DuoFLEX Cocktail Anti-S100 Anti-Tyrosinase Anti-Melan-A Ready-to-Use (Link) Kod IC001. Avsedd användning

Transkript

1 DuoFLEX Cocktail Anti-S100 Anti-Tyrosinase Anti-Melan-A Ready-to-Use (Link) Kod IC001 Avsedd användning Synonymer för antigen Sammanfattning och förklaring Medföljande reagens För in vitro-diagnostik. DuoFLEX Cocktail Polyclonal Rabbit Anti-S100, Monoclonal Mouse Anti-Human Melan-A, klon A103 och Monoclonal Mouse Anti-Human Tyrosinase, klon T311, (Link) är avsedd att användas inom immunhistokemi tillsammans med Autostainer Link-instrument. Polyclonal Rabbit Anti-S100 märker S100 och är användbar vid identifieringen av S100-positiva neoplasmer som t.ex. malignt melanom (1,2), Langerhans histiocytos (3), kondroblastom (4) och schwannom (5). En panel av antikroppar, inklusive Polyclonal Anti-S100, kod Z0311, har tillämpats av International Lymphoma Study Group för klassificeringen av tumörer av misstänkt histiocytisk/dendritisk celltyp (6). Monoclonal Mouse Anti-Human Tyrosinase, klon T311, är användbar för identifiering av melanocytiska lesioner och melanom. Monoclonal Mouse Anti-Human Melan-A, klon A103, är användbar för identifiering av melanom (7,8) samt är även tillämplig som en användbar markör för angiomyolipom (9). Den kliniska tolkningen av all färgning eller frånvaro av färgning måste göras genom morfologiska studier, med användning av lämpliga kontroller, och måste utvärderas av en kvalificerad patolog inom ramen för patientens anamnes och andra diagnostiska tester. Melan A: MART-1, Tyrosinase: T311, EC S100: En multigenfamilj av låg molekylvikt (MW mellan och ) Ca 2+ -bindande proteiner. Familjen består av 19 medlemmar som är differentiellt uttryckta i ett stort antal celltyper. Därför är S100B (tidigare S100β) vanligast i gliaceller i det centrala och perifera nervsystemet, i melanocyter, kondrocyter och adipocyter, medan S100A1 (tidigare S100A/S100α) är vanligast i kardiomyocyter, skelettmuskelceller med långsam sammandragning, epitelceller i saliv samt njurceller. Dessutom finns S100B i tumörceller och underpopulationer i neuroner, medan S100A1 även har detekterats i hippocampusneuroner. S100A6 uttrycks av fibroblaster samt glatta och hjärtmuskelceller (5). Medlemmar i S100-familjen har varit inblandade i Ca 2+ -beroende reglering av en mängd intracellulära aktiviteter, t.ex. proteinfosforylering, cellproliferation (inklusive neoplastisk transformering) och differentiering (10). Tyrosinas: Ett kopparglykoenzym som är involverat i produktionen av melaninpigment, inklusive såväl eumelanin som feomelanin (11,12). Denna process innebär att tyrosinas katalyserar hydroxyleringen av L-tyrosin till L-dopa och oxidationen av L-dopa till L-dopakinon (11,12). Som en markör av melanocythärkomst är tyrosinas lokaliserad till melanocyter, vilken kan påträffas i förbindelsen mellan läderhuden och överhuden i normal hud, men den upptäcks inte i andra normala celler (13). Pigmenterade delar i ögat, t ex koroidea och iris, innehåller också melanocyter. Uttryck av tyrosinas påträffas även i melanocytiska lesioner, inklusive benigna nevi och majoriteten av primära och metastatiska maligna melanomer, men inte i icke-melanocytiska tumörtyper (13,14,15). Dessutom kan tyrosinas kännas igen av autologa cytotoxiska T-celler från melanompatienter, vilket betyder att de har nytta av tyrosinaspeptider i melanomvacciner (16,17). Melan-A: Isolerad som en melanom-specifik antigen samt är ett transmembranprotein bestående av 118 aminosyror med oviss funktion (7). Melan-A-genen klonades från en human melanomcellinje och dess uttryck på melanom påvisas med autologa cytotoxiska T-celler (19). Melan-A uttrycks i hud, retina och i majoriteten av odlade melanocyter och melanom, medan en stor mängd andra vävnader och cancertyper som testats inte uttrycker Melan-A (7,18,19). Melan-A uttrycks emellertid i angiomyolipom (9). Förutom Melan-A har