MAX Enteric Parasite Panel

Transkript

1 MAX Enteric Parasite Panel Avsedd för in vitro-diagnostik P0219(01) För användning tillsammans med BD MAX-systemet Svenska 4 I AVSEDD ANVÄNDNING BD MAX Enteric Parasite Panel (BD MAX-panel för detektion av enteriska parasiter) som körs på BD MAX-systemet är ett automatiserat in vitro-diagnostiskt test för direkt kvalitativ detektion av enteriska parasitiska patogener. BD MAX Enteric Parasite Panel detekterar nukleinsyror från: Giardia lamblia Cryptosporidium (endast C. hominis och C. parvum) Entamoeba histolytica Testen utförs på avföringsprover utan konserveringsmedel eller som fixerats i 10 % formalin från symptomatiska patienter med misstänkt gastroenterit, enterit eller kolit. Analysen är avsedd som ett stöd vid diagnos av gastrointestinal infektion i kombination med klinisk bedömning och andra laboratorieresultat. Testet utförs direkt på provet genom användning av polymeraskedjereaktion (PCR) för amplifieringen av specifika mål. Testet använder fluorogena genspecifika hybridiseringsprober för detektion av amplifierat DNA. Detta test är avsett att användas, i kombination med kliniska symptom, laboratorieresultat och epidemiologisk information, som ett stöd för differentialdiagnostik av infektioner från Giardia lamblia, Cryptosporidium hominis och C. parvum samt Entamoeba histolytica. Resultatet av detta test ska inte användas som enda grund för diagnos, val av behandling eller andra beslut som rör patienten. Positiva resultat utesluter inte blandinfektion med andra organismer som inte detekteras med detta test, och kanske inte är den enda eller definitiva orsaken till patientens sjukdom. Negativa resultat i närvaro av klinisk sjukdom som är kompatibel med gastroenterit och/eller kolit kan bero på infektion av patogener som inte detekteras med detta test eller icke-infektiösa orsaker, exempelvis ulcerös kolit, irritabel tarmsyndrom (IBS) eller Crohns sjukdom. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV FÖRFARANDET Organismer som kan orsaka enteriska sjukdomar utgör en signifikant orsak till morbiditet och mortalitet över hela världen. Enteriska infektioner kommer in i kroppen via mag-tarmkanalen och sprids vanligtvis via livsmedel och vatten som kontaminerats eller via kontakt med uppkastningar eller avföring. CDC (Center for Disease Control and Prevention i USA) uppskattar att 48 miljoner sjukdomsfall i USA varje år är livsmedelsrelaterade, vilket resulterar i sjukhusvistelser och dödsfall. 1 I utvecklingsländerna orsakar dessa sjukdomar cirka 2,5 miljoner dödsfall årligen hos unga barn. 2 Var och en av de sjukdomsalstrande agenserna kan ge något olika symptomatologi, inklusive kramper eller smärta i magen, bristande aptit, illamående eller kräkningar. Dock resulterar alla i diarré. 3 Upprepade diarréanfall och bestående diarrésjukdom stör tarmens funktion och upptagningsförmåga, vilket kan leda till undernäring och tillväxthämning hos barn. 4 Etiologierna för diarré inkluderar virus, bakterier och parasiter. Giardia lamblia, Cryptosporidium hominis och C. parvum samt Entamoeba histolytica anses vara viktiga parasiter som orsakar diarré. Alla dessa organismer överförs på fekal-oral väg genom konsumtion av livsmedel eller vatten som kontaminerats och är ofta associerade med utbrott. Globalt sett är Giardia en av de oftast identifierade parasiterna som associeras med vattenburna sjukdomsutbrott. 5 Giardiasis kännetecknas av diarré, magkramper, uppblåsthet, viktnedgång och malabsorption. Enteriska sjukdomar, allergier och reaktiv artrit har associerats med giardiasis. Sjukdomen är vanligtvis självbegränsande och asymptomatiska infektioner kan också uppstå. Cryptosporidium hominis och C. parvum orsakar kryptosporidios, vilket kännetecknas av vattniga diarréer som åtföljs av magkramper, feber, illamående, kräkningar och viktnedgång. Hos immunsupprimerade patienter kan kolangit eller pankreatit utvecklas som ett resultat av infektionen. 5,6 Asymptomatiska infektioner kan dock också uppstå. Infektioner med Entamoeba histolytica är ofta asymptomatiska. När symptomen uppstår är det vanligt med lindrig till svår diarré och uppblåsthet. När sjukdomen består kan den vidareutvecklas till att inkludera viktnedgång och trötthet. 6 Infektioner med Entamoeba histolytica kan även bli invasiva och resultera i vävnadsdestruktion och leverabscess. 7 1

2 Detektion av dessa parasiter via mikroskopi är okänsligt och kräver avsevärda resurser i form av tid, utrustning och utbildning. Mikroskopi kan dessutom inte särskilja Entamoeba histolytica från dess icke-patogena species Entamoeba dispar. 8 PCR är känsligare än traditionella metoder och kan möjligen medföra en tidigare detektion, vilket kan minska behovet av att testa flera avföringsprover och förbättra patientens behandling samt infektionskontrollen. 9 BD MAX Enteric Parasite Panel är en multiplex analys som samtidigt och differentiellt detekterar Giardia lamblia, Cryptosporidium hominis och C. parvum samt Entamoeba histolytica. BD MAX Enteric Parasite Panel kan, när den används tillsammans med BD MAX-systemet, generera ett resultat för 24 prover på cirka 4,5 timmar. BD MAX Enteric Parasite Panel effektiviserar och förenklar testningsprocessen genom att eliminera behovet av manuella åtgärder från den tidpunkt då provet placeras i BD MAXsystemet tills resultaten är klara. Ett avföringsprov samlas in och transporteras till laboratoriet, homogeniseras och loopas till ett BD MAX Enteric Parasite Panel Sample Buffer Tube (provbuffertrör, SBT). Provbuffertröret stängs med ett membranlock och värms sedan upp i BD Pre-warm Heater (förvärmningsvärmare) för att underlätta lysering av parasitorganismerna. Provbuffertröret vortexblandas sedan och överförs till BD MAX-systemet, där följande automatiserade processer sker: cellerna lyseras, nukleinsyror extraheras till magnetiska kulor och koncentreras och sedan tillsätts en alikvot av de eluerade nukleinsyrorna till PCR-reagenser som innehåller de målspecifika primrar som används för att amplifiera de genetiska målen i BD MAX PCR Cartridge (BD MAX PCR-kassett), om förekommande. I analysen ingår också en Sample Processing Control (provbearbetningskontroll, SPC). Provbearbetningskontrollen finns i extraktionsröret och genomgår extraktions-, koncentrations- och