Hemolysgrad (%) i erytrocytkoncentrat för blodtransfusion under sex veckors lagringstid

Transkript

1 Institutionen för naturvetenskap Examensarbete Hemolysgrad (%) i erytrocytkoncentrat för blodtransfusion under sex veckors lagringstid Jessica Lundblad Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 hp Grundnivå Nr: 2010:BL13

2 Hemolysgrad (%) i erytrocytkoncentrat för blodtransfusion under sex veckors lagringstid Jessica Lundblad Examensarbete i Biomedicinsk laboratorievetenskap, 15 högskolepoäng. Filosofie kandidatexamen Handledare Meta Bratt, överläkare, Susanne Widell, universitetslektor, Examinator Maria Mattsson, universitetslektor, Blodcentralen, Laboratoriemedicin Blekingesjukhuset i Karlskrona, Karlskrona Institutionen för naturvetenskap, Linnéuniversitetet i Kalmar, Kalmar Institutionen för naturvetenskap, Linnéuniversitetet i Kalmar, Kalmar Examensarbetet ingår i Biomedicinska analytikerprogrammet, 180 högskolepoäng. Sammanfattning Erytrocyten, den röda blodkroppen, innehåller proteinet hemoglobin (Hb) vars främsta uppgift är att transportera syre till kroppens alla vävnader. Tillgången till tappat blod från blodgivare är mycket viktig inom sjukvården. Det är viktigt att blodpåsen tappas, hanteras och lagras på rätt sätt för att undvika onödig hemolys av erytrocyter. För att se till att hemolysgraden håller sig under det rekommenderade gränsvärdet på <0,8 % utförs regelbundna kvalitetskontroller på erytrocytkoncentrat (e-konc) vid förvaringstidens utgång som är 42 dagar. Syftet med studien var att undersöka hur hemolysgraden (%) i erytrocytkoncentrat stiger under förvaringstiden, samt att se om upprepad mekanisk hantering vid tillverkning av dessa påverkar hemolysgraden. Det var även av intresse att se om skillnader i hemolysgrad mellan könen fanns samt att utarbeta en metod för en ny kvalitetskontroll för analys av hemolysgrad i e-konc på blodcentralen i Karlskrona. Sextiotre e-konc valdes slumpvis ut. Tio av dessa var färskt tappade och utgjorde Grupp 1. Analys av hemolysgraden i dessa utfördes sju gånger per koncentrat under sex veckor inklusive tappningsdagen. De 53 andra e-konc utgjorde Grupp 2 som delades in i 6 grupper beroende på lagringstid (1-6 veckor) och analyserades en gång per enhet. Helblodet till varje enskilt e-konc blandades var för sig, analyserades med avseende på Hb (g/dl). Proverna separerades sedan och analyserades på fritt Hb (g/dl) för att användas i formeln för uträkning av hemolysgrad i procent. Analyserna utfördes kolorimetriskt på det hematologiska analysinstrumentet ADVIA 2120 Automated Hematology Analyzer från Bayer. En höjning av hemolysgraden per e-konc per vecka i Grupp 1 kunde ses över tid men den översteg inte gränsvärdet (< 0,8 %) för merparten av e-konc. Upprepad och överdriven hantering gav ingen hemolys över gränsvärdet. I individuella e-konc från Grupp 1 sågs dock en misstänkt ökning i hemolysgrad i individuella e-konc ( 0,7 %), mest uttalad i vecka 4, som inte kan förklaras i denna studie och bör utredas ytterligare. I Grupp 1 hade 3/10 en misstänkt konstant ökning i hemolysgrad över tid från vecka 4-6. Alla e-konc i Grupp 2 hade en hemolysgrad under < 0,8 %. Inget klart samband i hemolysgrad sågs mellan män och kvinnor i Grupp 2.

3 Abstract The degree of hemolysis (%) in concentrates of erythrocytes used for blood transfusion during six weeks of storage The red blood cell, the erythrocyte, contains the hemoglobin (Hb) which is a blood protein. It s main purpose is to transport oxygen to all the tissues of the body. The supply of donated blood to the hospitals is of great importance. Frequent product controls must be made in order to secure that the degree of hemolysis (%) is kept under the recommended limit of < 0,8 % until the date of expiry is reached after 42 days of storage. To secure the quality of the erythrocyte concentrate it must be extracted, handled and stored according to recommended methods, in order to avoid unnecessarily high degrees of hemolysis. The purpose of the experiment was to examine the degree of hemolysis of erytrocyte concentrate over time and to see if repeated handling and stripping had significant influence upon the degree of hemolysis. The degree of hemolysis was also analyzed in comparison between the sexual genders of the blood donors. Another purpose of the experiment was to see if any connection of the degree of hemolysis and sex existed and to work out a new method for this type of quality control in this particular blood bank. A total of 63 units of erythrocyte concentrate were randomly chosen. Ten of the units were freshly taken and analyzed seven times. These provided group 1. The remaining 53 erytrocyte concentrates were divided into six groups after the number of weeks they had been stored (1-6 weeks). These provided Group 2 and were each analyzed once during six weeks. The fresh blood was separated and mixed before analysis. The erythrocyte concentrate was colorimetrically measured on the hematological instrument ADVIA 2120 Automated Hematology Analyzer from Bayer AB. A small increase of the degree of hemolysis for each erytrocyte concentrate per week was observed over time, but rarely exceeded the set limit (< 0,8 %). A significant increase of the degree of hemolysis was though seen in individual erytrocyte concentrates mainly during week 4 in Group 1, which cannot be explained in this study and may be investigated further. In group 1, 3/10 also exhibited possible constant increase over time from week 4-6. All the erytrocyte concentrates in Group 2 had a degree of hemolysis < 8 %. The conclusion was that the degree of hemolysis was kept below its prescribed limits (< 0,8 %), a proof of the well working routines and methods at the blood bank. Repeated and excessive handling of the units was proven to give a marginal increase in the degree of hemolysis, however without exceeding the limits. There was no clear correlation between the men and women in Group 2, regarding the degree of hemolysis.