sju andra melanomantigener identifierats: MAGE-1, MAGE-3, tyrosinas, gp100, gp75, BAGE-1 och GAGE-1, vilka alla känns igen av autologa cytotoxiska T-celler (7). Se Dakos Allmänna instruktioner för immunhistokemisk färgning eller detektionssystemets instruktioner om IHCprocedurer för: (1) Procedurprincip, (2) Material som behövs men inte medföljer, (3) Förvaring, (4) Provberedning, (5) Färgningsprocedur, (6) Kvalitetskontroll, (7) Felsökning, (8) Tolkning av färgningen, (9) Allmänna begränsningar. Bruksfärdig blandning av polyklonal kaninantikropp och monoklonal musantikropp levererad i flytande form i en buffert innehållande stabiliseringsprotein och 0,015 mol/l natriumazid. Polyclonal Rabbit Anti-S100 Monoclonal Mouse Anti-Human Tyrosinase, klon T311, isotyp: IgG2 a, kappa Monoclonal Mouse Anti-Human Melan-A, klon A103, isotyp: IgG1, kappa Immunogen S100: S100 isolerat från kohjärna Tyrosinas: Renat rekombinant oglykosylerat tyrosinasprotein bestående av 452 aminosyror av det 511 aminosyramogna humana tyrosinasproteinet (11) ( ) SE_001 s. 1/5

2 Melan-A: Rekombinant protein uttryckt i E. coli motsvarande Melan-A (7) Specificitet S100-antikroppen har fastfasabsorberats med human plasma och koserumproteiner. När det gäller Western blotting av renat humant rekombinant S100-protein märks antikroppen S100B starkt, S100A1 svagt och S100A6 mycket svagt. Ingen reaktion observerades med de andra testade S100-proteinerna S100A2, S100A3 och S100A4 (20). Antikroppen visade ingen reaktion med humanplasma och koserum i indirekt ELISA. Antikroppen korsreagerar med S100-liknande protein från människa, katt, häst, mus, råtta och svin, vilket visas med immuncytokemi på formalinfixerad, paraffininbäddad vävnad. När det gäller anti-tyrosinas utfördes immunoblotting med användning av L-celler, som transfekterats med tyrosinasgenen, och på fyra cellinjer som uttrycker tyrosinas-mrna: SK-MEL-13, SK-MEL-19, SK-MEL-30 och SK-MEL-37 (11). Konsekvent med tidigare rapporter påvisades ett kluster av proteiner på kda av klon T311 vid immunoblotting av alla fem cellinjer (11). Ytterligare ett band på 55 kda färgades vid immunoblotting av cellinjer som är mycket reaktiva (SK-MEL-19) (1). Dessutom visade immunoblotting i otransfekterade L-celler och tre cellinjer som inte uttrycker tyrosinas mrna (MZ2-MEL3.1, SK-MEL-187 och MZ2-MEL2.2) en negativ reaktion med klon T311 (11). L-celler transfekterade med tyrosinasförknippat protein 1, TRP-1(gp75), reagerade inte heller med klon T311 i immunfluorescenta och immunoblotting-analyser, vilket tyder på att antikroppen inte korsreagerar med det melanosomassocierade proteinet TRP-1(gp75) (11). Anti-Melan-A märker en proteindubblett på kda i Western blotting av cellysater från Melan-A mrnapositiva cellinjer, medan ingen märkning detekteras i Melan-A mrna-negativa cellinjer (7). I immunfällningar av Melan-A positiva cellinjer SK-MEL-13 och SK-MEL-19 märker antikroppen en proteindubblett på kda motsvarande Melan-A, medan ingen fällning detekteras i Melan-A mrna-negativa melanomcellinjer (7). Försiktighetsåtgärder 1. För yrkesmässigt bruk. 2. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN 3), en kemikalie som är mycket giftig i ren form. I produktkoncentrationer kan natriumazid, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten vid kassering, så att inte metallazider ansamlas i avloppet. 3. I likhet med alla produkter av biologiskt ursprung krävs en korrekt hantering. 4. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögon och hud. 5. Oanvänd lösning måste kasseras i enlighet med lokala och statliga föreskrifter. Förvaring Provberedning inklusive material som behövs men inte medföljer Förvaras vid 2 8 C. Får inte användas efter det ut gångsdatum som anges på flaskan. Användaren måste verifiera alla förvaringsförhållanden som avviker från de som specificerats. Det finns inga tydliga tecken som tyder på instabilitet hos denna produkt. Därför bör positiva och negativa kontroller analyseras samtidigt med patientproverna. Kontakta Dako Teknisk Support om du observerar oväntad färgning som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och om du misstänker att något problem med antikroppen förekommer. Antikroppblandningen kan användas för märkning av formalinfixerade paraffininbäddade vävnadssnitt. Vävnadsprover ska snittas i cirka 4 µm tjocka snitt. Förbehandling med värmeinducerad epitopåtervinning (HIER) krävs. Optimala resultat erhålls genom att förbehandla vävnader med EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (kod K8004). Avparaffinerade snitt: Förbehandling av avparaffinerade formalinfixerade paraffininbäddade vävnadssnitt med Dako PT Link (kod PT100/PT101) rekommenderas. Ytterligare information finns i användarhandboken för PT Link. Följ förbehandlingsproceduren som beskrivs i bipacksedeln för EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (kod K8004). Följande parametrar ska användas för PT Link: förvärmningstemperatur: 65 C, temperatur och tid för epitopåtervinning: 97 C i 2 0 (±1) minuter, nedkylning till 65 C. Ta bort Auto stainerobjektglasstället med objektglas från PT Link-tanken och doppa omedelbart ned objektglasen i ett kärl/en tank (t.ex. PT Link-sköljningsstation, kod PT109) innehållande spädd rumstempererad EnVision FLEX Wash Buffer (20x), (kod K8007). Lämna objektglasen i Wash Buffer i 1 5 minuter. Paraffininbäddade snitt: Användning av vattenhaltigt monteringsmedium (Dako Faramount, kod S3025) den föredragna metoden för färgning. Som alternativ provberedning kan både avparaffinering och epitopåtervinning utföras i PT Link med en modifierad procedur. Anvisningar finns i användarhandboken för PT Link. När färgningsproceduren har slutförts måste snitten lufttorkas vid 60 C under 1 timme, nedsänkas i xylen och monteras med permanent monteringsmedium. Alkohol ska undvikas vid permanent montering eftersom det kan försvaga reaktiviteten hos den röda kromogenen. Låt inte vävnadssnitten torka ut under förbehandlingen eller under den följande immunhistokemiska färgningsproceduren före monteringen. För bättre vidhäftning av vävnadssnitten till objektglasen rekommenderas användning av Dako FLEX IHC Microscope Slides (kod K8020). Färgningsprocedur inklusive material som behövs men inte medföljer Det rekommenderade visualiseringssystemet är EnVision DuoFLEX Doublestain System, (Link) (kod SK110). Färgningsstegen och inkubationstiderna är förprogrammerade i programvaran för Autostainer Link. Användarhandboken för Autostainer Link innehåller detaljerade anvisningar för laddning av objektglas och reagenser. Kontakta Dako Teknisk support om det inte finns några protokoll på den Autostainer-plattform som används. Alla inkubationsmoment ska utföras vid rumstemperatur. ( ) SE_001 s. 2/5

3 Optimala förhållanden kan variera beroende på prov- och beredningsmetod och bör bestämmas av varje enskilt laboratorium. Om den utvärderande patologen önskar en annan färgningsintensitet kan en applikationsspecialist/teknisk servicespecialist från Dako kontaktas för information om omprogrammering av protokollet. Bekräfta att prestandan för det justerade protokollet fortfarande är giltig genom att kontrollera att färgningsmönstret är identiskt med det färgningsmönster som beskrivs i "Prestandaegenskaper". Kontrastfärgning i hematoxylin med EnVision FLEX Hematoxylin, (Link) (kod K8008) rekommenderas. Ickevattenhaltigt, permanent monteringsmedium rekommenderas. För permanent montering ska objektglasen lufttorkas vid 60 C och sedan nedsänkas i xylen i 5 minuter. Alkohol ska undvikas vid permanent montering eftersom det kan försvaga reaktiviteten hos den röda kromogenen. Positiva och negativa kontroller bör analyseras samtidigt med patientproverna med samma protokoll. Den positiva kontrollvävnaden bör inkludera blindtarm, tjocktarm och hud