Från purgativ till cytostaticum utveckling av potenta läkemedel ur Podophyllum spp.

Transkript

1 Från purgativ till cytostaticum utveckling av potenta läkemedel ur Podophyllum spp. Farmakognosi B 10p nät vt 2003 Elsa Svensson Handledare Anders Backlund Avdelningen för Farmakognosi Institutionen för Läkemedelskemi Uppsala Universitet 1(15)

2 Från purgativ till cytostaticum utveckling av potenta läkemedel ur Podophyllum spp. Bankakri (Podophyllum emodii Wall.) Foto: Håkan Tunón Sammanfattning Släktet Podophyllum spp. har en tradition som läkeväxt som sträcker sig från ett par tusen år före Kristi födelse till i dag. Olika örter tillhörande samma art, har använts för samma ändamål i den gamla världen Kina, Japan, Indien och den nya Amerikanska kontinenten. Jag tyckte det verkade intressant att titta på dokumentation kring användning och utveckling av växtsläktet och har funnit att utnyttjandet av växten har förändrats genom åren. Från att ha använts som laxermedel och medel mot inälvsparasiter har bruket förändrats dels till utvärtes medel mot vårtor och dels till utvecklandet av derivat av aktiv substans, som brukas mot olika former av cancer. Forskning bedrivs aktivt på flera håll för att undersöka möjligheterna dels för att kunna öka produktionen av det aktiva ämnet genom odling av hela växten eller i cellkulturer och dels för att ta reda på om substansen eller derivat av den har fler användningsområden än vad som framkommit hitintills. Flera lovande vägar ser ut att ligga öppna för ytterligare utveckling under kommande år. 2(15)

3 Innehållsförteckning: Sammanfattning 1 Inledning 3 1. Podophyllum peltatum L (Berberidaceae) Amerikanskt Majäpple, 3 Fotblad, vild citron, Paraplyplanta, Amerikansk Mandrake. 2. Podophyllum emodii Wall.(syn.P.hexandrum Royle)(Berberidaceae) 4 Indiskt Majäpple, Bankakri 3. Podophyllum pleianthum Hance (Dysosoma pleiantha Woodson) 4 (Berberidaceae) Kinesiskt Majäpple, Hakkakuren. 4. Historik 4 5. Drogberedning 5 6. Verksamma substanser (Naturligt förekommande) 5 7. Biosyntes 6 8. Odlingsförsök 6 9. Utvinning av podofyllotoxin Andra produktionsvägar Användningsområden 8 11a. Podofyllotoxin 8 11b. Derivat av podofyllotoxin Verkningssätt 8 12a. Podofyllotoxin 8 12b. Derivat av podofyllotoxin 9 12c. Vattenextrakt ur Podofyllumarter Beredningsformer Biverkningar Diskussion Referenslista 11 Framsidans bild återgiven med tillstånd Daniel Reed 3(15)