4 INNEHÅLLSFÖRTECKNING INTRODUKTION... 1 Erytrocyten... 1 Framställning av blodkomponenter... 2 Kvalitetssäkring... 4 ADVIA Reagens... 7 Etik... 8 Syfte... 8 MATERIAL OCH METODER... 9 Framställning av erytrocytkoncentrat... 9 Analys av erytrocytkoncentrat med ADVIA Reagens Kontroller Statistik RESULTAT Grupp Grupp DISKUSSION SLUTSATS TACKORD REFERENSER... 24

5 INTRODUKTION Erytrocyten Erytrocyten, den röda blodkroppen, är en blodcell innehållande proteinet hemoglobin (Hb) som ansvarar för blodets syretransporterande förmåga samt ger blodet dess röda färg. Hb transporterar även restprodukten koldioxid ut ur kroppen via lungorna och fungerar som ett buffertsystem för att reglera blodets ph. Erytrocyten bildas i sternum och crista under påverkan av hormonet erytropoetin. Det produceras ca 2,4 miljoner erytrocyter varje sekund. Hos en vuxen person finns det ca erytrocyter [1]. Figur 1. Erytrocyten, den röda blodkroppen, innehåller ca 270 miljoner syretransporterande hemoglobinmolekyler [2]. Erytrocyten är ca 8 µm i diameter och 2 µm tjock och har ett flexibelt membran som möjliggjör för passage genom små kapillärer med diametrar på endast 2,5 µm i diameter [3]. (Illustration av Jessica Lundblad, 2010.) Varje erytrocyt innehåller ca 270 miljoner hemoglobinmolekyler. Hemoglobinmolekylen är ett protein med fyra subenheter bestående av två alfa- och två beta-subenheter som är uppbyggda av alfa helixar sammanbundna av icke helixformade segment. Vätebindningar stabiliserar helixarna i subenheten och ger den dess funktionella form. Varje subenhet väger ca 16 kda. Hemoglobinets kvartiära struktur bildar en tetraedisk form. Varje subenhet innehar en organisk molekyl, en så kallad hemgrupp med en järnjon som ger erytrocyten dess syretransporterande förmåga när Fe 2+ oxideras av en syremolekyl till Fe 3+ [2]. Erytrocytens kärna stöts bort under sin mognad och antar då en platt bikonkav form för maximal syretransport och flexibilitet (figur 1). Den mogna erytrocyten saknar mitokondrier och har ingen förmåga att producera protein. Dess metabolism är helt inriktad på att upprätthålla sin syretransporterande förmåga. Erytrocyten lever på en anaerob metabolism av glukos. Erytrocyterna är relativt små jämfört med andra blodceller (ca 8 µm i diameter och 2 µm tjock). Membranet är väl tilltaget och flexibelt och kan svälla upp till en rund boll eller tränga igenom en kapillär med en diameter av endast 2,5 µm. Dess förmåga att ändra form möjliggörs av proteinerna i membranets formbara cytoskelett som aktiveras när blodkroppen 1

6 tvingas genom trånga utrymmen. Även osmotisk påverkan kan få cellen att anpassa sin form från en stor sfär till en hopskrumpnad spiklubba [3]. Det finns för närvarande mer än 50 kända membranproteiner som finns i några hundra upp till en miljon kopior per cell. Ca 25 av dessa membranproteiner utgör blodgruppsantigen som exempelvis A-, B- och Rh-antigen. Blodgrupperna är ärftliga och varierar mellan olika individer. Denna variation är man tvungen att ta hänsyn till vid en blodtransfusion av erytrocyter, vilka om de inte är kompatibla med mottagarens blod kan få allvarliga följder för mottagaren som då kan bli allvarligt sjuk och i värsta fall dö när dennes immunsystem upptäcker främmande antigen på de mottagna blodkropparna [4]. Erytrocyten lever i ca 120 dagar till det att dess förråd av enzymer som upprätthåller membranets integritet börjar ta slut, varvid flexibiliteten i membranet avtar. Gamla erytrocyter sorteras bort och tas om hand av fagocyterande makrofager i det trånga kärlsystemets endotel i mjälte, lever och benmärg (90 %), det så kallade retikuloendoteliala systemet. Hb som frigörs från de fagocyterade erytrocyterna binds upp av haptoglobin och transporteras till levern för nedbrytning och återanvändning. Många erytrocyter utsätts även för mekaniskt slitage i kroppens kärlsystem och går då under intravaskulärt (10 %) med ökande ålder hos erytrocyten. Mekaniskt slitage kan exempelvis ske vid slag från hjärtats klaffar eller vid löpning då erytrocyterna kan krossas i fotsulorna [3]. Framställning av blodkomponenter Tillgången på erytrocyter är mycket viktig inom sjukvården exempelvis vid en operation, trafikolycka eller en svår förlossning. Erytrocyter kan inte tillverkas på konstgjord väg utan är en färskvara med begränsad hållbarhet. En blodgivare måste vara frisk och ha ett bra Hbvärde. För män gäller ett Hb-värde på > 135 g/l och för kvinnor > 125 g/l [4]. Vid blodgivningen tappas ca 450 ml helblod till en tappningspåse (3)(figur 2). Helblodet filtreras (4) varvid > 99 % av leukocyterna och trombocyterna avlägsnas. Det leukocytbefriade blodet centrifugeras sedan för att separera helblodet till plasma och e-konc i ett övre och ett undre skikt (4). Plasman överförs till en ny påse med blodkomponentextraktorn T-ACE (Terumo Automatic Component Extractor, Leuven, Belgium). En färdig enhet e-konc har en volym på ml med ett Hb minimum på 40 g/enhet, leukocytinnehållet bör då vara < 1,0 x 10 6 /enhet. Ett färdigt e-konc håller i 42 dygn (6 veckor) i blodkyl vid en temperatur på 2-6 C [6]. 2