amplifieringsstegen för att övervaka förekomsten av eventuella inhibitoriska substanser samt processineffektivitet på grund av instrument- eller reagensfel. Det behövs inga manuella åtgärder av operatören när provet, BD MAX Unitized Reagent Strip (BD MAX sammansatt reagensremsa) och PCR-kassetten väl är insatta i BD MAX-systemet. BD MAX-systemet automatiserar provlyseringen, extraktion och koncentration av nukleinsyror, reagensrehydrering, nukleinsyraamplifiering och detektion av målnukleinsyrasekvensen med polymeraskedjereaktion (PCR) i realtid. Amplifierade mål detekteras med hydrolysprober märkta med dämpade fluoroforer. Amplifieringen, detektionen och tolkningen av signalerna görs automatiskt av BD MAX-systemet. PRINCIPER FÖR METODEN Avföringsprover samlas in från patienter och transporteras till laboratoriet utan konserveringsmedel i en ren behållare (utan konserveringsmedel) eller fixerade med 10 % formalin. Provet vortexblandas och en 10 µl ögla förs in till öglans djup i provet, och exprimeras med en snurrande rörelse till ett BD MAX-provbuffertrör. Provbuffertröret stängs med ett membranlock och värms sedan upp i BD Pre-warm Heater (förvärmningsvärmare) för att underlätta lysering av parasitorganismerna. Provbuffertröret vortexblandas sedan och överförs till BD MAX-systemet. När arbetslistan har genererats och provet laddas i BD MAX-instrumentet med en sammansatt reagensremsa för BD MAX Enteric Parasite Panel och en PCR-kassett startas körningen och inga ytterligare åtgärder från operatören krävs. BD MAX-systemet automatiserar provberedningen, inklusive lysering av målorganism, DNA-extraktion och -koncentration, reagensrehydrering, målnukleinsyrasekvensamplifiering och detektion med PCR i realtid. Tolkningen av signalen utförs automatiskt av BD MAX-systemet. Analysen inkluderar också en provbearbetningskontroll (SPC, Sample Processing Control) som ingår i extraktionsröret och som genomgår extraktions-, koncentrations- och amplifieringssteg. Provbearbetningskontrollen är integrerad i lyserings-, extraktions-, koncentrations- och amplifieringsstegen för att övervaka förekomsten av eventuella inhibitoriska substanser samt system- eller reagensfel. Efter enzymatisk cellysering vid förhöjd temperatur fångas de frigjorda nukleinsyrorna på magnetiska affinitetskulor. Kulorna med de bundna nukleinsyrorna tvättas med tvättbuffert och nukleinsyrorna elueras med värme och högt ph i elueringsbuffert. Eluerat DNA neutraliseras och överförs till mastermixröret för att rehydrera PCR-reagenserna. Efter rehydrering dispenserar BD MAX-systemet en bestämd volym PCR-färdig lösning i BD MAX PCR-kassetten. Mikroventiler i BD MAX PCR-kassetten försluts av systemet innan PCR initieras för att bibehålla amplifieringsblandningen och därmed förebygga avdunstning och kontamination. De amplifierade DNA-målen detekteras med hydrolysprober (TaqMan), märkta i ena änden med ett fluorescerande färgämne (fluorofor), och i den andra med ett inhiberande fragment. Prober märkta med olika fluoroforer används till att detektera amplikoner för enteriska parasitmål och provbearbetningskontrollen i fyra olika optiska kanaler i BD MAX-systemet. Målamplikoner för Giardia lamblia detekteras i FAM-kanalen, målamplikoner för Cryptosporidium hominis/parvum detekteras i ROX-kanalen, målamplikoner för Entamoeba histolytica detekteras i VIC-kanalen och provbearbetningskontrollamplikoner detekteras i Cy5.5-kanalen. När proberna är i sitt nativa tillstånd inhiberas fluorescensen i fluoroforen p.g.a. dess närhet till inhiberaren. I närvaro av mål-dna hybridiserar dock proberna till sina komplementära sekvenser och hydrolyseras av DNA-polymerasens 5 3 -exonukleasaktivitet när den syntetiserar den begynnande strängen längs DNA-mallen. Till följd av detta separeras fluoroforerna från inhiberarmolekylerna och fluorescens avges. BD MAX-systemet övervakar dessa signaler vid varje cykel och tolkar data i slutet av programmet för att rapportera det slutliga resultatet. 2

3 REAGENSER OCH MATERIAL REF Innehåll Kvantitet BD MAX Enteric Parasite Master Mix (A7) Ugnstorkad PCR-mastermix innehållande TaqMan-specifika molekylärprober och primrar tillsammans med TaqMan-prob och primrar som är specifika för provbearbetningskontrollen. BD MAX Enteric Parasite Unitized Reagent Strips Sammansatt reagensremsa som innehåller alla de flytande reagenser och pipettspetsar för engångsbruk som behövs för DNA-extraktion. BD MAX Enteric Parasite Extraction Tube (B2) Ugnstorkad pellets som innehåller magnetiska DNA-affinitetskulor, proteasreagenser och provbearbetningskontroll. BD MAX Enteric Parasite Sample Buffer Tube Membranlock 25 MATERIAL SOM KRÄVS MEN EJ MEDFÖLJER BD Pre-warm Heater (BD Diagnostic Systems katalognr ) BD MAX PCR Cartridges (BD Diagnostic Systems katalognr ) VWR Multi-Tube Vortex Mixer eller motsvarande Vortex Genie 2 eller motsvarande Nalgene Cryogenic Vial Holder eller motsvarande Engångshandskar, utan talk 10 µl öglor (BD Diagnostic Systems katalognr ) För avföringsprover utan konserveringsmedel: Torra, rena behållare för insamling av avföringsprover För avföringsprover som fixerats i 10 % formalin: Behållare med 10 % formalin (15 ml) VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSBEAKTANDEN Fara 24 test 24 test 24 test 24 test H319 Orsakar allvarlig ögonirritation. H360 Kan skada fertiliteten eller det ofödda barnet. P280 Använd skyddshandskar/skyddskläder/ögonskydd/ansiktsskydd. P305+P351+P338 VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. P405 Förvaras inlåst. P501 Innehållet/behållaren ska kasseras i enlighet med lokala/regionala/nationella/internationella bestämmelser. BD MAX Enteric Parasite Panel är avsedd för in vitro-diagnostik. Allmänna hälsovårdsmyndigheter har publicerat riktlinjer för anmälan om rapporterbara sjukdomar inom sina områden, inklusive men inte begränsat till Giardia, Cryptosporidium och Entamoeba där nödvändiga åtgärder för verifiering av resultat fastställs i syfte att identifiera och spåra utbrott. Laboratorier ansvarar för att följa gällande riktlinjer för inlämning av kliniskt material eller isolat från positiva prover till statliga laboratorier. Försiktighetsbeaktande gällande rapportering till allmänna hälsovårdsmyndigheter: Kommunala och statliga riktlinjer för anmälan om rapporterbara sjukdomar uppdateras kontinuerligt och omfattar en rad organismer för övervakning och undersökning av utbrott. 