4 Inledning Det väckte mitt intresse att undersöka dokumenteringen om ett växtsläkte Podophyllum spp., vilket under hundratals år använts på likartat sätt, bl a som laxativ och maskmedel av befolkning i två olika delar av världen. Forskning under senare delen av 1900-talet har visat att förutom den virushämmande effekt hos podofyllotoxin, som varit känd sedan 1947 (Hartsell J.L., och Shear M.J. 1947), har podofyllotoxin och derivat därav verkan som cytostaticum(moraes et al.2002) och antirheumaticum (Lerndal, T. och Svensson, B. 2000). Det pågår för närvarande forskning som tyder på att den aktiva substansen med derivat kommer att kunna användas som medel mot psoriasis, malaria och Alzheimers sjukdom.(bohlin, L., och Rosen, B.1996) Mitt mål har varit att tydliggöra en liten del av den forskning som bedrivs på droger med bakgrund i traditionellt bruk hos olika folkstammar, samt visa på en del av den utvecklingspotential som finns dold i dessa ämnen. 1. Podophyllum peltatum Linné (Berberidaceae) Amerikanskt Majäpple, Fotblad, Vild citron, Paraplyplanta även känd som Amerikansk Mandrake. Amerikanskt Majäpple är en perenn växt ur Berberisfamiljen. Den förekommer vild i ofta stora kolonier i östra Nordamerika från Quebec (Canada) till Florida och Texas(USA). Den växer på fuktig, näringsrik jord i lövskogar, skogsbryn och efter flodstränder(moraes et al.2002; Lata et al 2002). Plantan består av en till två, oftast ogrenade stammar, som blir mellan en och två fot (30 60 cm) höga. I toppen av stammen sitter ett paraplylikt djupflikigt blad, som kan bli upp till 30 cm i diameter. Blomman, som sitter i förgreningen mellan de två stammarna är stor (ända till fem cm), vit och nickande. Den planta som endast har en stam saknar blomma. Blomdoften är inte särskilt behaglig. Plantan tillhör de första växter, som visar sig när våren kommer. Den sticker upp sina skott, som liknar ett hopfällt paraply, innan träden har utvecklat sitt bladverk. Blomningen börjar redan i mars och fortsätter in i maj månad och frukten som utvecklas blir stor som ett plommon och mognar från maj (därav namnet Majäpple) till augusti, och blir gul till färgen.(moraes et al.2002 ). Frukten är den enda del av plantan som är ätlig. Smaken är sötsyrlig och frukten är mycket vätskerik. Den kan användas till gelé, sylt och marmelad. (Fondren, T. 1998). Plantan utvecklar horisontella rhizomer, som kan bli upp till metern långa, men endast omkring centimetern grova. Det är 4(15)

5 ur dessa som huvudparten av det eftertraktade hartset utvinns. (Flora of North America 1993 ) 2. Podophyllum emodii Wall (syn.podophyllum hexandrum Royle) (fam.berberidaceae) Bankakri, Indiskt Majäpple. Förekommer vild i s k köldöknar på Himalajas bergsluttningar belägna i Ladakh i Jammu & Kashmir samt Lahaul & Spiti i Himchal Pradesh i Indien.(Singh, B. and Chaurasia, O.P.,2000) Växten skiljer sig från sin amerikanska släkting. Bladen är fläckiga, men ungefär av samma storlek och form, blomman svagt rosafärgad och bägarlik, men upprätt (Duke J.A.och Ayensu E.S.1985). På grund av växtens höga podofyllininnehåll har växtplatserna utsatts för plundring och arten är numera klassad som utrotningshotad och belagd med exportförbud. Enligt föreskrift i Indisk handelslag, Appendix 2, 2001 är export av plantor, derivat av och extrakt erhållet ur Podophyllum hexandrum(emodii) förbjuden. 3. Podophyllum pleianthum Hance ( Dysosoma pleiantha Woodson) (fam.berberidaceae). Kinesiskt Majäpple, Hakkakuren. Parasolliknande, upp till 40 cm stora, blanka blad och en klase av hängande, ballongliknande mörkröda blommor. (Heywood V.H.1993) Förekommer i Ostasien, Taiwan och Centrala och Södra Kina, där rhizomer av växten använts för att bereda Hakkakuren, ett ämne använt för att behandla ormbett och vårtor på genitalierna. Berberineinnehållet i växten gör att den även använts för att behandla feber. (Duke J.A..,och Ayensu E.S.1985) 4. Historik Olika indianstammar i Nordamerika har använt roten av växten Majäpple på olika sätt sedan urminnes tider. Det går inte att visa hur växtens användingsmöjligheter upptäcktes. Antaganden har gjorts om trial and error, men bevis saknas. Cherokeeindianerna använde torkad (och även färsk) pulvriserad rot som anthelminticum. Kokt rot och även avkok av rot användes som laxermedel. Pulvriserad torkad rot ströddes på fula sår för att rensa upp. Rotsaften användes till att behandla majsutsädet före sådden mot angrepp av skadedjur och ett avkok av växten sprutades på potatisblasten för att ta död på 5(15)