7 Provtagningsnål 1. Överföringspåse till prover för smittprovstagning och Hb-mätning 3 Filter 2 Tappningspåse med helblod och ACD-lösning 4 Överföringspåse med erytrocytkonc. och plasma 5 Plasma 6 SAGMlösning Figur 2. Vid tappning och komponentberedning används ett slutet 4-påssystem. 1. En liten mängd helblod töms först till en liten påse för smittprover och Hb-mätning. 2. Helblodet leds vidare till tappningspåsen med ACDlösning. 3. Helblodet leukocytfiltreras till överföringspåsen. 4. Det filtrerade blodet i överföringspåsen centrifugers vilket delar innehållet i ett övre lager med plasma och ett undre lager med erytrocytkoncentrat. 5. Plasman pressas upp till en egen påse. 6. SAGM-lösningen rinner ner till e-konc i överföringspåsen (4) [6]. På blodcentralen i Karlskrona används ett slutet 4-påssystem med filter (3) (figur 2). Påsarna innehåller acid-citrate-dextrose-lösning (ACD-lösning) och salt-adenin-glukos-mannitollösning (SAGM-lösning). Tillsatserna upprätthåller erytrocyternas metabolism och bevarar deras funktion under hela lagringstiden. ACD-lösningen förvaras i tappningspåsen (2) för att ge ett initialt näringstillskott de första timmarna innan filtreringen. Citraten i ACD-lösningen binder kalcium för att förhindra koagulation av helblodet. SAGM-lösningen förvaras i den fjärde påsen (6) och tillsätts till påsen med e-konc (4) efter att plasman extraherats. Dextros, glukos och mannitol tillgodoser erytrocytens energibehov. Adenin kompenserar för förlusten av adeninet vid deaminering och defosforylering av adenosinmonofosfat (AMP) vid erytrocytens energimetabolism [6]. 3

8 Efter 42 dygns lagring i näringslösningen är ca % av erytrocyterna inte längre livsdugliga, de avlägsnas dock snabbt i mottagarens mjälte, vilket är fullt tillfredsställande vid majoriteten av givna transfusioner [3]. Koncentrationen av extracellulärt Hb från hemolyserade erytrocyter ökar långsamt de första veckorna under lagringen och accelererar sedan mot slutet av lagringstiden. För erytrocyter i SAGM-lösning är hemolysgraden vanligtvis ca 0,5 % efter 42 dygn [7]. Kvalitetssäkring För att godkännas av Styrelsen för ackreditering och teknisk kontroll (SWEDAC), krävs det att man följer deras rekommendationer [8]. Regelbunden produktkontroll utförs på de blodkomponenter som rutinmässigt och kontinuerligt framställs. För att erhålla en statistiskt representativ bild av cellinnehållets kvalitet i framställda blodkomponenter bör man utföra en kvalitetskontroll på ett visst antal framställda blodkomponenter varje månad [4]. På blodcentralen i Karlskrona rekommenderas det i Handbok för blodcentraler att produktkontroller utförs på 6 e-konc varje vecka, eller minst 100 e-konc för en blodcentral som producerar e-konc per år. Hemolysgraden i % erhålls från mängden fritt Hb i plasma i förhållande till hela e-konc hemoglobininnehåll med hjälp av följande formel [4]: Hemolysgrad (%) = Hb i plasma (g/l) x (1- EVF) x 100 Hb i hela erytrocytkoncentratet (g/l) Erytrocytvolymfraktionen (EVF) är ett annat namn för hematokriten (Hct) vilken är ett mått på andelen erytrocyter av helblodets totala volym (L/L). EVF ökar med Hb-koncentrationen. Personer med högre EVF, vanligtvis män, har lägre andel plasma och får därmed en högre koncentration Hb i plasman. Därför multipliceras täljaren med andelen plasma (1-EVF) för att kompensera för denna variation. Gränsvärdet för hemolysgraden i e-konc är < 0,8 % efter 42 dygn [4]. Vid provtagningen blandas e-konc flera gånger och en bit plastslang skarvas på och fylls med erytrocyter. När man fyller på proverytrocyter i plastslangen tar man hjälp av en så kallad strippmaskin (Hirshman & Beilner, HST 02554, GmbH). Strippmaskinen tömmer ut oblandade erytrocyter som legat i plastslangen genom att pressa ut slangens innehåll maskinellt mellan två valsar som gör att erytrocyterna förs ner i blodpåsen. Erytrocyterna från slangen blandas med de övriga erytrocyterna i påsen genom att försiktigt vända på påsen några gånger. Sedan lättar man på trycket mellan valsarna så att de blandade erytrocyterna kan rinna tillbaka in i plastslangen. Detta upprepas ett antal gånger för att försäkra sig om att koncentrationen och kvaliteten av proverytrocyter i plastslangen ska bli representativt för hela påsens innehåll. Plastslangen svetsas sedan bort och töms i ett provrör för analys. Alla skarvar som uppstår vid denna procedur svetsas igen sterilt. [9]. 4

9 E-konc analyseras först för erhålla det totala Hb i provet, sedan centrifugeras provet för att erhålla det fria hemolyserade Hb i plasman [9]. Analysen utförs kolorimetriskt och man erhåller ett värde på hemolysgraden i procent enligt tidigare nämnda formel för hemolysgrad. Resultaten granskas av ansvarig läkare och redovisas och kommenteras vid arbetsplatsmötena. Åtgärder bör vidtas om resultaten inte uppfyller gällande krav [4]. Vid hemolys ökar det fria Hb i plasman. En för hög hemolysgrad i lagrade e-konc kan orsaka problem hos mottagaren när det fria hemoglobinet förbrukar patientens haptoglobin. Hemoglobin som inte tas om hand av haptoglobin kan fastna i patientens kärlsystem och exempelvis orsaka njurproblem, så kallad hemoglobinuri [7]. Det finns flera olika orsaker till att hemolys uppstår i e-konc. Erytrocyterna har olika ålder och en del hinner dö under lagringstiden. Kontaminering av bakterier som kan hemolysera cellerna är ovanligt men kan uppstå om huden på blodgivarens arm inte desinficerats rätt vid insticksstället. Centrifugen kan ha för hög hastighet och centrifugera för hårt så att erytrocyterna slås sönder. För hög lagringstemperatur kan vara en annan faktor. Stiftet på tappningspåsen kan vara dåligt avbrutet och orsaka mekanisk hemolys av erytrocyterna när det passerar genom detta vid filtreringen. Ovan nämnda möjliga orsaker till ökad hemolysgrad i e-konc erhölls via personlig kommunikation med handledaren på blodcentralen i Karlskrona. Externa kontroller utförs med provmaterial från Equalis där en Hb-nivå testas 2 ggr per år [4]. 5