18,19 När patogener från rapporterbara sjukdomar detekteras med ett odlingsoberoende diagnostiskt test (CIDT) rekommenderar CDC (Center for Disease Control i USA) dessutom att laboratoriet ska underlätta insamlingen av isolatet eller det kliniska materialet för inlämning till lämplig allmän hälsovårdsmyndighet som hjälp för att detektera utbrott och för epidemiologiska undersökningar. Alla laboratorier ansvarar för att följa gällande riktlinjer och ska rådgöra med närmaste kommunal och/eller statlig hälsovårdsmyndighet vad gäller riktlinjer för inlämning av isolat och/eller kliniskt material. Använd inte utgångna reagenser och/eller material. Använd inte kitet om etiketten som förseglar ytterkartongen är bruten vid mottagandet. Använd inte reagenserna om skyddspåsarna är öppna eller trasiga vid mottagandet. Använd inte reagenserna om torkmedel saknas eller är trasigt inuti reagenspåsarna. Ta inte bort torkmedlet ur reagenspåsarna. Förslut reagensskyddspåsar med blixtlåset omedelbart efter varje användning. Tryck ut överflödig luft ur påsarna innan de försluts. Skydda reagenserna mot värme och fuktighet. Långvarig exponering för fuktighet kan påverka produktens prestanda. Använd inte reagenser om folien har öppnats eller skadats. Blanda inte reagenser från olika påsar och/eller kit eller loter. Alternera inte och återanvänd inte lock eftersom kontamination som kan äventyra testresultaten kan uppstå. 3

4 Kontrollera att de sammansatta reagensremsorna är korrekt fyllda (se till att vätskorna finns på rörens botten) (se figur 1). Undersök de sammansatta reagensremsorna för att säkerställa att alla pipettspetsar finns på plats (se figur 1). Hantera kemiska lösningar försiktigt eftersom de kan göra streckkoden på mastermix- och extraktionsrören oläslig. God laboratorieteknik är avgörande för att den här analysen ska fungera korrekt. På grund av testets höga analytiska känslighet måste stor noggrannhet iakttas för att bevara materialens och reagensernas färskhet. I fall där andra PCR-tester också utförs i samma generella område i laboratoriet måste försiktighet iakttas för att säkerställa att BD MAX Enteric Parasite Panel, eventuella övriga reagenser som behövs för testningen och BD MAX-systemet inte kontamineras. Undvik alltid mikrobiell kontamination och kontamination med deoxyribonukleas (DNas) av reagenserna. Byt handskar innan reagenser och kassetter hanteras. Förebygg kontamination av miljön med amplikoner genom att inte bryta isär BD MAX PCR-kassetterna efter användning. Förseglingarna på BD MAX PCR-kassetterna är utformade för att förebygga kontamination. Att utföra test med BD MAX Enteric Parasite Panel utanför de rekommenderade tidsintervallen kan ge ogiltiga resultat. Analyser som inte utförts inom det specificerade tidsintervallet bör upprepas. Ytterligare kontroller kan testas i enlighet med riktlinjer eller krav i lokala, kommunala, statliga och/eller nationella bestämmelser eller från ackrediteringsorganisationer. Hantera alltid prover som om de vore smittförande och i enlighet med säkra laboratorieförfaranden, till exempel de som beskrivs i CLSI-dokument M29 10 och i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 11 Använd skyddskläder och engångshandskar vid hantering av alla reagenser. Tvätta händerna noggrant efter testets utförande. Pipettera ej med munnen. Rök, drick, tugga eller ät inte i områden där prover eller kitreagenser hanteras. Kassera oanvända reagenser och avfall i enlighet med lokala, statliga, landstings- och/eller kommunala bestämmelser. Se BD MAX-systemets användarhandbok 12 för ytterligare varningar, försiktighetsbeaktanden och förfaranden. FÖRVARING OCH HÅLLBARHET Tagna prover, antingen utan konserveringsmedel eller avföringsprover som fixerats i 10 % formalin, ska förvaras i mellan 2 C och 25 C under transport. Skydda mot nedfrysning eller exponering för överdriven hetta. Prover, antingen utan konserveringsmedel eller avföringsprover som fixerats i 10 % formalin, kan förvaras i upp till 120 timmar (5 dagar) vid 2 8 C eller i upp till 48 timmar vid 2 25 C innan de testas. Före eller efter förvärmning kan inokulerade provbuffertrör förvaras för testning (eller omtestning) i totalt upp till: Tidpunkt Temperatur 120 timmar (5 dagar) 2 8 C 48 timmar 2 25 C BD MAX Enteric Parasite Panel-komponenterna är stabila vid 2 25 C fram till det angivna utgångsdatumet. Använd inte utgångna komponenter. BD MAX Enteric Parasite Panel-mastermix och -extraktionsrör levereras i förslutna påsar. Skydda produkten från fukt genom att omedelbart återförsluta påsarna efter att de öppnats. Reagensrör är stabila i upp till 14 dagar vid 2 25 C efter första öppnandet och återförslutningen av påsen eller till och med utgångsdatumet, beroende på vad som inträffar först. BRUKSANVISNING Provtagning och transport För att erhålla ett tillfredsställande prov måste provtagningsproceduren följas noggrant. Avföringsprover tas på följande sätt: Prover utan konserveringsmedel: Överför avföringsprovet till en torr, ren behållare. Undvik kontamination med vatten eller urin. Märk behållaren och transportera den till laboratoriet i enlighet med institutionens standardförfaranden (se avsnittet Förvaring och stabilitet). Undvik att få med toalettpapper, vatten eller tvål i provet. Prover som fixerats i 10 % formalin: Överför avföringsprovet till fixeringsenheten enligt tillverkarens instruktioner. Undvik kontamination med vatten eller urin. Märk behållaren och transportera den till laboratoriet i enlighet med institutionens standardförfaranden (se avsnittet Förvaring och stabilitet). Undvik att få med toalettpapper, vatten eller tvål i provet. Provberedning 1. Märk ett streckkodat BD MAX-provbuffertrör (genomskinligt lock) med lämplig providentifiering. Täck inte för streckkoden. 2. Vortexblanda prover utan konserveringsmedel eller som är fixerade vid hög hastighet i 15 sekunder. Var försiktig när vortexblandade prover öppnas eftersom material kan ha fastnat i behållarens lock. 3. Ta av det genomskinliga locket från provbuffertröret. 4. Inokulering av BD MAX-provbuffertrör: a. För avföringsprover utan konserveringsmedel: i. För in en 10 µl inokulationsögla för engångsbruk tills hela öglan är nedsänkt i provet. För inte in den längre än själva öglan eftersom ytterligare avföring på skaftet kan överbelasta PCR-reaktionen. ii. För in den laddade öglan i provbuffertröret och exprimera provet med en snurrande rörelse. iii. Ta bort och kassera öglan. OBS! Hela provet måste inte avlägsnas från öglan. Lösningen i provbuffertröret ska inte vara mörkare än "tefärgad". 4

