos[ken av kronisk neutropeni Western blot är för komplicerad för kliniskt bruk. Vi jobbar för en ELISA för pro- LL- 37 Katrin Pütsep april 10, 2013 42

UTREDNING AV KRONISK NEUTROPENI VPH Stockholm 12-02- 2012 Göran Carlsson Goran.carlsson@ki.se hgp://www.blf.net/onko/page4/page29/files/ VpNEUTROPENI_GCAF_100802.pdf

Defini[oner Kronisk neutropeni > 3-6 månaders dura[on. LäG neutropeni ANC 1,0-1,5x10 9 /l. MåGlig neutropeni ANC 0,5-1,0x10 9 /l. Svår neutropeni ANC <0,5x10 9 /l. OBS! Personer med afrikanskt ursprung har normalt 0,2-0,6 lägre ANC.

Gene[ska orsaker [ll medfödd neutropeni - differen[aldiagnoser Medfödd neutropeni utan andra särdrag Muta[on i ELANE (SCN med ELANE muta[on) Muta[on i HAX1 (SCN med HAX1 muta[on eller Kostmanns sjukdom) Muta[on i WAS Muta[on i GFI1 Medfödd neutropeni med särdrag Glycogenosis typ 1b (SLC37A4) 6PC3 brist (G3PC3) Chédiak Higashi Syndrom (LYST) Griscelli Syndrome, typ 2 (RAB27A) Hermansky Pudlak Syndrom, typ 2 (AP3B1) p14 brist (MAPBPIP) Shwachmann Diamond syndrom (SBDS) Cohen syndrom (COH1) Barth syndrom (TAZ) Car[lage hair hypoplasia (RMPR) WHIM syndrom (CXCR4)

Immunologiska/inflammatoriska orsaker [ll neutropeni Autoimmun neutropeni Neonatal alloimmun Neonatal maternell autoimmun Primär immunbrist

Andra orsaker [ll neutropeni Virus (parvo, hepa[t, EBV, HIV) Bakt (salmonella, mykobakt, sepsis) Läkemedel (cyt, pc, TS, NSAID) Nutri[onellt (brist på B12, folsyra; anorexi) Strålning/kemikalier (bensen) Malignitet, aplas[sk anemi Osteopetros, hypersplenism

Utredning Neutropeni upptäcks opa i samband med infek[onsepisod Hur ska vi tänka? Vad gör vi? Vilka ska vi utreda? Hur ska vi utreda? Akut? Kronisk? Benign? Svår? Expektans? Snabbutreda? Uteslut malign sjukdom!

Utreda? ANC < 1,0x10 9 /l Anamnes Ärplighet (neutropeni, mycket bakteriella infek[oner)? Konsangvinitet? Andra s[gmata? Tid [ll naveln släpper? Tidigare infek[onsanamnes (hud, slemhinnor), debutålder Läkemedel? Status Hud- och slemhinneinfek[oner? Tecken på gamla infek[oner? Hudförändringar? Failure to thrive? Splenomegali? SkeleGanomali? Om allt neg (inkl. övriga hematopoeser u.a.), aktuell infek[on troligen viros och frisk pat - nyg blodstatus med diff om 3-4 veckor (vid viroser kan neutropenin vara 3-8 dagar)

Anamnes Neutropeni och Cyklicitet i symtom och ANC Cyklisk neutropeni Neurologiska symtom HAX1 muta[on Cohen syndrom (mikrocefali) Par[ell albinism Chediak- Higashis syndrom Griscelli syndrom typ 2 Hermansky- Pudlak syndrom typ 2 p14 muta[on Pankreasinsufficiens Shwachman- Diamonds syndrom Pearsons syndrom Kardiomyopa[, muskelsvaghet Barth syndrom Hypoglykemi, laktacidos Glykogen inlagringssjukdom typ 1b

Akut sjukdom med neutropeni Mild sjukdom, misstänkt virus, upprepa blodstatus med neutrofila om 3-4 veckor. Mer svår sjukdom med feber och allmänpåverkad pa[ent: adekvat infek[onsprovtagning och ställningstagande [ll an[bio[ka. Om ANC <0,5 x10 9 /l behandling som vid febril neutropeni. Pancytopeni och/eller splenomegali misstänk malignitet eller hypersplenism. Läkemedel som kan ge cytopeni? Avbryt behandling. Anamnes på bölder, andra bakteriella infek[oner, slemhinneinfek[oner och failure to thrive misstänk kronisk neutropeni.

