Realtids-PCR icycler BioRad, mikrotiterplattor LightCycler Roche, kapillärer ABI Prism 7000 Applied Biosystem mikrotiterplattor Molekylärbiologisk metodik T3 ht 2011 Märit Karls
Kunskapsmål för detta avsnitt Du skall kunna diskutera fördelar med realtids- PCR jämfört med traditionell PCR Du skall kunna diskutera för-och nackdelar med att detektera med SYBR Green respektive probe Du skall kunna redogöra översiktligt hur man kvantifierar med realtids-pcr Du skall kunna redogöra för hur man gör en smältkurva, samt förstå vilken information man kan få av en sådan analys
Realtids-PCR Mha fluorescerande molekyler kan man detektera PCR-produkt varje cykel Tillämpningar Kvantitativ analys (Q-PCR) Mycket vanligt! Ex. RT-PCR (Reversed Transkriptas-PCR): jmf mrna i olika celler OBS! RT-PCR betyder INTE realtids-pcr! Multiplex PCR (specifika prober detekterar flera olika PCR-produkter) Detektion av mutationer, SNPs med två hybridiseringsprober och smältkurvsanalys
Brister med traditionell PCR Separata steg för amplifiering och detektion; risk för kontaminering Långsam, svår att automatisera Mäter vid slutpunkt, när amplifieringskurvan kan ha planat ut; osäker kvantifiering Svårt att jämföra effektivitet vid olika PCR-reaktioner, osäker kvantif.
Jmf End point/real time http://www.lightcycler-online.com/ lc_principles/lc_principles_ind.htm Konventionell PCR Detekterar PCRprodukt vid slutpunkt Realtidsmätning Bildad produkt detekteras med fluorimeter Mäter bildad PCR-prod varje cykel
AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA 0 1 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128 8 256 9 512 10 1,024 11 2,048 12 4,096 13 8,192 14 16,384 15 32,768 16 65,536 17 131,072 18 262,144 19 524,288 20 1,048,576 21 2,097,152 22 4,194,304 23 8,388,608 24 16,777,216 25 33,554,432 26 67,108,864 27 134,217,728 28 268,435,456 29 536,870,912 30 1,073,741,824 31 1,400,000,000 32 1,500,000,000 33 1,550,000,000 34 1,580,000,000 Exponentiell amplifiering 1600000000 1400000000 1200000000 1000000000 800000000 600000000 400000000 200000000 0 10000000000 1000000000 100000000 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1 0 5 10 15 20 25 30 35 PCR CYCLE NUMBER 0 5 10 15 20 25 30 35 PCR CYCLE NUMBER 6
Ampliferingskurva Bakgrundsfas Log-fas Mättnadsfas Signalen mäter bildad produkt, är ett mått på mängden DNA från start Bakgrundsfas: trots fördubbling av DNA varje cykel är signalen knappt högre än bakgrundsbrus (från BioRad) När får man det säkraste värdet??? Logfas: exponentiell fas Mättnadsfas: Varför planar signalen ut?
Vilket prov innehåller mest DNA? Snabbare/långsammare Ju mer templat-dna i provet, desto ökar signalen
C T = Cykel vid tröskelvärde Bakgrundsfas Log-fas Mättnadsfas (från BioRad) Vad är C T -värdet i denna reaktion? Exponentiell fas. Varje cykel: 2x DNA. Vid ett visst antal cykler har signalen nått över bakgrunden. Lägger en tröskel där signalen är pålitlig C T = den cykel när signalen passerar tröskeln Cp Crossing point Cq quantif. cycle
Realtidsmätning ger säkrare kvantifiering 96 replikat av identisk reaktion Slutlig mängd varierar Tröskelvärde (C T ) varierar inte (Fig från BioRad) Var detekterar man i traditionell PCR?
Säkraste signalen när den ligger klart över bakgrundsbrus, men fortfarande i logfasen Vits med att mäta signalen varje cykel: ser vid vilken cykel man har en pålitlig signal, får ett pålitligt resultat 11
Hur mäts signalen? Varifrån kommer signalen på y-axeln? Hur mäter man bildad PCR-produkt?
Detektion: Fluorescerande molekyler som binder till amplifikat Icke-specifika SYBR Green 1 Specifika, prober som binder till specifik sekvens på mål-dna TaqMan Molecular beacon se fig. 9.18 i Brown Scorpions/Amplifluor Dual-hybridization probes/oligo FRET pairs (mutationsanalys)
Detektion; SYBR Green 1 Denaturering: minimal fluorescens Syntes av ny sträng: SYBR green binder till ds DNA; fluorescerar Efter varje cykel mäts fluorescens Kombineras med smältkurvsanalys för detektion av ev. ospec. produkt
Standardkurva Ct = f(konc) Range: 10-10 10 kopior av målområdet i templatet Ct bör vara 10-30 Absolut kvantifiering Spädningsserie av standard med känd koncentration ger amplifieringskurvor Bestäm Ct-värden
threshold Exempel på standardkurva SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS 15 16
Standardkurva avslöjar PCR effektivitet! Lutningen på kurvan beror på PCR-reaktionens effektivitet (E eller η) Lutn.koeff: k = -1/logE 100 % effektivitet ger k= -3,32
PCR-reaktionens effektivitet Vid kvantifiering viktigt att ha hög effektivitet, helst 100 % Optimering viktig! Kort amplifikat, 75-150 bp
Identifiering av primerdimer k=-2,48 Eff.= 153 % r= 0,957 r= korr.koeff. Mått på hur bra (BioRad) data stämmer med kurvan Mer än 100 % effektivitet! Flera produkter amplifieras! Primerdimer? Analysera med smältkurva!