5 b. För avföringsprover som fixerats i 10 % formalin: i. För in en 10 µl inokulationsögla för engångsbruk tills hela öglan är nedsänkt i provet. Det kan vara svårt för en stabil bubbla att bildas i öglan med fixerade prover. ii. För in den laddade öglan i provbuffertröret och exprimera provet med en snurrande rörelse. iii. Ta bort och kassera öglan. 5. Förslut provbuffertröret med ett blått membranlock. 6. Bered eventuella ytterligare prover som ska testas genom att upprepa steg 1 5, och gå sedan vidare till Användning av BD Pre-warm Heater. Användning av BD Pre-warm Heater (Se användarhandboken till BD Pre-warm Heater 13 för användarinstruktioner.) 1. Välj alternativet <BD MAX Ent Para 53> på panelen Run > Worklist (Körning > Arbetslista). 2. Välj kitlotnumret för BD MAX Enteric Parasite Panel (för lotspårning) (observera att informationen om kitlot måste scannas separat innan du letar upp motsvarande värde i arbetslistan). OBS! Kontrollera att spårning av lotnummer är aktiverat på skärmen Configuration (Konfiguration) > System. 3. Ange streckkoden från respektive BD MAX Enteric Parasite Panel-provbuffertrör i provrörsfältet med hjälp av streckkodsläsaren eller genom manuell inmatning tillsammans med patientens accessions-id. 4. Listan över väntande körningar uppdateras nu och en kryssruta för schemaläggning av förvärmning visas. 5. Schemalägg provet genom att markera kryssrutan i arbetslistan. 6. Placera BD MAX Enteric Parasite Panel-provbuffertröret (med provet) i BD Pre-warm Heater. Stationen rymmer upp till 24 provbuffertrör. 7. Stäng locket på BD Pre-warm Heater och välj Start Pre-warm (Starta förvärmning) på panelen Run > Worklist (Körning > Arbetslista). En särskild uppvärmnings- och kylningsprofil för BD MAX Enteric Parasite Panel startas. OBS! Bekräfta att rören rent fysiskt är placerade i BD Pre-warm-stället och att stället laddades i BD Pre-warm Heater, och välj sedan OK i meddelandet Start Pre-warm (Starta förvärmning). 8. Hur lång tid som återstår av förvärmningen visas på skärmen Status och på arbetslisteskärmen visas förvärmningen som In progress (Pågår). 9. På arbetslisteskärmen visas det valda provet/testet som Prewarm Complete (Förvärmning slutförd) när förvärmningen slutförts. 10. När förvärmningssteget har slutförts, ta ut provbuffertröret ur BD Pre-Warm Heater och vortexblanda hastigt varje provbuffertrör i fem sekunder eller placera alla provbuffertrör i en vortexblandare i upp till 1 minut. 11. Fortsätt med Användning av BD MAX-systemet för att ställa in BD MAX-systemets ställ. OBS! Om förvärmningssteget skulle misslyckas visas Failed/Cooling (Misslyckades/Kyler) som status för BD MAXsystemets timer. Förvärmningssteget kanske måste upprepas före testning i BD MAX-systemet. Se arbetslisteskärmen när kylningssteget för förvärmningen har slutförts med misslyckat resultat. Om Failed (Misslyckades) visas som status för förvärmningen av de aktuella proverna måste förvärmningssteget upprepas. Om Complete (Slutfört) visas som status för förvärmningen går det att fortsätta med testningen av de här rören med BD MAX Enteric Parasite Panel. OBS! BD MAX Enteric Parasite Panel kan endast utföras när förvärmningssteget ovan har slutförts korrekt. Prover som har genomgått förvärmningscykeln behöver inte värmas upp igen om det skulle vara nödvändigt att upprepa testet (se avsnittet Förvaring och stabilitet). OBS! För laboratorier med flera BD MAX-system och BD Pre-warm Heaters måste prover testas och/eller testas om på samma BD MAX-system som förvärmningssteget utfördes på. OBS! Efter förvärmning måste testning av BD MAX Enteric Parasite Panel utföras inom de tidsintervall som anges under Förvaring och stabilitet. Om det krävs omtestning ska proven vortexblandas igen. Användning av BD MAX-systemet OBS! Se BD MAX-systemets användarhandbok 12 för detaljerade anvisningar (avsnittet Användning). OBS! Ett (1) provbuffertrör, ett (1) membranlock, en (1) mastermix (A7), ett (1) extraktionsrör (B2) och en (1) sammansatt reagensremsa krävs för varje prov och varje extern kontroll som ska testas. Ta ut det antal av BD MAX-komponenterna som krävs ur deras skyddspåsar eller kartonger. Förvara öppnade mastermix- eller extraktionsrörspåsar genom att trycka ut överflödig luft och försluta dem med blixtlåset, och säkerställ att påsen med torkmedel finns i skyddspåsen. 1. Starta BD MAX-systemet (om det inte redan är på) och logga in genom att ange <användarnamn> och <lösenord>. 2. Byt handskar innan reagenser och kassetter hanteras. 3. Ta ut önskat antal sammansatta reagensremsor ur BD MAX Enteric Parasite Panel-kitet. Knacka försiktigt varje sammansatt reagensremsa mot en hård yta för att säkerställa att alla vätskor finns på rörens botten. 4. Ta ut önskat antal extraktionsrör och mastermixrör ur deras skyddspåsar. Tryck ut överflödig luft och förslut påsarna med blixtlåset. 5. För varje prov som ska testas ska en (1) sammansatt reagensremsa placeras på BD MAX-systemets ställ med början i position 1 i ställ A. 6. Kläm fast ett (1) extraktionsrör (vit folie) i varje sammansatt reagensremsa i position 1 enligt figur Kläm fast ett (1) mastermixrör (grön folie) i varje sammansatt reagensremsa i position 2 enligt figur 1. 5

6 Figur 1: Kläm fast BD MAX Enteric Parasite Panel-extraktionsrör och -mastermixrör i de sammansatta reagensremsorna Sätt provbuffertrören i BD MAX-systemets ställ som motsvarar de sammansatta reagensremsorna som sattes samman i steg 5 till 7. OBS! Sätt provbuffertrören i provstället/-en med 1D-streckkodsetiketterna vända utåt (det underlättar skanning av provrören vid inloggning av proverna). Sätt tillämpligt antal BD MAX PCR-kassetter i BD MAX-systemet (se figur 2). Varje kassett kan användas till 2 körningar med upp till 12 prover, alltså sammanlagt 24 prover. BD MAX-systemet väljer automatiskt position och rad i PCR-kassetten för varje körning. PCR-kassetter används baserat på körning OCH ställ (2 körningar per kassett och 1 kassett per ställ). Figur 2: Ladda BD MAX PCR-kassetter. 10. Ladda ställ i BD MAX-systemet (se figur 3). Sida A Sida B Figur 3: Ladda ställ i BD MAX-systemet. 6 Revision: 01 Change #: Version: A Classification: Restricted