10 ADVIA 2120 ADVIA 2120 Automated Hematology Analyzer från Bayer AB är ett helautomatiskt instrument som utför flödescytometriska analyser av samtliga hematologiska parametrar av blodceller (se figur 3). Modellen används på medicinska laboratorier som utför måttliga till höga antal hematologiska analyser. Figur 3. ADVIA 2120 Automated Hematology Analyzer från Bayer AB är ett helautomatiskt instrument som utför flödescytometriska analyser av blodceller och Hb. Det blåa området (se pilen) utgör UFC (Unified Fluid Circuit) blocket där analysen av Hb utförs med hemoglobinmetoden [10]. Analys av Hb utförs i två steg: Steg 1: lysering av erytrocyter med alkalisk bor-lösning och surfaktant (N, N-dimethyllaurylamine N-oxide). Steg 2: oxidering och sönderfall av hemjonen vilket bildar Fe 3+ -hem som binder till en vattenmolekyl och en hydroxidjon. Fe 3+ -hem löses upp av surfaktant-miceller och bildar en grön slutprodukt vilken mäts fotometriskt i en optisk, kolorimetrisk avläsning vid 465 nm [11]. Optiska data plottas på en Hemoglobin Rate-kurva (figur 4). Tiden i sekunder plottas längs x- axeln och procent av ljustransmissionen plottas längs y-axeln. Hemoglobintransmissionshistogrammet (figur 4) delas upp i fem delar: 1. Sheath/rinse-lösningen avläses från den föregående cykeln. 2. Tömning sker av sheath/rinse och påfyllning av reaktionslösningen av provet och Hb-reagenset. 3. Reaktionslösningen läses av (10,5 14,5 sekunder) = sample mean. 4. Tömning av reaktionslösningen sker följt av uppfyllning av sheath/rinse. 5. Sheath/rinse avläses (baslinje transmittans) för provet. Baseline mean värdet skall ligga mellan 2,5 4,1 [11]. Hemoglobine Rate kurvan är en del av analysutskriften för varje prov. Vid uträkningen användes värdet på Hb och hematokrit samt värdet på Hb på plasman från samma prov efter att det centrifugerats enligt formeln för hemolysgrad [4]. 6

11 Ljustransmission (%) Hemoglobin Rate kurva Tid (s) Figur 4. Optiska data plottas på en Hemoglobin Rate kurva. Tiden i sekunder plottas längs x-axeln och procent av ljustransmissionen plottas längs y-axeln. Hemoglobintransmissions-histogrammet delas upp i fem delar: 1. Sheath/rinse lösningen avläses från den föregående cykeln. 2. Tömning sker av sheath/rinse och påfyllning av reaktionslösningen av provet och Hb-reagenset. 3. Reaktionslösningen läses av (10,5 14,5 sekunder) = sample mean. 4. Tömning av reaktionslösningen sker följt av uppfyllning av sheath/rinse. 5. Sheath/rinse avläses (baslinje transmittans) för provet. Baseline mean värdet skall ligga mellan 2,5 4,1 [11]. Hemoglobinkoncentrationen beräknas med hjälp av en baslinje och provavläsningar som tas med vissa intervall under hemoglobinprovets analysperiod. Spänningsavläsningarna motsvarar den mängd överfört ljus som passerar genom reaktionskammaren när den innehåller prov som blandats med reagens. Spänningsavläsningarna konverteras sedan till ett digitalt format av Hb Interface Board som skickas till analysinstrumentets processor som beräknar den optiska tätheten och härleder Hb-koncentrationen. Instrumentet mäter från 0 g/l med en felmarginal på +/- 3 g/l [11]. Avdelningen hade två identiska instrument. Vid analyserna för detta arbete användes endast det ena instrumentet. Reagens Reagenset ADVIA 2120 HGB Reagent, Cyanide Free (natriumhydroxid 0.4 %, lauryldimetylamin 2 %, natriumborat, dekahydrat 2 %) användes till ADVIA 2120 Automated Hematology Analyzer från Bayer AB för analys av Hb [12]. Hb-reagenset levererades klart för användning i en behållare tillsammans med flera andra behållare innehållande reagens för analys av erytrocyter, trombocyter, leukocyter. Behållaren för Hb-reagenset innehöll 1100 ml reagens som räckte till cirka 1000 analyser under en vecka på avdelningen för Klinisk kemi i Karlskrona. Reagenset förvarades i rumstemperatur och hade cirka ett års hållbarhet. 7

12 Etik Bakom varje blodenhet finns en frivillig blodgivare som gjort sig besvär att komma till blodcentralen och skänkt sin tid och en liten del av sig själv för att hjälpa andra medmänniskor. Varje påse helblod är till stor hjälp inom sjukvården, som är beroende av denna frivilliga hjälp. Varje enhet bör därför behandlas med varsamhet och respekt av personalen genom att bland annat följa läkemedelsverkets och socialstyrelsens föreskrifter för hantering och förvaring [4]. Vid all blodgivning får givaren skriva under att blodet som tappas från denne får användas inom sjukvården och till forskning. Lagen om sekretess och tystnadsplikt följs även inom transfusionsmedicin. Alla blodenheter kan identifieras via ett unikt tappningsnummer i bloddatasystemet Prosang, till vilket endast behörig personal på Blodcentralen har tillgång [4]. Syfte Syftet med studien var att undersöka graden av hemolys i e-konc för blodtransfusion under en lagringstid av sex veckor. Främst med avseende på om hanteringen under provtagningen eventuellt kunde påverka graden av hemolys. Det var även av intresse att utarbeta en ny metod för produktkontroll av hemolysgraden i e-konc. 8

