ANALYS AV KVARVARANDE SJUKDOM VID AKUT MYELOISK LEUKEMI NÄR, VAR OCH HUR? LINDA FOGELSTRAND DOCENT, SPECIALISTLÄKARE KLINISK KEMI & AVDELNINGEN FÖR KLINISK KEMI OCH TRANSFUSIONSMEDICIN, INSTITUTIONEN FÖR BIOMEDICIN
Akut myeloisk leukemi (AML) Mutationer Akut myeloisk leukemi (AML) Blodbrist Brist på blodplättar Brist på vita blodkroppar
Behandling vid AML Diagnos Induktionsbehandling Konsolideringsbehandling CELL- GIFT CELL- GIFT CELL- GIFT CELL- GIFT CELL- GIFT STAMCELLS- TRANSPLANTATION Riskbedömning behandlingsstyrning
Riskbedömning vid AML Patientrelaterade faktorer Genetiska förändringar hos leukemicellerna Svar på behandling Remission? <5% blaster Minimal / Measurable residual disease MRD?
Vid MRD-analys kvantifieras det som särskiljer leukemicellen från normala celler DNA: Mutationer Kombinationer av proteiner på cellytan: CD-markörer Flödescytometri RNA: fusionstranskript
MRD-analys med flödescytometri Vid diagnos definiera leukemicellerna LAIP = leukemia-associated immunophenotype Vid MRD-analys kvantifiera LAIP + different from normal Standardisering enligt NOPHO-DBH AML-2012 guidelines Euroflow settings fasta inställningar i alla kanaler Horizon V450 Horizon V500 FITC PE PerCPCy 5.5 PE-Cy7 APC APC-H7 APC-Cy7 1 HLA-DR CD45 CD56 CD13 CD34 CD117 CD33 CD11b 2 HLA-DR CD45 CD36 CD64 CD34 CD117 CD33 CD14 3 HLA-DR CD45 CD15 NG2 CD34 CD117 CD2 CD19 4 HLA-DR CD45 CD7 CD96 CD34 CD117 CD123 CD38 5 HLA-DR CD45 CD99 CD11a CD34 CD117 CD133 CD4
MRD-analys med flödescytometri SSC SSC 1. Definiera leukemicellerna med omogna markörer om möjligt (CD34, CD117, (CD133)) FSC CD45 CD34 CD117 CD117 HLA-DR
MRD-analys med flödescytometri CD34 CD117 1. Definiera leukemicellerna med omogna markörer om möjligt (CD34, CD117, (CD133)) CD117 HLA-DR 2. Definiera LAIP VAD SKILJER DEM FRÅN NORMALA CELLER? CD13 CD33 CD11b CD33 CD11b CD13 CD56 HLA-DR
MRD-analys med flödescytometri Normala CD34+CD117+ celler CD13 CD33 CD11b CD33 CD11b CD13 CD56 HLA-DR Leukemicellerna CD13 CD33 CD11b CD33 CD11b CD13 CD56 HLA-DR
MRD-analys med flödescytometri Jämför med rätt motsvarighet i alla rör! CD34 CD117 Vid MRD-analys > 50 celler Generell detektionsgräns 0,1% CD117 HLA-DR CD13 CD33 CD11b CD33 CD11b CD13 CD56 HLA-DR
Betydelse av MRD med flödescytometri NOPHO AML-2004 NOPHO-DBH AML-2012 MRD-styrd behandling Om MRD+ före start av konsolidering stamcellstransplantation A. Tierens et al, Br J Haematol 2016
Leta efter det som skiljer leukemicellen från normala celler Proteiner på cellytan Genetiska förändringar hos leukemicellerna
MRD med RT-qPCR under behandling Ivey A et al, N Engl J Med 2016
Genetiska förändringar vid AML RT-qPCR etablerad prognostisk betydelse under och efter behandling BARN: Studier pågår under och efter behandling RESTEN: NGS (djupsekvensering), digital-pcr
Ju äldre patienten är desto fler leukemispecifika mutationer kan identifieras MRD suitable mutations/case 30 25 20 15 10 5 0 Adult 1 Adult 2 Adult 10 Adult 11 Adult 5 Vuxna MRD-suitable INDELs* MRD-suitable SNVs* Adult 12 Child 3 Child 4 Child 2 Barn Malmberg et al, Eur J Haematol 2017