7 11. Stäng BD MAX-systemets lock och klicka på <Start> (Starta) för att påbörja bearbetningen. 12. Kontrollera resultaten omedelbart efter körningen eller förvara provbuffertrören vid 2 8 C i upp till 120 timmar (5 dagar) ELLER vid 2 25 C i högst 48 timmar tills resultaten har kontrollerats. OBS! Om ett membranlock skadas under körningen ska det bytas ut mot ett nytt innan provet förvaras. OBS! Beredda BD MAX Enteric Parasite Panel-provbuffertrör kan förvaras vid 2 8 C i högst 120 timmar (5 dagar) ELLER vid 2 25 C i högst 48 timmar när provet har tillförts i provbuffertröret. Om resultatet är Indeterminate (IND (OBEST.)), Unresolved (UNR (OLÖST)) eller Incomplete (INC (OFULLST.)), eller om ett externt kontrollfel inträffar måste ett test från det beredda provbuffertröret upprepas inom denna tidsram (se avsnittet Upprepa testförfarande). KVALITETSKONTROLL Med procedurer för kvalitetskontroll övervakas analysens prestanda. Laboratorier måste fastställa antal, typ av och intervall för tester av kontrollmaterial i enlighet med riktlinjer eller krav utfärdade av lokala, landstings-, statliga och/eller kommunala bestämmelser eller från ackrediteringsorganisationer. För allmänna riktlinjer om kvalitetskontroll kan användaren konsultera CLSI MM3 14 och EP Material till externa kontroller tillhandahålls inte av BD. Externa positiva och negativa kontroller används inte av BD MAXsystemets programvara för tolkning av testresultat. Externa kontroller behandlas som om de vore patientprover. Se tabellen i avsnittet Resultattolkning för tolkning av analysresultat från externa kontroller. 2. En (1) extern positiv kontroll och en (1) extern negativ kontroll bör köras minst dagligen tills adekvat processvalidering uppnås på BD MAX-systemet i varje laboratoriemiljö. Minskad frekvens av kontrolltestning ska göras i enlighet med tillämpliga föreskrifter. 3. Den externa positiva kontrollen används för att övervaka förekomsten av större reagensfel. Den externa negativa kontrollen är avsedd för att detektera reagens- eller miljökontamination (eller överföring) av målnukleinsyror. 4. Olika typer av externa kontroller rekommenderas så att användaren kan välja den som passar kvalitetskontrollprogrammet i deras laboratorium bäst. a. Extern negativ kontroll: Ett icke-inokulerat BD MAX Enteric Parasite Panel-provbuffertrör. BD rekommenderar att den externa negativa kontrollen bereds före den externa positiva kontrollen i syfte att minska risken för kontamination på grund av kontrollberedningen. b. Extern positiv kontroll: BD rekommenderar att genomiskt DNA används för beredningar enligt tabell 1 nedan för på grund av brist på kommersiellt tillgängliga oocystor/cystor för alla mål och besvärliga odlingsmetoder för den trofozoita formen av målorganismerna. Tabell 1: Kommersiellt tillgängliga stammar för extern positiv kontroll Extern positiv kontrollstam Giardia intestinalis (Lambl) (ATCC 30888D) Cryptosporidium parvum (ATCC PRA-67D) Entamoeba histolytica (ATCC 30459D) Genomisk DNA-koncentration pg/ml pg/ml 150 pg/ml OBS! Vid förvaring enligt tillverkarens rekommendationer kan de kvantifierade lösningarna med genomiskt DNA användas för att bereda flera trippelblandningar enligt instruktionerna nedan. (1) Om materialet erhålls i torkad form ska innehållet i flaskan rehydreras enligt leverantörens produktblad. 50 µl av 1X TE-buffert (10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph=8,0, molekylärbiologiskt graderat) rekommenderas för rehydrering. (2) Kvantifiera varje DNA-beredning genom spektrofotometri med absorbans på 260 nm. (3) Bered en trippelblandning av de tre DNA-beredningarna genom seriell utspädning i 1X TE-buffert i enlighet med de slutgiltiga koncentrationerna av genomiskt DNA i tabellen ovan. (4) Vortexblanda lösningen så att den blandas väl och pipettera 10 µl av lösningen till motsvarande BD MAX Enteric Parasite Panel-provbuffertrör med hjälp av en kalibrerad pipett. Genomiskt DNA från varje målorganism presenteras som 5X av dess specifika LoD (detektionsgräns) i provbuffertröret. (5) Förslut provbuffertröret med ett blått membranlock och vortexa röret i fem sekunder. 5. Alla externa kontroller bör ge förväntade resultat (positiva för en extern positiv kontroll eller negativa för en extern negativ kontroll) och inga misslyckade externa kontroller (olösta, obestämda eller ofullständiga resultat). 6. En extern negativ kontroll som ger ett positivt testresultat är indikativt för en incident med provhantering och/eller kontamination. Granska provhanteringstekniken för att undvika sammanblandning och/eller kontamination. En extern positiv kontroll som ger ett negativt resultat är indikativt för problem med provhantering/beredning eller reagensfel. Granska provhanterings-/beredningstekniken. 7. En extern kontroll som ger ett tveksamt, obestämt eller ofullständigt resultat är indikativt för ett reagens- eller BD MAXsystemfel. Kontrollera om några felmeddelanden visas på BD MAX-systemets bildskärm. Se avsnittet Översikt över systemfel i BD MAX-systemets användarhandbok 12 för tolkningar av varnings- och felkoder. Om problemet kvarstår, använd reagenser från en oöppnad påse eller använd ett nytt analyskit. 7