6 ohyra. Rot blötlagd i whiskey intogs som medel mot reumatiska besvär (Hamel P.B.and Chiltoskey M.U.1975). Pressaft ur färsk rot droppades i öronen mot dövhet, och rotavkok som fått dunsta ihop till seg konsistens rullades till piller, vilka användes som laxermedel.(witthoft J.1947) Penobscotindianerna använde Majäpplerot som utvärtes medel mot vårtor och andra hudåkommor. Huron- och Irokesindianerna utnyttjade växten för att begå självmord.(fondren T.,1998) Wyandotteindianerna kände till att om roten rostades förlorar den en del av sin våldsamma laxativa effekt.(king s American Dispensatory 1898.) Indiska folkstammar har använt sig av Bankakri som laxativ, som gallstimulerande medel och mot invärtes parasiter.(moraes et al. 2002). Extrakt av örten användes i Kina som medel mot tumörer för mer än 2000 år sedan och användes även som behandling vid ormbett, tandinfektioner, hudåkommor och masksjukdomar. (Duke J.A.,och Ayensu E.S. 1985; Cragg et al.1994). I traditionell avändning hos folkstammar i Himalaja har örten bl a använts för behandling av sår, leverproblem, feber, hudsjukdomar och som laxativ.(purohit et al.1986; Rajwar G.S.1984) 5. Drogberedning Hartset, Podofyllin, som utvinns ur rot och rhizomer av Podophyllumarterna med hjälp av alkohol och efterföljande utfällning med en utspädd saltsyralösning, torkas och mals till ett pulver.(usp 25; Martindale 2003.) Detta harts användes sedan bl a som laxativ och till behandling av olika hudåkommor t ex vårtor. På grund av dålig hållbarhet måste etanollösningen för vårtbehandling beredas ex tempore och behandlingen var dessutom svår att genomföra med hänsyn till den stora biverkningsrisken.(samuelsson G ) 6. Verksamma substanser (naturligt förekommande) Podofyllin utvunnet ur Amerikanskt Majäpple (Podophyllum peltatum L.) och Bankakri (Podophyllum hexandrum R.(syn.P.emodii W.))har inte samma sammansättning och inte heller samma halt av ingående ämnen. P.peltatum L. innehåller omkring 15% podofyllotoxin, som är det eftertraktade ämnet och P.hexandrum R(syn.P emodii W) innehåller omkring 50%. Dessutom innehåller Amerikanskt Majäpple både - och -peltatiner. Dessa saknas i 6(15)

7 Bankakri.(Samuelsson 1997; Maqbool et al ) P.pleianthum H. och P.emodii W. innehåller dessutom alkaloiden berberin.(yeung Him-Che 1985) Podofyllotoxin 7. Biosyntes. Podofyllotoxin, - och -peltatin är lignaner, dvs en grupp naturliga ämnen bildade som derivat av fenylpropan. Ett mellanstadium och troligen det ultimata förstadiet i syntesen av podofyllotoxin och peltatinerna hos Podophyllumarterna är matairesinol. Ur detta ämne bildas två grupper ämnen, dels 3,4,5 -trimetoxylignan(yatein)(a) och 4 -hydroxy,3,5 - metoxylignan(4 -demetylyatein)(b). Från A syntetiseras sedan podofyllotoxin och -peltatin och från B 4 -demetylpodofyllotoxin och -peltatin. (Broomhead J.A.et al.1991; Samuelsson G ) 8. Odlingsförsök. Utarmningen av tillgångar på Bankakri (P.hexandrum R(syn.P.emodii W)) och växtens långa etableringstid 7 år eller mer - för plantor uppdragna från rhizombitar och ännu längre för plantor uppdragna ur frö (Choudhary et al.1998; Lata et al.2002), har medfört att blickarna riktats mot Amerikanskt Majäpple (P. peltatum L.) trots att podofyllotoxininnehållet är betydligt lägre. Intresset har nu istället vänts mot att undersöka huruvida det skulle gå att använda bladverket av den örten i stället, eftersom det utgör en s a s förnyelsebar källa. Olika undersökningar har fastslagit att det förekommer stammar med jämförelsevis högt 7(15)