13 MATERIAL OCH METODER Framställning av erytrocytkoncentrat Givarnas helblod tappades med venpunktion i en tappningspåse efter noggrann desinficering av punktionsstället. Efter tappning fick helblodet vila under minst 2 timmar på en kylplatta (Coolant) i rumstemperatur för att leukocyterna skulle hinna eliminera eventuella bakterier som kontaminerat helblodet vid tappningen. Leukocytfiltrering med inline polyesterfilter gjordes på tappningspåsen till en överföringspåse (fig 2) med hjälp av ett slutet 4-påssystem med leukocytfilter, (Leukotrap WB, Pall Medical) med 100 ml redan tillsatt Citrat-lösning (citronsyra. monohydr. 0,327 g, Natr. citrat dihydr. 2,55 g, Aqua 100 ml) och 100 ml redan tillsatt SAGM-lösning (NaCl 0,877 g, glukos monohydr. 0,900 g, adenin 0,017 g, mannitol 0,525 g, Aqua 100 ml). Leukocytfiltret filtrerade även bort trombocyter. För framställning av ett färdigt e-konc centrifugerades överföringspåsen (med erytrocyter och plasma) i en blodpåscentrifug (Hettich RS och Hettich RP) med speciella blodcentrifugkoppar vid 4829 rpm i 10 minuter. Plasman avskiljdes med plasmaextraktorn T-ACE (Terumo, Leuven, Belgium) till en ny påse endast för plasma. Till de kvarvarande erytrocyterna tillsattes SAGM-lösningen, som förvarats i en fjärde påse (figur 2) [4]. På varje e-konc sitter en extra plastslang förutom den huvudslang som erytrocyterna överförts med från helblodspåsen (figur 5). Den extra plastslangen är bland annat till för att fylla påsen med innehåll och att sterilt tas av i olika längd om ex en eventuell transfusionsreaktion uppstått som måste utredas eller om en kvalitetskontroll måste utföras. Framställning av analysmaterial I studien ingick 2 grupper med e-konc: Grupp 1 var tillverkade från nytappade helblodspåsar från 10 st slumpvis valda blodgivare under samma dag (tabell I). Alla tillverkades och lagrades i 6 veckor enligt ovan beskriven standardmetod för framställning av e-konc. I Grupp 2 ingick tidigare tillverkade och lagrade e-konc från 53 st slumpvis utvalda blodgivare. Dessa var framställda från olika blodgivare på samma sätt som ovan men vid olika tidpunkt samt lagrade i 1 till 6 veckor. Alla hade således olika lagringstid från 1-6 veckor och delades upp i grupper om 10 stycken e-konc vardera under vecka 1-5 samt 3 st i vecka 6. Alla i varje veckogrupp härrörde således från olika blodgivare lagrade olika lång tid (tabell II). Analysmaterial togs från en bit slang på varje e-konc (figur 5) och överfördes till ett provrör på nedan beskrivet sätt. Ingen hänsyn togs till blodgrupp, kön eller ålder hos givarna. 9

14 Alla e-konc slangar (n=63) tömdes först på material med en strippmaskin (Hirshman & Beilner, HST 02554, GmbH) en gång. E-konc vändes sedan tio gånger för återförande av material och för noggrann blandning av dess innehåll. Denna procedur upprepades fem gånger per påse. För att erhålla en större provmängd skarvades till varje e-konc minst 30 centimeter extra reservslang till en slangstump på påsen med hjälp av sterilsvets (TERUMO SCD312) [15]. Reservslangen hade tidigare svetsats av sterilt från en oanvänd tappningspåse med en slangsvets (Biosealer Type BS 789, Labstatus AB, Stockholm, Sweden, manual fanns ej till detta instrument). En peang sattes på slangen före svetsningen för att förhindra luftkontaminering av e-konc innehållet vid en eventuellt otät svetsfog [4]. Skarvslangen strippades och e-konc hölls sedan högt för att fylla den strippade, påskarvade slangbiten med blod. Den påskarvade slangbiten svetsades bort tillsammans med skarven. Alla skarvar som uppstått vid denna procedur svetsades igen sterilt. Innehållet (blodet) i denna tömdes i ett märkt 4 ml provrör genom att klippa av ena änden och perforera den andra med en sax, för att lätta på slangens vakuum [4]. Analys av erytrocytkoncentrat med ADVIA 2120 Proverna blandades i 10 minuter i en blandmaskin (Rotamix Electa AB) [9]. Blodanalysinstrumentet sög upp 275 µl e-konc i det yttre sugröret, av detta använde instrumentet 157 µl för analys i kolorimetern med hjälp av reagenset ADVIA 2120 HGB Reagent, Cyanide Free [11]. Proven centrifugerades sedan i 10 minuter i 1000 rpm i rumstemperatur (22 C). Plasman analyserades med samma analysmetod. Om plasman endast fanns i liten mängd (e-konc från mindre än 20 cm slang) pipetterades plasman försiktigt över till ett 2,5 ml rör för analys [9]. 10

15 2 3 1 Figur 5. En enhet e-konc innehåller ca ml. E-konc lagras i maximalt 42 dagar. 1. En extra bit plastslang skarvades till påsens ena slang för att användas vid provtagning. Den påskarvade slangen fylldes med provblod, svetsades av. Blodet i slangen överfördes till ett provrör för analys. 2. Stiftet som satt på den andra slangen kunde orsaka hemolys om blodet strippades genom denna. 3. Skarven mellan påsens slang och den påskarvade slangstumpen. Skarven var här försluten men kunde öppnas med ett lätt tryck. (Bild: Jessica Lundblad, Karlskrona 2010.) På provmaterialet från varje e-konc i Grupp 1 utfördes sju analyser uppdelade på en analys per vecka under 7 veckors tid (vecka 0-6). Vecka 0 representerar tappningsveckan. Sammanlagt gjordes således 70 analyser på material från Grupp 1 (tabell I). På provmaterial från de lagrade 53 e-konc i Grupp 2 (10 st var ca 1 vecka gamla, 10 st var ca 2 veckor gamla, 10 st var ca 3 veckor gamla, 10 st var ca 4 veckor gamla, 10 st var ca 5 veckor gamla och 3 st var ca 6 veckor gamla) utfördes endast en analys på varje e-konc. Sammanlagt gjordes således 53 olika analyser från Grupp 2 (tabell II). Alla analyser av de totalt 63 proverna ovan utfördes av en och samma person vid olika tillfällen. 11