8 8. Varje extraktionsrör innehåller en provbearbetningskontroll som är en plasmid med en syntetisk mål-dna-sekvens. Provbearbetningskontrollen extraheras, elueras och amplifieras tillsammans med eventuellt DNA i det bearbetade provet, vilket säkerställer analysens förutsägbarhet. Provbearbetningskontrollen övervakar effektiviteten i insamling, tvättning och eluering av DNA under provbearbetningen, samt effektiviteten i amplifiering och detektion av DNA under PCR-analysen. Om resultatet av provbearbetningskontrollen inte uppfyller kriterierna för godkännande rapporteras resultatet av provet som olöst, medan positiva (POS) analysresultat rapporteras och inga mål kommer att anges som negativa (NEG). Ett olöst resultat är indikativt för en provrelaterad inhibering eller ett reagensfel. Upprepa ett prov som rapporteras som olöst enligt avsnittet Upprepa testförfarande nedan. RESULTATTOLKNING Resultat finns på fliken <Results> (Resultat) i fönstret <Results> (Resultat) på BD MAX-systemets bildskärm. Testresultaten tolkas automatiskt av BD MAX-systemets programvara. Resultaten rapporteras för var och en av analyterna och för provbearbetningskontrollen. Ett testresultat kan kallas NEG (negativt), POS (positivt) eller UNR (olöst) baserat på målets amplifieringsstatus och provbearbetningskontrollen. IND (obestämt) eller INC (ofullständigt) resultat beror på ett BD MAX-systemfel. I händelse av ett partiellt olöst resultat (UNR) där ett eller flera mål har ett POS-resultat och alla andra mål har ett UNR-resultat kommer inga mål att anges som NEG. Tabell 2: Tolkning av resultat från BD MAX Enteric Parasite Panel Rapporterat analysresultat Tolkning av resultat a Glamb POS Giardia lamblia-dna detekterat Glamb NEG Glamb UNR Crypto POS Inget Giardia lamblia-dna detekterat Olöst inhiberande prov eller reagensfel, ingen amplifiering av mål eller provbearbetningskontroll Cryptosporidium parvum- eller hominis-dna detekterat Crypto NEG Crypto UNR Ehist POS Inget Cryptosporidium parvum- eller hominis-dna detekterat Olöst inhiberande prov eller reagensfel, ingen amplifiering av mål eller provbearbetningskontroll Entamoeba histolytica-dna detekterat Ehist NEG Ehist UNR IND INC Inget Entamoeba histolytica-dna detekterat Olöst inhiberande prov eller reagensfel, ingen amplifiering av mål eller provbearbetningskontroll Obestämt resultat beror på BD MAX-systemfel (med varnings- eller felkoder b ) Ofullständig körning (med varnings- eller felkoder b ) a BD MAX Enteric Parasite Panel-resultat kan användas som vägledning för nivån av försiktighetsbeaktanden enligt institutionens rutiner och praxis. b Se avsnittet Felsökning i BD MAX-systemets användarhandbok 12 för tolkningar av varnings- och felkoder. 8

9 UPPREPA TESTFÖRFARANDE OBS! Det finns endast tillräckligt med provvolym i provbuffertröret för en upprepad körning. Provbuffertrör som förvarats i 2 25 C måste testas om inom 48 timmar efter den inledande inokulationen av provbuffertröret med provet och förvärmning. Alternativt, provbuffertrör som förvarats vid 2 8 C måste testas om inom 120 timmar (5 dagar). Återstående avföringsprov kan också användas för upprepat test inom 5 dagar efter tagningen om det förvaras vid 2 8 C eller inom 48 timmar om det förvaras vid 2 25 C. OBS! Nya prover kan testas i samma körning som de upprepade proverna. Olöst resultat Olösta resultat kan uppstå om en provrelaterad inhibering eller ett reagensfel förhindrar att målet eller provbearbetningskontrollen amplifierar korrekt. Om provbearbetningskontrollen inte amplifierar rapporteras provet som UNR, medan positiva (POS) analysresultat rapporteras och inga mål kommer att anges som negativa (NEG). BD MAX-systemet rapporterar resultat för respektive mål separat och ett UNR-resultat kan erhållas för ett eller flera BD MAX Enteric Parasite Panel-mål. I händelse av ett fullständigt UNR-resultat där alla mål har ett UNR-resultat måste testet upprepas. I händelse av ett partiellt UNR-resultat där ett eller flera mål har ett POS-resultat och andra mål har ett UNR-resultat rekommenderas det att testet upprepas enligt beskrivningen ovan. I sällsynta fall kan avvikande resultat observeras när ett upprepat test körs för de mål som inledningsvis rapporterades som POS. Följ lämpliga procedurer i enlighet med gällande laboratorieprocedurer. Prover kan upprepas från sina motsvarande provbuffertrör inom de tidsramar som anges ovan. Vortexblanda proverna i en (1) minut och starta om från avsnittet Användning av BD MAX-systemet. Återstående avföringsprov kan också användas för upprepade test med ett nytt provbuffertrör inom de tidsramar som anges ovan. Starta om från avsnittet Provberedning. Obestämt resultat Obestämda resultat kan uppstå i händelse av systemfel. Prover kan upprepas från sina motsvarande provbuffertrör inom de tidsramar som anges ovan. Vortexblanda proverna i en (1) minut och starta om från avsnittet Användning av BD MAX-systemet. Återstående avföringsprov kan också användas för upprepade test med ett nytt provbuffertrör inom den tidsram som anges ovan. Starta om från avsnittet Provberedning. För tolkningar av varnings- och felkodmeddelanden, se BD MAX-systemets användarhandbok 12 (avsnittet Felsökning). Ofullständigt resultat Ofullständiga resultat kan uppstå om provberedningen eller PCR inte kunde slutföras. Prover kan upprepas från sina motsvarande provbuffertrör inom de tillåtna tidsramar som anges ovan. Vortexblanda proverna i en (1) minut och starta om från avsnittet Användning av BD MAX-systemet. Återstående avföringsprov kan också användas för upprepade test med ett nytt provbuffertrör inom de tidsramar som anges ovan. Starta om från avsnittet Provberedning. För tolkningar av varnings- och felkodmeddelanden, se BD MAX-systemets användarhandbok 12 (avsnittet Felsökning). Externt kontrollfel Externa kontroller bör ge förväntade resultat när de testas. Om prover måste upprepas p.g.a. ett felaktigt resultat från extern kontroll ska de upprepas från sina provbuffertrör tillsammans med nyberedda externa kontroller inom de tidsramar som anges ovan. Vortexblanda proverna i en (1) minut och starta om från avsnittet Användning av BD MAX-systemet. Förvärmningsfel I händelse av ett förvärmningsfel ska berörda provbuffertrör lämnas kvar i förvärmningsstationen under hela kylningscykeln på 30 minuter. När kylningscykeln har slutförts, starta om förvärmningsproceduren med samma provbuffertrör enligt instruktionerna i avsnittet Användning av BD Prewarm Heater, under förutsättning att provbuffertrören är godkända med avseende på tidsgränserna som anges i avsnittet Förvaring och stabilitet. Om provbuffertrören inte är godkända med avseende på tidsgränsen som definieras i Förvaring och stabilitet, bered nya provbuffertrör från den ursprungliga provet genom att börja om från avsnittet Provberedning. PROCEDURENS BEGRÄNSNINGAR Denna produkt är endast avsedd för användning med humana avföringsprover utan konserveringsmedel eller som fixerats i 10 % formalin. Avföringsprover från rektala pinnprover och avföring som är kontaminerad med barium har inte validerats med BD MAX Enteric Parasite Panel. Felaktiga