8 podofyllotoxininnehåll i bladen, och samma undersökningar visar också att innehållet av det verksamma ämnet inte är beroende av växtplats och inte heller förändras över åren. Däremot visades att det föreligger omvänt förhållande mellan innehållet av podofyllotoxin och - peltatin. De växtstammar som har högt podofyllotoxininnehåll har låg -peltatinhalt och tvärtom. Detta leder till att urval och odling av sådana med högt innehåll av podofyllotoxin i bladmassan kan minska produktionskostnaden och kan göra odling intressant.(moraes,r.m.et al.2000;2001;2002) Det pågår även försök att återställa förekomsten av P.hexandrum R. genom att forskare från G.B.Pant Institute of Himalayan Environment and Development in Gahrwal(Indien) genomför odlingsförsök med rhizomdelar, frö och även med plantor uppdragna ur callus.(ministry of Environment and Forests, Government of India ) 9. Utvinning av podofyllotoxin. Försök att utvinna podofyllotoxin ur bladmassa av Amerikanskt Majäpple har visat att det mest fördelaktiga sättet tycks vara att använda sig av en patenterad buffrad extraktionsmetod framtagen av forskare vid Purdue University, West Lafayette, Indiana, USA (Canel et al.2001; Bedir et al ) Den metoden ger ett liknande utfall av podofyllotoxin som etanolextrahering av rhizomer av Bankakri (P.hexandrum).(Moraes et al.2002.) 10. Andra produktionsvägar. Alternativa produktionsvägar för podofyllotoxin har undersökts. Bästa odlingsmedium för P.hexandrum explants i suspensionskultur visade sig vara MS mediet(murashige-skoog medium) med ph justerat till 6.0, indole-ättiksyrahalt(iaa) 1,25 mg/l, glucos i stället för sackaros med en halt av 60g/l. Optimal nivå kväve och ett förhållande ammoniumsalter:nitrat 1:2 gav högsta utbyte podofyllotoxin. (Chattopadhyay S. et al. 2002; Chattopadhyay S. et al ) En trefaldig ökning av podofyllotoxininnehållet i calluskultur av P.hexandrum har uppnåtts med ympning av en stam av Agrobacterium rhizogenes.(giri et al.2001.) Forskning med avseende på biosyntes av lignaner, fokuserad på bioteknologiska system för framställning av podofyllotoxin, bedrivs med hjälp av cellkulturer av bland annat P.hexandrum och Linum flavum.(koulman A..et al. 2000) 8(15)

9 11. Användningsområden. 11a. Podofyllotoxin Podofyllotoxin används som virushämmande medel både i spritlösning och i krämberedning mot genitala vårtor(condylomata acuminata). Det ingår i det receptbelagda registrerade läkemedlet Wartec Sylak (Fass 2003) 11b. Derivat av podofyllotoxin Derivat av podofyllotoxin: etoposide, etopophos och teniposide används som tumörhämmande medel mot blåscancer, småcellig lungcancer, vissa typer av leukemi och Hodgkins sjukdom.(fass 2003) CPH 82 (reg.reumacon ) halvsyntetiskt derivat av podofyllotoxin har visats ha effekt jämförbar med Methotrexate vid rheumatoid arthrit - men med färre biverkningar. (Lerndal, T. och Svensson, B., 2000) Försök med andra derivat av podofyllotoxin beträffande användning mot Alzheimers sjukdom, malaria och psoriasis pågår också.(bohlin L. och Rosen B. 1996) Vad gäller användning för behandling av psoriasis har undersökningarna kommit så långt att kliniska prövningar kommer att inledas.(mail) Dessutom sker undersökningar beträffande användning som insektsbekämpningsmedel.(miyazawa et al.1999) 12. Verkningssätt. 12a. Podofyllotoxin Effekten på virus av podofyllotoxin anses bero på att de infekterade cellernas tillväxt hämmas genom att nukleosidtransporten över cellmembranet hindras. Detta leder till celldöd och slutligen även till virusdöd.(samuelsson G. 1997;Fass 2003) Den tumörhämmande effekten hos podofyllotoxin (och även hos peltatinerna) beror på dess verkan på tubulinet i cellkärnan. Verkningarna på tubulinet påverkar ett flertal cellaktiviteter 9(15)