16 Reagens Vid analysen av Hb med ADVIA 2120 användes reagenset ADVIA 2120 HGB Reagent, Cyanide Free (natriumhydroxid 0.4 %, lauryl-dimetylamin 2 %, natriumborat, dekahydrat 2 %) [12]. Kontroller De tre kontrollerna, ADVIA 2120i 3 in 1 TEST point köptes från tillverkaren Siemens för analysinstrumentet [13]. Kontrollerna analyserades en gång per dag till ADVIA 2120 med låga, höga och normala värden. Värdena fick ligga på högst +/- en SD från tillverkarens angivna hematologiska parametrar. I denna laboration användes parametern för hemoglobin (Hb g/dl) som för den låga kontrollen var 5,6 +/- 0,4 g/dl, den höga kontrollen 16,7 +/- 0,7 g/dl och för den normala kontrollen 11,8 +/- 0,5 g/dl. Dagligen analyserades ett dygnsfärskt patientprov från en blodgivare; en gång på morgonen och en gång efter varje tvätt då alla de hematologiska parametrarna analyserades. Tvätt skedde automatiskt tre gånger per dygn var åttonde timme. Vid tvätten sköljdes alla slangar och reaktionskammare rena med en tvättbuffert (ADVIA 2120 EZ KLEEN; Dietylenglykolmonoetyleter 12,5 %, Natriumhydroxid 0,2 %, 2 mg/m 3 TLV-tak) [14]. De hematologiska parametrarna skulle vara samma vid varje analys för det specifika patientprovet. Statistik Grupp 1: Hemolysgraden i e-konc i % angavs som medelvärde och standardavvikelse (Mean±SD) från 7 repeterade analyser i individuella e-konc veckorna 0, 1, 2, 3, 4, 5 respektive 6 samt för alla 7 veckor, inklusive tappningsveckan, per e-konc och vecka. Medelvärde ±SD beräknades även för totala hemolysgraden i alla ingående e-konc (n=10) i varje enskild vecka 0-6 samt för totala hemolysgraden för alla e-konc och veckor. Grupp 2: Analys utfördes endast en gång per e-konc och vecka varför hemolysgraden i enskilda enheter inte är medelvärden. Medelvärde ±SD beräknades för totala hemolysgraden i alla ingående e-konc (n=10) i varje enskild grupp i vecka 1-6 samt för totala hemolysgraden för alla e-konc och veckor. 12

17 RESULTAT Grupp 1 Hemolysgraden i 10 st e-konc lagrade från tappningsveckan (vecka 0) i 1 till 6 veckor visade ett totalt medelvärde på 0,232 med en standardavvikelse på ± 0,154 med ett intervall på 0,049 till 0,617 procent. Medelvärdet för totala hemolysgraden (%) i enskilda e-konc för 7 veckor (inklusive tappningsveckan 0) blev 0,192 till 0,616. Gränsvärdet (< 0,8 %) för hemolysgraden överskreds i e-konc nr 2 (1,029 %) i vecka 4 och i e-konc nr 10 (1,352 %), 5 (1,583 %) och 6 (0,968 %) i vecka 4. E-konc nr 5 i v 4 visade en hemolysgrad nära gränsvärdet på 0,715 % (tabell I, figur 8). Tabell I. Individuella medelvärden (n=7 repeterade analyser) av hemolysgrad (%) i e-konc från Grupp 1 från tappningsveckan (0) till 6 veckors lagringstid. Totala medelvärdet ±SD för alla e-konc (n=10) i respektive vecka samt för enskilda e-konc 0 till 6 veckor Provnr Kön Ålder 0 v 1 v 2 v 3 v 4 v 5 v 6 v Medel ±SD 1 M ,176 0,176 0,166 0,486 0,159 0,182 0,192 0,145 2 M ,317 0,173 0,343 1,029 0,647 0,317 0,404 0,338 3 M ,451 0,160 0,165 0,111 0,168 4 M ,180 0,166 0,479 0,160 0,343 0,190 0,174 5 M ,370 0,175 0,715 0,340 0,171 0,253 0,250 6 M ,164 0,162 0,320 0,312 0,305 0,180 0,140 7 M , , ,342 0,130 0,173 8 M , ,172 0,076 0,141 9 M ,220 0,587 0,219 0,179 0,172 0, K ,205 0,204 1,352 1,583 0,968 0,616 0,671 Medel 0 0,049 0,145 0,144 0,617 0,358 0,314 0,232 ±SD 0 0,213 0,116 0,112 0,332 0,469 0,242 0,154 13

18 Figur 6 visar medelvärdet för totala hemolysgraden per lagringsvecka i Grupp 1 från tappningstillfället (v 0) och 6 veckor framåt. En kontinuerlig stegring ses med en topp i vecka 4. Två stycken e-konc (2 och 10) översteg gränsvärdet för hemolysgraden på 0,8 % och en (nr 5) tangerade detta (0,715%). I vecka 5 och 6 hade en (nr 10) 0.8% i hemolysgrad. Figur 6. Medelvärdet av hemolysgrad per lagringsvecka 0-6 i Grupp 1 (n=10) 14

19 Grupp 2 Resultatet visar att hemolysgraden i varje enskild grupp med e-konc från 10 olika blodgivare i varje vecka 1-5 låg konstant 0,8 %. Intervallet för medelvärden i de olika grupperna med 10 e-konc i varje lagringsvecka (1 till 5) låg mellan 0,154-0,271 % i hemolysgrad. I vecka 6 (n=3) sågs ett medelvärde ±SD på 0,303 ± 0,088. Tabell II. Resultat från analys av hemolysgrad (%) i 53 e-konc från Grupp 2 efter 1-6 veckors lagringstid. Grupp 2 (n = 53) v 1 Nr Kön Ålder Lagringstid (v - dgr) Hemolys (%) 11 M , M , M , M , M , K , M , K , M , M ,000 Medel ± SD 0,266 ± 0,165 v 2 21 M , K , K , M , K , K , M , K , K , M ,195 Medel ± SD 0,154 ± 0,084 15

20 v 3 31 K , M , M , M , K , K , K , K , K , M ,155 Medel ± SD 0,266 ± 0,312 v 4 41 M , K , M , K , K , K , K , K , M , M ,000 Medel ± SD 0,271 ± 0,208 v 5 51 K , K , M , M , M , K , M , M , K , K ,225 Medel ± SD 0,169 ± 0,102 16

21 v 6 1 K , M , M ,223 Medel ± SD 0,303 ± 0,088 Könsfördelning Det totala medelvärdet ± SD i hemolysgraden i hela Grupp 2 för män var 0,210 ± 0,187 (n= 27) och 0,231 ± 0,195 för 26 kvinnor. Ingen skillnad sågs mellan män och kvinnor. 17