testresultat kan uppstå till följd av felaktig provtagning, hantering, förvaring, tekniskt fel, sammanblandning av prover eller p.g.a. att antalet organismer i provet är lägre än testets analytiska känslighet. Om resultatet från BD MAX Enteric Parasite Panel är IND (OBEST.), INC (OFULLST.) eller UNR (OLÖST) ska testet upprepas. Ett positivt resultat från BD MAX Enteric Parasite Panel indikerar inte alltid förekomst av viabla organismer. Det indikerar dock förekomst av DNA från Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium hominis eller Entamoeba histolytica, vilket gör att BD MAX Enteric Parasite Panel-organismerna kan identifieras. Mutationer eller polymorfismer i primer- eller probbindande regioner kan påverka detektionen av målorganismerna, vilket kan ge ett falskt negativt resultat med BD MAX Enteric Parasite Panel. Som med alla PCR-baserade in vitro-diagnostiska test kan extremt låga nivåer av målet under den analytiska sensitiviteten detekteras utan att resultaten är reproducerbara. Falskt negativa resultat kan uppstå p.g.a. förlust av nukleinsyra till följd av felaktig provtagning, transport eller förvaring av proverna, eller p.g.a. inadekvat lysering av organismer. Provbearbetningskontrollen har lagts till för att bidra till identifiering av prover som innehåller inhiberare av PCR-amplifiering. Provbearbetningskontrollen indikerar inte om nukleinsyran har förlorats p.g.a. inadekvat provtagning, transport eller förvaring av proverna, eller om bakterieceller har lyserats inadekvat. Resultat från BD MAX Enteric Parasite Panel ska användas som ett komplement till kliniska observationer och annan information som läkaren har tillgång till. 9

10 Som med alla in vitro-diagnostiska test beror positiva och negativa prediktiva värden i hög grad på prevalens. Prestanda hos BD MAX Enteric Parasite Panel kan variera beroende på prevalens och den population som testas. BD MAX-provbuffertrör är inte avsedda att kunna användas vid undersökning av organismens morfologi. Morfologisk undersökning och/eller färgning måste utföras med material från det ursprungliga provet. Prestanda för detta test har inte fastställts för uppföljning av behandling av Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium hominis eller Entamoeba histolytica. BD MAX Enteric Parasite Panel är avsedd för att detektera DNA från C. hominis och C. parvum utan att särskilja mellan dessa två species. Detta test är inte avsett för att detektera DNA från andra species av Cryptosporidium. Detta test är ett kvalitativt test som varken ger kvantitativa värden eller indikerar kvantiteten på befintliga organismer. Prestanda för detta test har inte utvärderats med immunsupprimerade personer eller patienter utan symptom på gastrointestinal infektion. Effekten av interferens orsakad av andra substanser har endast utvärderats för de substanser som anges i avsnittet Interfererande substanser nedan. Potentiell interferens har inte utvärderats för andra substanser än de som beskrivs i avsnittet Interfererande substanser. Korsreaktivitet med andra organismer än de som anges i avsnittet Analytisk specificitet nedan har inte utvärderats. KLINISKA PRESTANDA Kliniska prestanda för BD MAX Enteric Parasite Panel fastställdes i en undersökande multicenterstudie. I studien ingick totalt fem (5) kliniska laboratorier där prover togs som en del av den rutinmässiga patientvården, inkluderades i studien och testades med BD MAX Enteric Parasite Panel. Ytterligare sju (7) provtagningsställen inkluderade prover som skulle utvärderas på centralt håll. Proverna erhölls från pediatriska eller vuxna patienter med misstanke om akut gastroenterit eller kolit för vilka diagnostiska tester för målorganismen hade beställts av en vårdgivare. För prospektiva prover användes en standardiserad referensmetod (mikroskopi med direkt fluorescerande antikroppar (DFA) och trikromfärgning) för identifiering av enteriska parasitiska patogener följt av en alternativ PCR- och dubbelriktad sekvensieringsanalys, som inbegrep den sammansatta referensmetoden. Eftersom DFA identifierar Cryptosporidium på genusnivå ansågs DFA-positiva prover som identifierades med dubbelriktad sekvensiering som andra än C. hominis eller C. parvum som negativa enligt referensmetoden. Testning med referensmetoden utfördes i enlighet med bipacksedeln för respektive produkt. För retrospektiva prover noterades de historiska resultaten på insamlingsstället och proverna utvärderades inte igen. De historiska resultaten bekräftades med hjälp av en alternativ PCR- och dubbelriktad sekvensieringsmetod som en del av den sammansatta referensmetoden i syfte att bekräfta förekomsten av mål-dna. Totalt prospektiva prover (1 128 fixerade i 10 % formalin, utan konserveringsmedel och 18 ej godkända) och 411 retrospektiva prover (148 fixerade i 10 % formalin, 251 utan konserveringsmedel och 12 ej godkända) ingick i den kliniska utvärderingen. I tabell 3 beskrivs antalet godkända prover som ingick utifrån patientens ålder och provtyp. Totalt 128 retrospektiva prover ingick inte i prestandaberäkningarna nedan eftersom de historiska resultaten inte kunde bekräftas med en alternativ PCRoch dubbelriktad sekvensieringsmetod. I tabell 4 till 7 beskrivs de kliniska prestanda för BD MAX Enteric Parasite Panel som observerades under den kliniska studien. Tabell 3: Sammanfattning av godkända prover i den kliniska studien utifrån åldersgrupp och provtyp Åldersgrupp Provtyp 10 % formalin Utan konserveringsmedel Kombinerat 0 1 månad månad till 2 år år år år Över 21 år Okänt Totalt