Smältkurva avslöjar ospecifika produkter Utförs efter amplifiering PCR-prod. värms från 52-78 ºC. dsdna denatureras Vid Tm sker en kraftig minskning av fluorescens Produkter med olika Tm-värden kan detekteras Tm för primerdimer?
Uppvärmning av PCR-produkt
Derivera signalen Smältkurvan http://www.uic.edu/depts/rrc/cgf/realtime/melt.html
Identify Primer-Dimers by Melt Curve 10,000 copies 2,000 copies 400 copies (BioRad) No template control
Resultat med nya primers (BioRad) = 91.3% r = 0.999
Hybridisering med probe PCR-produkten får hybridisera till en specifik probe (en nukleotidsekvens som är komplementär till en del av mål-dna) GTTAAGCGCTGGAAACCGT AACGGACAATTCGCGACCTTTGGCATTCCGTG. Om proben binder till PCR-produkten får man signal Ospecifika produkter (t.ex. primerdimer) ger ingen signal. Varför inte?
FRET detektion R= Reporter, fluorofor, emitterar energi, överför till Q Perkin Elmer (Applied Biosystem) Q= quencher, absorberar energin om R och Q är på lämpligt avstånd
Mäter signal vid den våglängd reportern emitterar Intakt probe: emitterad våglängd absorberas av Q Klyvd probe: Signal detekteras
TaqMan probe Reporter i 5 ände Quencher i 3 ände, 3 OH kan ej fungera som start för ny syntes I intakt probe absorberar Q den energi som R avger ingen signal detekteras Perkin-Elmer (Appl.Biosystem)
TaqMan Probe Oligonukleotid som är komplementär till målsekvens i PCRprodukt Binder bara till måldna Vid syntes frigörs R, och fluorescerar Mer templatdna, mer PCR-produkt (amplicon), högre signal
Molecular beacon Se fig. 9.18 i Brown Ca 30 nt ssdna Fluorofor i 5 ände Quencher i 3 ände Hybridiserar till PCR-produkt, fluorescens Mäter signal vid annelingsteget
Kvantifiering av genuttryck Ex. vill se om gener slås av/på vid en viss behandling Försöksperson får cykla Biopsier tas före och efter träningen RNA prepareras cdna-syntes mha RT-polymeras Realtids-PCR Mängden amplifikat är ett mått på mängd start-dna, (motsvarande mrna)
Relativ kvantifiering Ofta räcker det att se skillnad i mängd mrna mellan olika prover. Beräknar en kvot Ex. jmf mrna före/efter träning Jmf mrna friska celler/cancerceller
Problem Kan finnas skillnader mellan proverna Variation i RNA-degradering Variation i cdna-reaktion Hur kan man kompensera för dessa skillnader? Finns det gener som borde ge lika mycket mrna i alla celler oberoende av behandling? Borde vara lika i alla prover.
control expt Referensgen Även vid Northern använder man referensgen (endogen kontroll, house-keeping gene) Målgen referensgen actin, GAPDH, RPLP0 etc Corrected fold increase = 10/2 = 5 Ratio target gene in experimental/control = fold change in target gene fold change in reference gene http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/realtime-home.htm 34
Lämplig referensgen? Bör uttryckas lika mycket i alla celler under alla betingelser, house-keeping gene. Bör ha ungefär samma PCReffektivitet som målgenen. Måste väljas med omsorg (helst 2st) 18 S rrna GAPDH 2 mikro (klass 1 MHC protein) actin Ribosomalt protein, RPLP0
FRET hybridiseringsprober för mutationsanalys Två prober hybridiserar svans mot huvud Avstånd 1-5 nt Reportern ger signal när båda proberna hybridiserar till PCR-produkten
FRET prober för mutationsanalys Smältkurvsanalys Mutation ger mismatch, lägre Tm-värde Kan skilja vildtyp från mutation Genotypning (SNP) https://www.roche-applied-science.com/servlet/ RCConfigureUser?URL=StoreFramesetView&storeId= 10151&catalogId=10151&langId=-1&countryId=se
Strategi 1. Välj målområde (target, amplicon) 75-150 bp Designa och beställ primers 2. Optimera med SYBR Green I Kontrollera effektivitet och specificitet Använd smältkurva och bekräfta med gel 3. Designa och beställ probe 4. Bekräfta att proben fungerar över ett brett dynamiskt område