22 DISKUSSION Syftet med studien var att undersöka graden av hemolys (%) i erytrocytkoncentrat (e-konc) från olika blodgivare under lagringstiden på 6 veckor och om denna överstiger etablerat gränsvärde på 0.8% [4]. Syftet var också att undersöka om upprepad mekanisk hantering vid tillverkning av e-konc påverkar hemolysgraden samt om skillnader mellan män och kvinnor kunde. Det var också av intresse att utarbeta en ny metod för kvalitetskontroll av hemolysgraden i e-konc på blodcentralen i Karlskrona. I studien ingick e-konc från 10 st färskt tappade helblod från olika blodgivare lagrade 1 till 6 veckor (Grupp 1) samt 53 stycken lagrade (1 till 6 veckor) e-konc från olika givare i grupper om 10 st i vecka 1 till 5 och 3 st i vecka 6. Alla valdes ut slumpvis. Metoden för analys av hemolysgrad i procent i e-koncentrat är väl etablerad vid alla transfusionsmedicinska enheter i Sverige och används regelbundet som kvalitetskontroll för e- konc [4]. Tidigare studier avseende syftet i denna har vad vi vet dock inte utförts. Resultatet i den presenterade studien visar ingen generell ökning i hemolysgrad i e-konc lagrade från vecka 1 till 6 över det etablerade gränsvärdet 0.8% i någon av grupperna. Individuellt sågs dock en skillnad i både individuella veckor och enskilda e-konc. Under vecka 4 uppmättes ett medelvärde ±SD för hemolysgraden (%) för Grupp 1 till 0,617 ± 0,334 (tabell I) vilket innebar en ökning av hemolysgraden för denna grupp (tabell I, figur 6). Värdet låg dock under det rekommenderade gränsvärdet 0.8% [4]. Detta kan ha berott på att det, för denna analys, förprogrammerade centrifugprogrammet under denna vecka hade blivit ändrat utan att jag hade blivit informerad om detta. Programmet för centrifugen var i början av försöket inställt på att centrifugera i rumstemperatur (22 C), men hade under vecka 4 blivit ändrad till 4 C för en annan analys utförd av laboratoriepersonalen. Den låga temperaturen under centrifugeringen kan ha orsakat ökad hemolysgrad hos proverna. Den som utförde centrifugeringen (jag) borde ha kontrollerat inställningarna för programmet innan centrifugeringen utfördes. Speciellt under vecka 4 fick provrören även stå ovanligt länge (ca 2 timmar) i rumstemperatur, utan kork, på grund av den stora mängden prover som skulle analyseras den dagen (ca 40 st.). Syret och rumsvärmen tros ha ökat metabolismen i proverna och påskyndat nedbrytningen och åldrandet hos erytrocyterna. Även i vecka 5 centrifugerades proverna i 4 C men denna gång förslöts provrören med kork och förvarades i kyl i väntan på analysen, denna gång var därför hemolysgraden i proverna endast något mer förhöjd än övriga veckor (0,358 %). Ökningen av hemolysgraden i Grupp 1 under vecka 4 (0,617 %) och vecka 5 (0,358 %) är rimlig eftersom e-konc med tiden hanterats fem gånger mer i denna grupp (tabell I). Försöket gav dock inget klart eller konsekvent stöd för teorin utan denna behöver utvärderas mer för att fastställas, med större och ett mer exakt urval av enheter. 18

23 Under vecka 3 utsattes enhet 10 från Grupp 1 för en olycka; skarvslangen var inte helt försluten och en relativt stor mängd luft kom in i påsen, där av den kraftiga ökningen av hemolysgraden i denna enhet under vecka 4 (1,352 %), 5 (1,583 %) och 6 (0,968 %) (tabell I). Endast tio e-konc hade valts ut slumpvis varav 9 av 10 enheter kom från män, jämförelsen i Grupp 1 var därmed inte representativ. Ingen jämförelse gjordes mellan könen i Grupp 1 av denna orsak. En jämförelse mellan män (0,210 %) och kvinnor (0,231 %) i Grupp 2 visade ingen skillnad i hemolysgrad. Det bör nämnas att det på grund av blodcentralens ringa storlek var svårt att hitta blodpåsar som förvarats den önskade lagringstiden. Vissa veckor fanns endast möjlighet att välja påsar som hade 1-3 dagar kortare eller längre datum. Därmed förklaras även svårigheten att välja e- konc med jämn könsfördelning för varje vecka. För påsar som skulle analyseras vecka 6 var det bara möjligt att finna tre stycken e-konc vilket därför gav ett mindre representativt värde denna vecka. Det var inte heller möjligt att göra dubbelprover på grund av att det endast fanns ca 30 cm slang att arbeta med från varje påse. På påsarna i Grupp 1 försvann ca 3 cm av påsens slang vid varje analystillfälle. Till varje påse fanns det två slangar fästade men till den ena slangen fanns det ett stift som kunde orsaka ökad hemolysgrad vid strippningen vilket då skulle ge ett missvisande värde. På grund av bristande material/slanglängd utfördes i stället en gruppjämförelse med två grupper; tidigare beskrivna Grupp 1 och Grupp 2. Vid försökets första vecka användes, som tidigare nämnts, ca 3 cm slangbit som svetsats av från varje e-konc. Slangbiten perforerades med en slangsegmentöppnare; en slags provrörskork med kanyl, som satt på ett 4 ml provrör. E-konc pressades ut för hand till ett innehåll av 750 µl blod. Mängden visade sig vara för knapp för en Hb analys och ytterligare en slangbit av samma längd lades till. De båda slangbitarna gav sammanlagt 1,5 ml e-konc vilket överfördes till ett Ellermanrör för att öka blodpelarens höjd. Denna mängd var dessvärre inte heller tillräcklig. Dessutom verkade hanteringen med att för hand klämma ut blodet från slangen genom slangsegmentöppnaren orsaka en ökad mekanisk hemolys hos erytrocyterna. För att tydliggöra de praktiska förutsättningarna för provmängden till analysen kan sägas att apparaten sög upp ca 275 µl, varav maskinen använde 157 µl för analys. Provet centrifugerades och mängden användbar ren plasma från e-konc utgjorde endast ca 30 % för analys av fritt Hb. Vid analysen av plasma uppstod ett visst sug från analysproben, vilket innebar en risk att få med erytrocyter, om analysproben kom för nära bottenskiktet med erytrocyter, som då kunde ge ett för högt och därmed missvisande resultat av fritt Hb. Detta innebar att < 30 % av e-konc kunde användas till analysen av fritt Hb. Vid analysen av de 53 e-konc i Grupp 2, som endast utfördes en gång, behövdes ingen slang skarvas till, eftersom slangen bara behövde räcka till en analys. I vissa fall kunde dock slangen vara ganska kort (ca 20 cm) och då endast ge ca 2 ml e-konc. För att slippa 19