Kronisk neutropeni med måglig [ll läg neutropeni Ställningstagande [ll utredning om andra poeser är påverkade eller ag andra symtom/tecken ger misstanke om syndrom (se nedan om differen[aldiagnoser). Om läg neutropeni utan andra symtom avvakta ygerligare utredning och följ sjukdomsförloppet. Tänk på etnisk neutropeni. Om misstänkt cyklicitet i sjukdomsanamnesen, misstänk cyklisk neutropeni (se vidare nedan) Om påverkan på andra poeser ställningstagande [ll benmärgsundersökning (Leukemi? MDS? AA?)

Kronisk neutropeni med upprepade ANC <0,5 x10 9 /l Opåverkad pa[ent. Misstänk autoimmun neutropeni (AIN) eller benign neutropeni. Kontrollera neutrofilspecifika an[kroppar. Bestämning av an[bakteriella pep[den pro- LL- 37 kan differen[era mellan benign och svår neutropeni. Om an[kroppar påvisas och normal nivå på pro- LL- 37 kan man avstå från BM undersökning. Malnutri[on/anorexi kan ge neutropeni direkt eller via brist på folsyra eller B12. Vid pankreasinsufficiens misstänk Shwachman- Diamond eller Pearson s syndrom. Om cyklicitet i ANC och symtom (sjukdomskänsla, feber, blåsor munnen) misstänk cyklisk neutropeni (CyN). Provtagning: Blodstatus med neutrofila 3 ggr per vecka i 6 veckor. EG alterna[v är ag göra muta[onsanalys på ELANE ([digare benämnd ELA2) genen. Över 90% av pa[enter med CyN har muta[on i ELANE genen. Pa[ent med infek[onsanamnes: Benmärgsundersökning inklusive kromosomanalys. Vid stark klinisk misstanke på svår kongenital neutropeni (SCN) eller annat gene[skt känt syndrom kan muta[onsanalys göras (se nedan).

Förslag på prover Leukocyter med diff (neutropeni och monocytos) Neutrofilspecifika an[kroppar. Se provtagningsanvisningar. Pro- LL- 37. Forskningsprov på MTC, KI, Färskfrusen plasma från EDTA blod (ca 4 ml). Se provtagningsanvisningar. Elfores med immunglobulinnivåer (utesluta ev. hypogammaglobulinemi, SCN går opa med höga IgG nivåer). Blodstatus med diff x 3 / vecka i 6 veckor för ag utesluta CyN. Benmärgsundersökning. Morfologi (biopsi), flöde och cytogene[k. Muta[onsanalys av ELANE och HAX1. Görs på Klinisk gene[k Karolinska Solna. Vid misstanke på specifik sjukdom utvidgad gene[sk analys (fråga på gene[skt laboratorium)

Provtagningsföreskriper Neutrofilspecifika anjkroppar. Leukocytagglu[na[ons test Neutrofil- immunoflourescens Monoklonal an[kroppsspecifik immunitet (MAIGA). 10 ml EDTA blod, på mindre barn klarar man sig på 3-4 ml. Provet förvaras i rumstemperatur och skickas så ag det är på laboratoriet senast dagen eper provtagningen. Skickas [ll Trombocyt och leukocyt laboratoriet (TRoLL), Transfusionsmedicin C2-58, Karolinska Universitetssjukhuset Huddinge, 141 86 Stockholm.