Djupsekvensering för MRD-analys VID DIAGNOS: IDENTIFIERA LEUKEMIA-SPECIFIK MUTATION VID UPPFÖLJNING: DJUPSEKVENSERING FÖR MRD-ANALYS Exomsekvensering av sorterade celler Leukemic cell DNA Normal DNA Tailored analysis 2-3 leukemi-specifika mutationer Mutation NGS-panel Malmberg et al, Eur J Haematol 2017 x ~1,000,000 Korrigering för sekvensspecifika fel ATATAGCCGAACGCGCGCGCTA ATATAGCCGAATGCGCGCGCTA ATATAGCCGAATGCGCGCGCTA ATATAGCCGAATGCGCGCGCTA ATATAGCCGAACGCGCGCGCTA ATATAGCCGAATGCGCGCGCTA ATATAGCCGAATGCGCGCGCTA ATATAGCCGAATGCGCGCGCTA ATATAGCCGAATGCGCGCGCTA ATATAGCCGAATGCGCGCGCTA ATATAGCCGAATGCGCGCGCTA ATATAGCCGAATGCGCGCGCTA Andel DNA-molekyler med mutationen variantallelfrekvens (VAF) VAF x 2 ~ andel leukemiceller
Djupsekvensering för MRD-analys VID DIAGNOS: IDENTIFIERA LEUKEMIA-SPECIFIK MUTATION VID UPPFÖLJNING: DJUPSEKVENSERING FÖR MRD-ANALYS Exomsekvensering av sorterade celler Leukemic cell DNA Normal DNA Tailored analysis 2-3 leukemi-specifika mutationer Mutation Detektionsgräns (LOD) vid x500,000: VAF 0.02% NGS-panel CV 3% vid VAF 8% 4% vid VAF~1% 13% vid VAF ~0.1% Malmberg et al, Eur J Haematol 2017 Delsing Malmberg et al, Acc J Mol Diagn
Djupsekvensering överensstämmer med flödescytometri men är känsligare 100 100 100 Djupsekvensering Detected VAF (% ) 10 1 0.1 CLCC1 T-->A T G M 7 A --> G Detected VAF (% ) 10 1 0.1 TECTA Detected VAF (% ) 10 1 0.1 NHLH1 G-->A KCNK9 G-->A CCNA1 G-->T 0.01 0.01 0.01 0.001 100 Diagnosis D22 Last before 2nd ind. D22 post 2nd ind. Last before cons. D22 post 2nd ind. + 7w R e la p s e 0.001 100 Diagnosis D22 Last before 2nd ind. Last before cons. D22 post 2nd ind.+8w Blood 2 m onths before relapse Blood 3 weeks before relapse R elapse 0.001 100 Diagnosis D22 Last before 2nd ind. D22 post 2nd ind. D22 post 2nd ind.+11w Flödescytometri % C e lls w ith L A IP 10 1 0.1 % C e lls w ith L A IP 10 1 0.1 % C e lls w ith L A IP 10 1 0.1 0.01 Diagnosis D22 Last before 2nd ind. D 2 2 p o s t 2 n d in d. D22 post 2nd ind. + 3w D22 post 2nd ind. + 7w Relapse 0.01 D ia g n o s is D22 Last before 2nd ind. Last before cons. D 2 2 p o s t 2 n d in d.+ 8 w R elapse 0.01 Diagnosis D22 Last before 2nd ind. D22+2w D 2 2 p o s t 2 n d in d. D 2 2 p o s t 2 n d in d. + 1 1 w Delsing Malmberg et al, Acc J Mol Diagn
MRD med djupsekvensering efter SCT Vuxna med AML with mutation i NPM1 Prov 3 mån efter allosct Delsing Malmberg et al, Leukemia & Lymphoma 2018
Recidiv föregås av molekylärt recidiv Fraction positive cases Months before relapse Ommen et al, Blood 2009
Djupsekvensering kan utföras på blod Delsing Malmberg et al, Acc J Mol Diagn
MRD-ANALYS VID AML NÄR, VAR OCH HUR? Under behandling: behandlingsrespons riskstratifiering behandlingsbeslut I samband med SCT (före & efter) prognos behandlingsbeslut Monitorering efter avslutad behandling tidig behandling av återfall