11 När det gäller prover som fixerats i 10 % formalin identifierades 95,5 % respektive 99,7 % av de prospektiva Giardia lamblia-positiva och -negativa proverna och 100 % respektive 100 % av de retrospektiva positiva och negativa proverna med BD MAX Enteric Parasite Panel. När det gäller prover utan konserveringsmedel identifierades 94,4 % respektive 100 % av de prospektiva Giardia lamblia-positiva och -negativa proverna och 98,6 % respektive 94,9 % av de retrospektiva positiva och negativa proverna med BD MAX Enteric Parasite Panel (tabell 4). Tabell 4: Giardia lamblia kliniska prestanda Provtyp Provets ursprung BD MAX Enteric Parasite Panel P RM N Totalt Fixerat i 10 % formalin Utan konserveringsmedel Prospektivt Retrospektivt Prospektivt Retrospektivt P N Totalt SENSITIVITET (95 % KI): 95,5 % (78,2 %, 99,2 %) SPECIFICITET (95 % KI): 99,7 % (99,1 %, 99,9 %) P N Totalt PPA (95 % KI): 100,0 % (93,5 %, 100,0 %) NPA (95 % KI): 100,0 % (94,9 %, 100,0 %) P N Totalt SENSITIVITET (95 % KI): 94,4 % (74,2 %, 99,0 %) SPECIFICITET (95 % KI): 100,0 % (99,4 %, 100,0 %) P ,6 79 N Totalt PPA (95 % KI): 98,6 % (92,6 %, 99,8 %) NPA (95 % KI): 94,9 % (89,8 %, 97,5 %) 1 Resultatet av det alternativa PCR- och dubbelriktade sekvensieringssteget i referensmetoden var negativt för detta prov. DFA-steget i referensmetoden var positivt. Upprepad testning vid avvikande resultat med en alternativ PCR- och dubbelriktad sekvensieringsmetod utfördes och fick ett negativt resultat. Upprepad testning vid avvikande resultat med DFA utfördes och fick ett negativt resultat. Upprepad testning vid avvikande resultat med BD MAX Enteric Parasite Panel utfördes med tolv (12) replikat varav samtliga fick negativt resultat (0/12). Provet testades också med en enzymimmunoanalys för Giardia-antigen som testning av avvikande resultat och fick ett negativt resultat. 2 Ett (1) prov testades med en enzymimmunoanalys som detekterar Giardia-antigen som testning av avvikande resultat och fick ett negativt resultat. Upprepad testning vid avvikande resultat med BD MAX Enteric Parasite Panel utfördes med sex (6) replikat av provet och fick 1/6 positivt resultat. Ingen testning av avvikande resultat utfördes med de två (2) övriga proven. 3 Resultatet av det alternativa PCR- och dubbelriktade sekvensieringssteget i referensmetoden var negativt för detta prov. DFA-steget i referensmetoden var positivt. Upprepad testning vid avvikande resultat med den alternativa PCR- och dubbelriktade sekvensieringsmetoden utfördes och fick ett negativt resultat. Upprepad testning vid avvikande resultat med DFA utfördes och fick ett positivt resultat. Upprepad testning vid avvikande resultat med BD MAX Enteric Parasite Panel utfördes med sex (6) replikat varav samtliga fick negativt resultat (0/6). Detta prov testades också med en antigendetekterande enzymimmunoanalys som testning vid avvikande resultat och fick ett negativt resultat. 4 Ingen testning vid avvikande resultat utfördes med det här provet. 5 Ett (1) prov testades med en antigendetekterande enzymimmunoanalys och en kommersiellt tillgänglig molekyläranalys som testning vid avvikande resultat. Bägge fick ett positivt resultat. Upprepad testning vid avvikande resultat med BD MAX Enteric Parasite Panel utfördes med sex (6) replikat av provet och samtliga fick ett positivt resultat (6/6). 6 Ett (1) prov testades med en enzymimmunoanalys och en kommersiellt tillgänglig molekyläranalys som testning vid avvikande resultat. Enzymimmunoanalysen fick ett positivt resultat och molekyläranalysen fick ett negativt resultat. Upprepad testning vid avvikande resultat med BD MAX Enteric Parasite Panel utfördes med elva (11) replikat av provet och fem (5) fick positivt resultat (5/11). Ingen testning vid avvikande resultat utfördes med de fem (5) övriga proven. 11

12 När det gäller prover som fixerats i 10 % formalin identifierades 90,3 % respektive 99,8 % av de prospektiva Cryptosporidium hominis/parvum-positiva och -negativa proverna och 93 % respektive 100 % av de retrospektiva positiva och negativa proverna med BD MAX Enteric Parasite Panel. När det gäller prover utan konserveringsmedel identifierades 100 % respektive 99,5 % av de prospektiva Cryptosporidium hominis/parvum-positiva och -negativa proverna och 97,7 % respektive 98,4 % av de retrospektiva positiva och negativa proverna med BD MAX Enteric Parasite Panel (tabell 5). Tabell 5: Cryptosporidium hominis/parvum kliniska prestanda Provtyp Provets ursprung BD MAX Enteric Parasite Panel P RM N Totalt Fixerat i 10 % formalin Utan konserveringsmedel Prospektivt Retrospektivt Prospektivt Retrospektivt P N 6 1, Totalt SENSITIVITET: 90,3 % (80,5 %, 95,5 %) SPECIFICITET: 99,8 % (99,2 %, 99,9 %) P N Totalt PPA: 93 % (81,4 %, 97,6 %) NPA: 100 % (95,3 %, 100 %) P N Totalt SENSITIVITET: 100 % (90,1 %, 100 %) SPECIFICITET: 99,5 % (98,6 %, 99,8 %) P N Totalt PPA: 97,7 % (88,2 %, 99,6 %) NPA: 98,4 % (95,3 %, 99,4 %) 1 Alla sex (6) proverna var positiva med DFA-steget i den sammansatta referensmetoden. Ett (1) prov sekvenserades som C. parvum, tre (3) prover var negativa och två (2) var inte rapporterbara med de alternativa PCR- och dubbelriktade sekvensieringsstegen i den sammansatta referensmetoden. 2 Upprepad testning vid avvikande resultat med den alternativa PCR- och dubbelriktade sekvensieringsmetoden utfördes med alla sex (6) prover. Ett (1) prov sekvenserades som Cryptosporidium parvum, ett (1) prov sekvenserades som Cryptosporidium felis och de återstående fyra (4) var PCR-negativa med upprepad testning vid avvikande resultat. Testning vid avvikande resultat utfördes också med en antigendetekterande enzymimmunoanalys som inte särskiljer mellan Cryptosporidium och Giardia. Två prover var negativa med enzymimmunoanalysen och fyra prover var positiva med enzymimmunoanalysen, varav två var positiva för Giardia med andra testmetoder. 3 Ett DFA-positivt prov klassificerades som negativt med referensmetoden utifrån resultaten från en alternativ PCR- och dubbelriktad sekvensieringsmetod som identifierade Cryptosporidium meleagridis. 4 Sex DFA-positiva prover klassificerades som negativa med referensmetoden utifrån resultaten från en alternativ PCR- och dubbelriktad sekvensieringsmetod som identifierade fyra (4) Cryptosporidium canis, ett (1) C. meleagridis och ett (1) Cryptosporidium spp. (odefinierad). 5 Upprepad testning vid avvikande resultat utfördes med BD MAX Enteric Parasite Panel med tolv (12) replikat per prov. Ett prov var positivt för fem (5) av tolv (12) replikat och ett prov var positivt för två (2) av tolv (12) replikat. 6 Upprepad testning vid avvikande resultat utfördes med BD MAX Enteric Parasite Panel med sex (6) replikat per prov. Ett prov var positivt för fem (5) av sex (6) replikat och ett prov var positivt för tre (3) av sex (6) replikat. Ett tredje prov var negativt för sex (6) av sex (6) replikat. 7 Upprepad testning vid avvikande resultat utfördes med BD MAX Enteric Parasite Panel med sex (6) replikat per prov. Två prover var negativa för sex (6) av sex (6) replikat. 12