Provtagningsföreskriper, forts Pro- LL- 37 An[bakteriell pep[d som är mycket låg i plasma vid SCN. Det är for arande eg forskningsprov. För analysen behövs färskfrusen plasma. Plasma tas eper ag 3-4 ml EDTA blod centrifugerats i 250G (om möjligt) i 10 minuter i rumstemperatur. Plasman fryses och förvaras i frys [lls provet skickas [ll MTC, Stockholm. Skickas reguljärt vid [llfälle i MYCKET kolsyreis. Ring innan proverna skickas: Tel: 08-5248 7113 (Katrin) el 08-5248 6221 (lab). Kolla gärna blodstatus med diff vid samma [llfälle. Skickas [ll Adress: Katrin Pütsep, Mikrobiell patogenes, Hus M1, Gustaf V:s forskningsins[tut, plan2, Karolinska universitetssjukhusetsjukhuset Solna, SE 171 76 Stockholm

Provtagningsföreskriper, forts Benmärg: Morfologi. Gärna biopsi. Hämmad myelopeos? Mognadshämning av myelopoes ses vid SCN (promyelocyt- myelocytnivå) Vid neutropenifasen vid CyN Vid AIN med ak mot myeloida förstadier Reak[v märg? MDS/L? Myelokathexis (WHIM?) Flöde: Patologisk klon? Kromosomanalys av benmärgsceller: Abbera[oner? - 7, +21? Transloka[oner?

Provtagningsföreskriper, forts GeneJsk analys vid SCN: ELANE- neutropeni. Autosomal dominant ärplighet. Sekvensanalys av exon 1-5. Muta[on upptäckt i 90-100% av pa[enter med CyN och i 38-80% av pa[enter med SCN. Det behövs 5-10 ml EDTA- blod eller isolerat genomiskt DNA. Prover transporteras i rumstemperatur. Om blod sändes använd snabb transport som t.ex. Jet pak. HAX1- neutropeni. Autosomal recessiv ärplighet. Kostmanns sjukdom. Ca 12% av SCN i Europa. Sekvensanalys av exon 1-7. Det behövs 5-10 ml EDTA- blod eller isolerat genomiskt DNA. Prover transporteras i rumstemperatur. Om blod sändes använd snabb transport som t.ex. Jet pak.

Provtagningsföreskriper, Gene[sk analys vid SCN, forts CSF3R (G- CSFR) genanalys (förvärvad soma[sk muta[on). Muta[oner i genen kan uppstå under behandling med G- CSF och är associerat med ökad risk för MDS/L. DNA sekvensning görs av kri[ska delar av genen. Bör analyseras vid de årliga benmärsundersökningar som görs vid SCN pga. risken för MDS/AML. Analys görs på DNA från mononukleära celler från benmärgen. Det behövs 3-5 ml benmärg i EDTA rör. Kan skickas reguljärt. Analys av ELANE, HAX1 och CSF3R görs på Klinisk Gene[k Karolinska. Proverna skickas [ll: Klinisk gene[k, L4:02, Karolinska Universitetssjukhuset Solna, 171 76 Stockholm. Telefon 08-517 70444. e- mail: helena.malmgren@ki.se eller kris[na.lagerstedt@ki.se. För analys av andra sjukdomsframkallande gener vid neutropeni kontakta Gen lab för diskussion. Sekvensning kan opa göras på annat lab i världen.

Differen[aldiagnoser och kort beskrivning av några av de sjukdomar som går med kronisk neutropeni. Autoimmun neutropeni (AIN). Vanligaste kroniska neutropenin hos barn. Upptäcks opa under 1:a levnadsåret. Diagnos neutrofilspecifika an[kroppar (opa falskt nega[va, upprepa provtagning). Dura[on medel 20 mån, 95% utläkt vid 4 års ålder. Spontan remission. Benignt förlopp, opa ej nödvändigt med G- CSF. Förekomst 1 per 100000 levande födda. Benign neutropeni i barnaåren: Friskt barn trots låga ANC. Troligen AIN utan ag an[kroppar påvisats.