24 momentet med att svetsa på ytterligare en bit slang för att försäkra sig om att plasman skulle räcka (utan att riskera att få med erytrocyter i proben) överfördes plasman försiktigt till ett smalare 2,5 ml rör. Även om mängden inte räckte till de 275 µl som maskinen krävde för analysen (vilket innebar att den sög in en liten mängd luft i slutet av insuget), verkade maskinen acceptera provmängden ändå eftersom den endast använde 157 µl till själva analysen. Enligt instruktionerna för maskinen var denna programmerad att protestera om det var något fel på provet eller provmängden, därför kunde man lita på att provet var godkänt och att analysen var korrekt utförd [11]. Under de fyra första veckorna strippades e-konc för hand med en stripptång, man fick vara försiktig med att inte strippa över skarven och riskera att den skulle brista. Enligt blodcentralens instruktionsmanual för sterilsvets står det: Den nya svetsen är stark, men inte lika stark som en osvetsad slang. Undvik påfrestningar på den nya svetsen, såsom att dra i slangen eller att böja den kraftigt i svetsen. [15]. Det bör påpekas att en strippning för hand orsakar en avsevärd temporär stress och deformering av plastslangen när man samtidigt måste dra och klämma i slangen med stripptången för att upprätthålla ett vakuum. Detta kan orsaka att svetsen brister och att blodpåsen kontamineras av den omgivande luftens bakterier, vilket vore oacceptabelt Efter samspråk med personalen visade det sig senare, i vecka fem att skarven kunde strippas maskinellt i strippmaskinen. Vid strippning i maskinen, rullas och plattas slangen mekaniskt genom strippmaskinens valsar vilket inte utgör någon större stress på svetsfogen. Denna sena upptäckt kunde ha löst problemet med den för korta slangen på påsen och gjort det möjligt att förlänga slangen i det oändliga och därmed möjliggjort det för statistiken så viktiga dubbelprovet. Men den extra analysen av Grupp 2 gav även inblick i hur upprepad hantering kan påverka hemolysgraden, vilket tillförde det ursprungliga försöket ytterligare en dimension. När innehållet i slangen skulle tömmas användes en sax som förvarades i en kopp med 40 % ytdesinfektionssprit. Spriten användes vid provtagningen de tre första veckorna, detta kan ha påverkat resultatet genom att en droppe sprit ofta överfördes från saxen till änden av slangen som sedan sattes ner i provröret. Det är möjligt att spriten kan ha påverkat blodcellerna i provröret och orsakat ökad hemolysgrad. Denna risk eliminerades under de efterföljande veckorna genom att endast använda en torr sax och ett papper att torka av saxen med. Det är svårt att avgöra om hemolysgraden skulle ha varit lägre utan spritens inblandning. Förutom tidigare nämnda felkällor finns det många andra orsaker som kan ge missvisande resultat, en kan vara att provet inte har blandats tillräckligt länge innan analysen vilket kan resultera i ett för högt eller lågt Hb eftersom erytrocyterna snabbt skiktar sig om det får stå stilla ett tag. Vid beräkningen blir då hemolysgraden för hög eller för låg. En annan kan vara förvaring i för hög temperatur som kan göra att erytrocyternas metabolism ökar och därmed åldras i förtid, vilket leder till förhöjd hemolysgrad. 20

25 En sökning efter publicerade vetenskapliga artiklar eller annan aktuell information om hemolysgrad av lagrade e-konc gav inget resultat. Därför kunde ingen jämförelse göras mellan denna studies resultat och tidigare utförda analyser. 21

26 SLUTSATS En svag ökning av hemolysgraden kunde observeras över tid hos alla prover. Dock överskreds inte gränsvärdet (< 0,8 %) för hemolysgraden hos merparten av enheterna vilket visade på att rutinerna för hanteringen av blodcentralens blodprodukter i Karlskrona, såväl som den nya testade metoden för produktkontroller av hemolysgraden, fungerade väl. Det var även tydligt hur viktigt det är att alla fogar svetsas lufttätt och sterilt, vilket annars mycket snabbt kunde orsaka kontamination som ledde till en gränsöverskridande hemolysgrad. 22

27 TACKORD Ett stort tack till alla som på olika sätt hjälpt mig med mitt examensarbete; överläkare Meta Bratt som varit min externa handledare och avdelningschef Birgitta Backlund och alla andra på blodcentralen och klinisk kemi i Karlskrona. Jag vill även tacka min interna handledare universitetslektor Susanne Widell samt universitetslektor Maria Matsson, kursansvarig på Linnéuniversitetet i Kalmar. 23

28 REFERENSER 1. Olle Henriksson, Margareta Rasmusson. Fysiologi med relevant anatomi, 2:a uppl. Lund: Studentlitteratur; Campbell Farell. Biochemistry, fifth edition. CA USA: Thomson Brooks/Cole; Peter Nilsson-Ehle. Laurells Klinisk kemi i praktisk medicin, 8:e uppl. Lund: Studentlitteratur; Handbok för Blodcentraler, Blodkomponenter: Kvalitetssäkring och kontroll, Svensk Förening för Transfusionsmedicin. Version 3.1, Geoff Daniels, Imelda Bromilow. Blodgruppsserologi. Lund: Studentlitteratur; Metodbeskrivning för Arbetsgång, komponentberedning, Blodcentralen Landstinget i Blekinge. Version 2.0, Gösta Garthon & Bengt Lundh. Blodsjukdomar: Lärobok i hematologi, 3:e uppl. Stockholm: Natur och Kultur; SWEDAC , kl Arbetsgång - produktionskontroller för erytrocyter och plasma, Arbetsbeskrivning, Blodcentralen Landstinget Blekinge. Version 2.1, Bild på analysapparatur; , kl Bilden är tagen med tillstånd av Monika Neuman, PhD, Marketing Director Siemens, Siemens Healthcare Diagnostics, Sweden. 11. Manual till ADVIA 2120 Automated Hematology Analyzer från Bayer AB Health Care Diagnostics Division. 12. Varuinformationsblad för reagens; T /-51, ADVIA 120 HGB Reagent, Cyanide Free, rev. nr 5, Bayer AB Health Care Diagnostics Division Varuinformationsblad för kontroller; ADVIA 2120i 3 in 1 TEST point, low, Ref T ; high, Ref T och normal, Ref T Varuinformationsblad för tvättlösning/sköljmedel; T /-54, ADVIA 120 EZ KLEEN, rev. nr 4. Bayer AB Health Care Diagnostics Division Instruktion för sterilsvets, Blodcentralen Landstinget Blekinge. Version

29 Kalmar Växjö Kalmar Tel Lnu.se