och cellerna/strukturerna bör visa reaktionsmönster som beskrivs för dessa vävnader i "Prestandaegenskaper" i alla positiva prover. Tolkning av färgningen Prestandaegenskaper Celler som märkts av antikroppen Anti-S100 visar röd nukleär och cytoplasmisk färgning. Celler som märkts av antikroppen Anti-Tyrosinase visar brun cytoplasmisk färgning och/eller perinukleär färgning. Celler som märkts av antikroppen Anti-Melan-A visar brun cytoplasmisk färgning. Normala vävnader: Positiv märkning med Anti-S100 observerades i vissa Langerhanska celler och melanocyter i hud, interdigitala retikelceller i lymfkörtel, medullära retikulära epitelceller i tymus, kondrocyter i broskvävnad, adipocyter i vissa biopsier, myoepitelceller i spottkörtlar och bröst, follikel-stjärnformade celler i hypofysen samt Schwanns celler och gliaceller i nervvävnad. Svag märkning påträffades i epitelceller i bröst- och svettkörtlar. En negativ reaktion med antikroppen observerades i normala hepatocyter, gallgångsepitel, gallblåseepitel, matstrupe, magsäck, litet och stort intestinalt epitel, njurepitel samt urotel- och endotelceller (21). I tjocktarmen visar satellitceller i perifer nerv i Auerbachs plexus en stark nukleär och cytoplasmisk färgningsreaktion, medan adipocyter och ganglieceller i Auerbachs plexus visar en svag till måttlig nukleär och cytoplasmisk färgningsreaktion. Anti-Tyrosinase, klon T311, testades med en panel med 33 normala vävnader med hjälp av immunhistokemi och endast huden var positiv (13). I normal hud var melanocyter immunreaktiva, medan basala keratinocyter i huden förblev negativa (11,13). Anti-Melan-A, klon A103, märker hud, medan magsäck, tjocktarm, lunga, lever, mjälte, njure, testiklar, urinblåsa, bröst, äggstock, glattmuskel och fettvävnad inte märks av antikroppen (7,9). Steroidproducerande celler i binjurebarken, äggstock och testiklar har rapporterats märkas av antikroppen (8). Onormala vävnader: Av malignt melanom märktes 31/31 (100 %) konventionella kutana, 23/24 (96 %) metastatiska, inklusive 10 amelanotiska, 6/6 desmoplastiskt och 1/1 myxoida maligna melanom av antikroppen Anti-S100. Av 30 benigna och 15 dyplastiska naevi noterades allmän homogen märkning i samtliga fall (1). I en annan studie av primärt malignt kutant melanom (2) var 67/67 positiva med antikroppen, inklusive 5/5 spindelceller och desmoplastiska tumörer. I 27 fall av Langerhanska histiocytos märktes 88,5 % av antikroppen, inklusive lokaliserad och utbredd sjukdom (3). Av 30 undersökta kondroblastom visade samtliga en stark märkning av kondroblaster med antikroppen (4). Av typiska benigna schwannom var 12/12 positiva med antikroppen liksom 2/4 maligna schwannom. Av neurofibrom visade 6/6 svagt uttryck av S100, förutom vissa isolerade celler och några ålliknande cellprocesser som var utmärkande positiva (5). Observera att S100 uttrycktes i 15 av 133 icke-melanocytiska primära kutana neoplasmer, d.v.s. 7/16 ekkrina karcinom, 2/8 metastatiska viscerala karcinom, 2/2 maligna schwannom och 4/5 leiomyosarkom (2). Av primära adenokarcinom var 24/25 (84 %) äggstock, 12/15 (80 %) spottkörtel, 28/36 (78 %) endometrium, 15/23 (65 %) njure, 12/20 (60 %) bröst, 7/28 (25 %) tjocktarm/ändtarm, 2/10 (20 %) mage och 2/27 (7 %) lungadenokarcinom positivt märkta av antikroppen. Adenokacinom av matstrupe, gallblåsa, bukspottkörtel och prostata var alla negativa i den här studien. De flesta primära neoplasmerna som uttryckte S100 var också positiva för detta protein i metastatiskt fokus (22). Av rabdomyosarkom märktes 7/60 (12 %) av antikroppen. De S100-positiva tumörerna var också positiva för vimentin och desmin (23). Anti-Tyrosinase, klon T311, testades på benigna och maligna melanocytiska lesioner och befanns färga majoriteten av benigna nevi och melanom som testades. Låg tyrosinasimmunreaktivitet observerades i melanomer av desmoplastisk och spindelcellstyp (11,13,14,15). Specificiteten