Neonatal alloimmun neutropeni Orsakas av maternella allo-ak mot paternell HNA Patogenes = Rh immunisering, modern producerar IgG ak som passerar över till fostret, kan ske vid första graviditeten De vanligaste är HNA-1a, HNA-1b, and HNA-2 men även mot HNA-1c, HNA-3a, HNA-4a, and HNA-5a Incidensen är skattad till 1 på 1000 levande födda ANC oftast < 0,5 Omfalit och hudinfektioner vanligast, svåra infektioner ovanliga Normaliseras inom 3-28 veckor Diagnos[k neutrofilspecifika an[kroppar Behandling an[bio[ka o ev G- CSF

Differen[aldiagnoser, forts Cyklisk neutropeni: Cykler ca 21 dagar, dura[on 3-6 dagar, ANC ner [ll 0,1, däremellan normal eller subnormal ANC. Muta[on av ELANE genen i över 90%. Ärvs autosomalt dominant. Utvecklar ej MDS/L. Förekomst 0,5-1/miljon innevånare. Kronisk idiopajsk neutropeni. Neutropenier som inte är kongenitala, immunologiska eller neoplas[ska. Heterogen grupp med okänd e[ologi, orsak kan vara sek [ll infek[on, läkemedel el toxin. Varierande benmärgsbild. Klinik varierar, följer opa ANC- talen. Pro- LL- 37 normal nivå. Utvecklar ej MDS/L. 2-4/miljon innevånare

Differen[aldiagnoser, forts Gene[skt kända orsaker [ll kronisk neutropeni Medfödd neutropeni utan andra särdrag (SCN). (1-2/miljon innevånare.) CN med ELANE mutajon. Autosomal dominant. Risk för MDS/L. 57% av SCN i europeiskt material. CN med HAX1 mutajon eller Kostmanns sjukdom. Autosomal recessiv. Risk för MDS/L. Vissa muta[oner har neurologiska symtom. 12% av SCN i europeiskt material. CN med mutajon i WAS. X- bunden recessiv. Ak[verad muta[on. Opa isolerad neutropeni med monocytopeni. Normala [ll subnormala trombocytantal. Fåtal fall beskrivna. CN med mutajon i GFI1. Autosomal dominant. Transkrip[onsfaktor. Låga B- och T- cellsnivåer. Fåtal fall beskrivna.

Differen[aldiagnoser, forts Gene[skt kända orsaker [ll kronisk neutropeni Medfödd neutropeni med särdrag Glycogenosis typ 1b. Muta[on i SLC37A4. Autosomal recessiv muta[on. Karakteriseras av hypoglykemi, laktacidos, hepatomegali och [llväxthämning. 6PC3 brist. Glukos- 6- fostatasbrist, subenhet 3. Muta[on i G3PC3. Autosomal recessiv muta[on. Associerat med strukturella hjärtavvikelser, prominent ytlig venteckning och urogenital missbildningar. Chédiak Higashi syndrom. Muta[on i LYST. Autosmal recessiv muta[on. Par[ell albinism, defekt NK- cellsfunk[on, blödningsproblem och neurologiska symtom. Risk utveckla hemofagocytos.

Differen[aldiagnoser, forts. Medfödd neutropeni med särdrag, forts Griscelli syndrome, typ 2. Muta[on i RAB27A. Autosmal recessiv muta[on. Associerat med par[ell albinism, (intermigent) neutropenia och defekt funk[on av cytotoxiska lymfocyter. Risk utveckla hemofagocytos. Hermansky Pudlak syndrom, typ 2. Muta[on i AP3B1. Autosmal recessiv muta[on. Förutom neutropeni också neutrofildysfunk[on. Associerat med par[ell albinism och förlängd blödnings[d pga. trombocytdysfunk[on. p14 brist. Muta[on i MAPBPIP. Recessiv muta[on. Associerat med kortvuxenhet, hypogammaglobulinemi och defekt funk[on av cytotoxiska lymfocyter.

Differen[aldiagnoser, forts Medfödd neutropeni med särdrag, forts Shwachmann Diamond syndrom. Muta[on i SBDS. Autosomal recessiv muta[on. Karakteriseras av pankreasinsufficiens, [llväxthämning, skeleg anomali och benmärgssvikt. Risk för MDS/L. Cohen syndrom. Muta[on i COH1. Autosmal recessiv muta[on. Karakteriseras av mikrocefali, muskel hypotoni, utvecklingsförsening och opa typiskt utseende. Barth syndrom. Muta[on i TAZ. X- bunden recessiv. Brist på kardiolipin. Karakteriseras av dilaterad kardiomyopa[, muskel hypotoni och karni[nbrist.