10 t ex celldelning, signalöverföring och start av DNA-syntes och innebär att tumörtillväxten avstannar.(samuelsson G. 1997) 12b. Derivat av podofyllotoxin Teniposid och etoposid (och etopophos) är glycosidderivat av epipodo-phyllotoxin. Teniposid (reg. Vumon ) och etoposid (reg.eposin, Exitop,Vepesid ) och etopophos(reg.etopofos ) och deras verkan föreslås bero på ingrepp i DNA-syntesen. Enkel- och dubbelbindningar i DNA-kedjan bryts, och DNA-syntesen hejdas.(samuelsson G. 1997) Etoposid 12c. Vattenextrakt ur Podophyllumarter Vattenextrakt ur Podophyllumarter har visat sig ha sådana antioxidativa egenskaper som visar sig genom chelatbildning och reglering av Fe2+/Fe3+ halten. Detta pekar på att Podophyllum även kan ha egenskaper som innebär förmåga att skydda mot strålning. (Kumar, IP 2000). 13. Beredningsformer. Podofyllotoxin, som enbart används i beredningar för utvärtes bruk, finns i Sverige registrerat dels som 0,5%-ig blåfärgad lösning i stark sprit, dels som 0,15%-ig krämberedning. Teniposid, etoposid, och etopofos föreligger i koncentrat för beredning av infusionslösning och i orala kapslar.(fass 2003) CPH82 (Reumacon ) är registrerat som orala kapslar. (Lerndal T. och Svensson B. 2001) 10(15)

11 14. Biverkningar Podofyllin användes tidigare som kraftigt verkande avföringsmedel, den laxerande effekten hänförs till de ingående peltatinerna. På grund av att podofyllin är ett mycket toxiskt ämne har den användningen i stort sett upphört, dock förkommer det fortfarande i Kinesisk praxis. Ämnet och dess derivat är mycket retande, speciellt på ögon och slemhinnor. Det kan orsaka allvarliga förgiftningar både efter intag och efter användning på huden. Symtom som illamående, våldsamma kräkningar, svåra magsmärtor och kraftig diarré följer efter okontrollerad användning och det gör även trombocytopeni, leukopeni, njursvikt och leverpåverkan. Påverkan på CNS systemet visar sig efter några dagar, med psykotiska tillstånd, hallucinationer, förvirring och koma. Neuropatier utvecklas efter hand och kan resultera i förlamningar och muskelsvaghet. Dessa förlamningar kan förbättras efter ett antal månader, men går sällan tillbaka helt. Letal dos av podofyllin är så låg som 0,5 mg/kg kroppsvikt vid upprepat intag, och symtomen inträder smygande först efter några dagar. Ett flertal dödsfall har rapporterats.(martindale 2003) 15. Diskussion I mina undersökningar av dokumentation kring bruket av Podophyllumarterna genom tiderna, har jag kommit fram till att släktet Podophyllum innehåller ett flertal ämnen, där somliga effekter var kända redan under tiden före Kristi födelse. Folkstammar i både Gamla och Nya världen har använt sig av växter tillhörande detta släkte för liknande ändamål. I Kinesiska urkunder finns användning dokumenterad redan ca 2800 BC.(The Pun-tsao ca 1600). Från folkstammar i Indien och Himalaja finns också användning dokumenterad sedan århundraden (Purohit V. et al.1986) och i Nya världen använde indianstammarna i Amerika samma växtsläkte. Nybyggarna i Amerika lärde sedan av indianerna hur man kunde använda sig av växten.(hamel P.B., och Chiltoskey M.U.,1975) Under 1900-talet har sedan vidare undersökningar utförts och redan 1947 visade Hartsell och Shear att podofyllotoxinet hade virushämmande effekt. Ytterligare undersökningar och även odlingsförsök pågår fortfarande. Man vill kunna utnyttja bladmassa av den rikligare förekommande och kanske mer lättodlade varianten Podyphyllum pelatatum L. för podofyllotoxinproduktion, i stället för rhizomer av Podophyllum hexandrum R som är i stort sett utrotad på sina naturliga växtplatser. Derivaten av 11(15)

