VISK Hur går vi tillväga för att analysera virus från vattenprover? Oslo Slutkonferens VISK 19 mars 2013 Fredrik Nyström
Agenda Problematiken kring virusanalyser i råvatten Analysmetodik för virus i: Råvatten Avloppsvatten Erfarenheter och möjligt vidare arbete
Analysering av virus i råvattenprover Problem: Direktanalys ej möjlig Normalhalten av virus i råvatten långt under känslighetsnivån i de molekylära analyserna. Någon form av anrikning behövs
Anrikning av virus från råvattenprov Stor volym Låg koncentration Liten volym Hög koncentration
Filtrering av råvattenprov
Norovirus transportegenskaper Vi utnyttjar norovirus transportegenskaper Dess isoelektriska punkt Aggregationsdynamik Vidhäftningsförmåga vid olika jonstyrkor Da Silva et al., 2011. Environmental Science & Technology. Adsorption and aggregation properties of norovirus GI and GII virus-like particles demonstrate differing responses to solution chemistry.
Filtreringsmetoden i VISK för Dead-end filtrering råvattenprover Enkel adsorption / eluering Tre-stegs isoleringsmetod med två olika filter samt en mikrokoncentrator
Flödesschema 4.5 l MNV-1 P U M P F I L T E R 2 u m Positive control Source water F I L T E R 0. 4 5 u m MgCl 2 Microconcentration 50,000 kda Flocculation 200 ul Molecular analysis
Flödesschema 4.5 l MNV-1 P U M P F I L T E R 2 u m Positive control Source water F I L T E R 0. 4 5 u m MgCl 2 Microconcentration 50,000 kda Flocculation Recovery: 0.01 15 % 200 ul Molecular analysis
Analysöversikt av råvattenprover
Virusanalys av avloppsvatten Lättare att arbeta med Högre viruskoncentrationer Enklare upparbetningsmetodik 100 gångers anrikning
PEG-fällning av avlopssvatten System Biosciences http://www.systembio.com/
PCR METODIK http://www.gmotesting.com
Erfarenheter av metoden Bra effektivitet under utvärdering Ojämn effektivitet under provtagning Känslig för heterogeniteten hos proverna Indikationer på relativt höga koncentrationer, men metodiken ej känslig nog för noggrann kvantifiering Vidare metodikutveckling Byte av metodik Öka provolymerna (ex. ultrafiltrering)
Tack för uppmärksamheten Frågor? Stort tack till personal vid vattenverk samt avloppsreningsverk som hjälpt i studien. Tack till kollegor inom VISK-projektet.
Ultrafiltrering för detektion av mikroorganismer i vatten Ronnie Eriksson Livsmedelsverket
Metodkrav Användningsområden Kartläggningar Utbrottsutredningar Beredskap mot antagonistiska händelser Detektera virus, bakterier och parasiter från samma prov Typer av vatten och önskade volymer Dricksvatten, DR, (~200 L) Ytvatten, YV, (~40-50 L) Grundvatten (~100)
Hollow Fiber Ultrafilter Filtrerat vatten Hollow fiber Filtrerat vatten Mikroorganismer Stora molekyler Vattenprov in Filter Cut Off Filter area Filtrering Vattenprov in Rexeed-25SX 30kD 2,5 m 2 1,4 L/min
Dead End Filtrering Labb I fält Direkt från kranen
Olika vatten olika resultat Badsjö 20 L Almunge vattenverk 40 L Görvelns vattenverk 40 L Dricksvatten Sjövatten Eluat Ytråvatten Eluat Eluat
Dead end Filtrering 200 L Dricksvatten / 40 L Ytvatten -> 500 ml Sekundär koncentrering DV 500 ml / YV 140-300 ml -> 2mL Upprening 2 ml -> 2mL Nukleinsyraextraktion 0,4-2 ml -> 50-100 µl Inhibitionsbortagning Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 Millipore Centricon-70 Polyetylenglykol (PEG) Kloroform:Butanol Ingen Biomeriux NucliSens MiniMAG Qiagen EZ1 Biorobot MN NucleoSpin Virus Zymo PCR Inhibitor removal Qiagen RNA Cleanup Kit Ingen Realtids RT-PCR Qiagen QuantiTect Virus Invitrogen UltraSens Tataa Grandmaster Quanta Toughmix BSA T4 gene 32 protein Ingen
Dead end Filtrering med Back flush eluering 200 L Dricksvatten / 40 L Ytvatten -> 500 ml Sekundär koncentrering DV Centricon-70, 500 ml -> 2 ml YV PEG, 150-300 ml -> 2 ml Upprening Kloroform:Butanol, 2 ml -> 2 ml Nukleinsyraextraktion NucliSens MiniMAG, 2 ml -> 100 µl Centrifugering ger pellet med bakterier och parasiter. Får även bort fast material. Realtids one-step RT-PCR Quanta Toughmix, 5 µl = 10 L DV / 0,6-1,2 L YV
Resultat Utbyte från 40 L ytråvatten MNV FCV MS2 Utbyte (%) 18 12 89/44 Sensitivitet 200 L dricksvatten Nv. GGI Nv. GGII FCV Plasm. Ekv/L 100 <150 <100 U MNV: Murint Norovirus FCV: Felint Calicivirus Noro. GGI: Norovirus Genogrupp I Noro. GGII: Norovirus Genogrupp II MS2: Bakteriofag MS2 VTEC Campylobakter Cryptosp. Giardia Utbyte (%) 80 60 50 60
Slutsatser - Filtrerar stora volymer ytvatten (40 L) och dricksvatten (200 L) med UF - Högt utbyte över UF (~90% MS2) - Detekterar virus, bakterier och parasiter från samma prov Problem Fortfarande inhibition i PCR som ökar med volymen Volymen vi faktiskt analyserar Hela eluatvolymen från UF utnyttjas inte till sek. konc.
Vi som arbetar med Ultrafiltrering Ronnie Eriksson Magnus Simonsson Karin Jacobsson Sofia Persson