Differen[aldiagnoser, forts. Medfödd neutropeni med särdrag, forts CarJlage hair hypoplasia. Muta[on i RPMR. Autosomal recessiv muta[on. Karakteriseras av kortvuxenhet pga. kondrodysplasi, tunt krusigt hår, lymfopeni med T- cells dysfunk[on och anemi. WHIM syndrom. Muta[on i CXCR4. Autosomal dominant muta[on. Karakteriseras av vårtor (HPV), hypogammaglobulinemi, infek[oner och myelokatexi. Pearson s syndrom. Muta[on i mitokondrie DNA. Karakteriseras av pankreasinsufficiens, anemi och trombocytopeni.

RekommendaJon Jll klinisk årskontroll av benmärg vid SCN pga. risk för MDS/L: Perifert blod Blodstatus med diff Benmärg Morfologi: Aspira[on och benmärgsbiopsi [ll lokalt Hematoaptologiskt laboratorium för benmärgsmorfologi och flödescytometri.. Tecken på MDS eller leukemiutveckling? Kromosomanalys (cytogene[k) [ll lokalt Gene[skt laboratorium. Kromosomanalys på mononukleära celler från benmärgen. Cytogene[ska aberra[oner? Monosomi 7? Trisomi 21? Transloka[oner? MutaJonsanalys av G- CSF receptorn [ll Klin gen avd, DNA- Sek[onen, L5:03, Karolinska Universitetssjukhuset Solna, 171 76 Stockholm. Ange på remissen Kostmanns sjukdom och G- CSFR analys. Frågor: tel 08-51772468 eller Helena Malmgren, 08-51770444, helena.malmgren@karolinska.se. För enbart G- CSFR analys går det bra med enbart benmärg i EDTA rör. Kan skickas reguljärt.

Behandling av SCN Rekombinant granulocytkolonis[mulerande faktor (G- CSF) (filgras[m eller lenogras[m): Startdos 5 μ/kg/d. Dosen ökas med 5 10 μ/kg/d var 14:e dag [lls effekt på absolut neutrofilantal (ANC) ses; målet är ANC på 1,0 1,5 109/l och kontroll på infek[onerna. Hematopoie[sk stamcellstransplanta[on är enda botande behandling. Indicerat vid utveckling av myelodysplas[skt syndrom/akut leukemi eller resistens för behandling med G- CSF.

Severe Chronic Neutropenia Interna[onal Registry (SCNIR) The objectives of the SCNIR have changed considerably since initiation of the registry in 1994. Whereas the Registry focused on the long-term safety of G-CSF therapy in the beginning, the observation and follow-up of serious late sequelae became more and more important. With the detection of different underlying genetic defects in the past few years the current objectives of the SCNIR are: 1. Documentation of the clinical course of SCN and monitor clinically significant changes 2. Correlation of genotype with phenotype and evaluate subtype specific prognosis 3. Evaluation of the natural course and response to treatment by hematological parameters 4. Evaluation of the outcome of pregnancies 5. Study the incidence and/or outcome of the following previously identified adverse events and search for risk factors: a. osteoporosis b. acquired cytogenetic abnormalities c. myelodysplastic syndrome and leukemia 6. Follow-up on former SCN patients after bone marrow transplant 7. Establishment and maintenance a cell bank for the SCNIR for future SCN related research 8. Providing of comprehensive information to educate physicians and patients 9. Promotion of research www.scner.de

Tack! Kostmanngruppen Bengt Fadeel, KI och Karolinska universitetssjukhuset Bengt Fadeel, professor toxikologi/apoptos Magnus Nordenskjöld, professor gene[k Jan- Inge Henter, professor barnonkologi Mikael Sundin, barnläkare, blivande barnhematolog Huddinge Anna Lindblom, Marie Meeths, ST läkare pediatrik Jan Palmblad/Daniel Tesfa, vuxenhematologer Huddinge Uppgii sjukdomsmekanismer, bakomliggande muta[oner Kostmanngruppen Katrin Pütsep Katrin Pütsep, docent MTC Mikael Sundin, barnläkare, blivande barnhematolog Huddinge Anna Lindblom ST läkare pediatrik, blivande barnonkolog Uppgii: Utreda patogenesen kring bristen på pro- LL- 37 vid SCN och dess användbarhet i kliniken