12 podofyllotoxin: etoposid, etopophos och teniposid utnyttjas för behandling av olika cancerformer, och ett annat derivat, CPH 82, för behandling av Rheumatoid Arthrit. Försök förekommer på olika håll för att se om andra användningsområden kan ligga öppna för derivat av ämnet. Här kan nämnas: psoriasis, malaria, Alzheimers sjukdom och även möjligheter att bekämpa insekter och växtsjukdomar. Växtsläktet ser ut att ha en enorm kapacitet även för nya användningsområden. Kan man lösa problemet med framställning av podofyllotoxin i större mängder ur bladmassa eller cellkulturer, finns stora möjligheter att kunna bekämpa i varje fall en del av de sjukdomar som världens ökande befolkning med stigande ålder drabbas av. 16. Referenslista Bedir E., Khan I., Moraes R.M., Bioprospecting for podophyllotoxin. Trends in new crops in new uses J.Janick and A Whipkey (eds). ASHS Press, Alexandria, VA. Bohlin, L. och Rosen, B., Podophyllotoxin derivatives:drug discovery and development. Drug Delivery Today 1996;1: Broomhead A.J., Maiada M., Rahman A, Dewick P.M., Jackson D.E., Lucas J.A. Mataresinol as a precursor of podophyllum lignans. Phytochemistry 1991;Vol 30(5): Canel C., Dayan F.E. Ganzera M., Rimando A., Burandt C., Khan I., Moraes R.M. high yield of podophyllotoxin from leaves of Podophyllum peltatum by in situ conversation of podophyllotoxin 4-O-ß-D glucopyranoside. Planta Medica 2001; 67:97-99 Chattopadhyay S., Mehra S., Srivastava K., Bhojwani S., Bisaria S. Effect of major nutrients on podophyllotoxin production in Podophyllum hexandrum suspension cultures. Appl.Microbiol. Biotechnol Jan; 60(5): Chattopadhhyay S., Srivastava AK., Bisaria VS. Optimization of culture parameters for production of podophyllotoxin in suspension culture of Podophyllum hexandrum. Appl.Biochem.Biotechnol Jul-Dec; (1-6): (15)

13 Choudhary D.K., Kaul B.L., Kahn S., Cultivation and conservation of Podophyllum hexandrum an Overwiew. J. Med. Aromatic Plant Sci. 1998; 20: Cragg G.M., Boyd M.R., Cardelinna J.H., Newman D.J.,Snader K.M.,McCloud T.G. A long history of medicinal use by early American and Asian cultures including the treatment of scin cancers and warts. In Ethnobotany an the Search for New Drugs Ciba Foundation (D.J.Chadwick, J Marsh edts.) Vol 185 pp Wiley &Sons, Chichester, UK. Duke J.A., Ayensu E.S., Medicinal Plants of China 1985; Algonac, MI, Reference Publications, Inc. Fass 2003 Flora of North America 1993 Fondren B.T. Mayapple. Ethnobotanical Leaflets (Ugent D. ed) Southern Illinois University, Carbondale. G.B. Pant Institute of Himalayan Environment and Development. Report from Ministry of Environment and Forests Government of India Giri A.,Giri CC., Dhinga V., Narasu ML. Enhanced podophyllotoxin production from Agrobacterium rhizogenes transformed cultures of Podophyllum hexandrum. Nat.Prod.Lett 2001;15(4): Hamel P.B and Chiltoskey M.U. Cherokee Plants and Their Uses a 400 Year History. Sylva, N.C. Herald Publishing Co.(44) Hartsell J.L. och Shear M.J. Podophyllotoxin as an topical treatment for genital warts. Chemotherapy of cancer. Classes of compounds under investigation and active components or podophyllin. Cancer Research 1947;7: Heywood V.H., Flowering Plants of the World ed 1993, New York, N.Y., Oxford University Press. 13(15)

14 Indisk handelslag, Appendix 2, 2001 Koulman A., Beekman A.C., Kubbinga M.E., Arroo R.R.J.,Woolley J.G., Quax W.J., Pras N. The production of lignans by Anthriscus sylvestris, Podophyllum hexandrum and Linum flavum cell suspension cultures. Phytochemie 55(2000): Kumar I.P., Goel H.C. Iron chelation an related properties of Podophyllum hexandrum, a possible role in radioprotection. Indian J.Exp.Biol Oct; 38(10): Lata H., Moraes R.M., Douglas A., Scheffler B.E. Assessment of Genetic Diversity in Podophyllum peltatum by Molecular Markers. Trends in new crops in new uses 2002, J.Janick and Whipkey A. (eds) ASHS Press, Alexandria, VA Lerndal, T. och Svensson, B., A clinical study of CPH 82 vs methotrexate in early rheumatoid arthritis. Reumatology 2000; 39: Lerndal, T., och Svensson, B., Reumacon licensed drug of widespread use. Läkartidningen 2001 febr 14; 98(7): Maqbool M., Cushman K.E., Moraes R.M. Propagule Type and Planting Time For Field Established Mayapple. Trends in new crops and new uses J.Janick an A Whipkey (eds) ASHS Press, Alexandria, VA. MARTINDALE The Complete Drug Reference. Miyazawa M., Fukuyama M., Yoshio K., Kato T., Ishikawa Y., Biologically active components against Drosophila melanogaster from Podophyllum hexandrum. J.Agric.Food Chem. 1999; Dec; 47(12): Moraes RM., Bedir E., Barrett H., Burandt C Jr.,Canel C., Khan IA. Evaluation of Podophyllum peltatum accessions for podophyllotoxin production. Planta Medica 2002 Apr; 68(4): (15)

15 Moraes R.M., Lata H., Bedir E., Maqbool M., Cushman K. The American Mayapple and its Potential for Podophyllotoxin Production. Trends in new crops and new uses J.Janick and A. Whipkey (eds). ASHS Press, Alexandria, VA Purohit V-P., Silas R.A., Gaur R.D. Ethnobotanicla studies of some medicinal plants used in skin diseases from Raath (Pauri) Garhwal Himalaya. J. Sci.Res. Planta Medica 1986; 6:39-47 Rajwar G.S. Exploitation of Medicinal Plants of Garhwal Himalaya. Sci.& Environment.1983; 2:37-41 Reid B.E. Famine Foods of the Chin-Huang Pen-tsáo. Taipei. Southern Materials Centre (A translation of an ancient Chinese book on edible wild foods) Samuelsson G. Drugs of Natural Origin, A textbook of Pharmacognosy; Swedish Pharmaceutical Society, Swedish Pharmaceutical Press: Stockholm, Sweden 1999; 4 th ed. Singh B. and Chaurasia O.P. Medicinal Flora of Indian Cold Desert. Acta Hort.(ISHS) 2000; 523:65-74 U.S.Pharmacopoeia o.national formulary (USP 24) NF 19 Witthoft J., An Early Cherokee Ethnobotanical Note. Journal of the Washington Academy of Sciences 1947; 37(3):73-75(74) Wickes Felter H., Lloyd J.U.Kings American Dispensatory 1898 Yeong Him-Che; Handbook of Chinese Herbs and formulas. Institute of Chinese Medicine (15)