av anti-tyrosinase för melanocytiska lesioner har påvisats genom immunfärgning i mer än 70 olika icke-melanocytiska tumörtyper, där ingen immunreaktivitet påträffades, vilket tyder på att uttrycket av tyrosinas är begränsad till celler av melanocytisk härkomst (13). I metastatiska melanom märktes 16/21 fall av Anti-Melan-A, klon A103 och visade positiv homogen, cytoplasmisk färgning i >80-90 % av melanomcellerna, förutom en som visade fokal färgning (7). I en annan undersökning av 10 benigna melanocytiska nevi, 10 primära melanom och 75 metastatiska melanom märkte antikroppen 10/10 benigna melanocytiska nevi, 7/10 primära melanom och 61/75 metastatiska melanom (8). Bland 111 karcinom, i huvudsak adenokarcinom och skivepitelcellskarcinom, 40 könscellstumörer och 33 blandade icke-melanocytiska epiteloida tumörer, märktes ingen av antikroppen. Antikroppen märkte 5/5 adenom i binjurebarken, 16/16 primära och 13/13 metastatiska binjurekarcinom, men även 4/4 Leydig-celltumörer i testiklar och 3/4 Sertoli-Leydigcelltumörer i äggstock märktes av antikroppen. I en annan studie av 316 fall, inklusive 21 tumörer i binjure, 16 metastatiska karcinom i binjure, 10 feokromocytom och 269 extra-binjurekarcinom märker antikroppen 14/14 binjureadenom, 7/7 binjurekarcinom, 0/16 metastatiska karcinom till binjuren och 0/10 feokromocytom. Av 269 extra-binjurekarcinom märktes ett enda seröst karcinom i äggstock. I en undersökning av 18 angiomyolipom märktes alla 18 av antikroppen (9). I en annan rapport märktes alla tre angiomyolipom som testats av antikroppen (8). ( ) SE_001 s. 3/5

4 Referenser 1. Orchard GE. Comparison of immunohistochemical labeling of melanocyte differentiation antibodies melan- A, tyrosinase and HMB 45 with NKIC3 and S100 protein in the evaluation of benign naevi and malignant melanoma. Histochem J 2000; 32: Wick MR, Swanson PE, Rocamora A. Recognition of malignant melanoma by monoclonal antibody HMB- 45. An immunohistochemical study of 200 paraffin-embedded cutaneous tumors. J Cutan Pathol 1988; 15: Ye F, Huang S-W, Dong H-J. Histiocytosis X. S-100 protein, peanut agglutinin, and transmission electron microscopy study. Am J Clin Pathol 1990; 94: Edel G, Ueda Y, Nakanishi J, Brinker KH, Roessner A, Blasius S, et al. Chondroblastoma in bone. A clinical, radiological, light and immunohistochemical study. Virchows Arch A Pathol Anat 1992; 421: Gould VE, Moll R, Moll I, Lee I, Schwechheimer K, Franke WW. The intermediate filament complement of the spectrum of nerve sheath neoplasms. Lab Invest 1986; 55: Pileri SA, Grogan TM, Harris NL, Banks P, Campo E, Chan JKC, et al. (review). Tumours of histiocytes and accessory dendritic cells: an immunohistochemical approach to classification from the International Lymphoma Study Group based on 61 cases. Histopathology 2002; 41: Chen Y-T, Stockert E, Jungbluth A, Tsang S, Coplan KA, Scanlan MJ, et al. Serological analysis of Melan-A (MART-1), a melanocyte-specific protein homogeneously expressed in human melanomas. Proc Natl Acad Sci 1996;93: Jungbluth AA, Busam KJ, Gerald WL, Stockert E, Coplan KA, Iversen K, et al. An anti-melan-a monoclonal antibody for the detection of malignant melanoma in paraffin-embedded tissues. Am J Surg Pathol 1998;22: Jungbluth AA, Iversen K, Coplan K, Williamson B, Chen Y-T, Stockert T, et al. Expression of melanocyteassociated markers gp-100 and Melan-A/MART-1 in angiomyolipomas. Virchows Arch 1999;434: Donato R. Functional roles of S100 proteins, calcium-binding proteins of the EF-hand type (review). Biochim Biophys Acta 1999; 1450: Chen YT, Stockert E, Tsang S, Coplan KA, Old LJ. Immunophenotyping of melanomas for tyrosinase: implications for vaccine development. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92(18): Garcia-Borron JC, Solano F. Molecular anatomy of tyrosinase and its related proteins: beyond the histidinebound metal catalytic center. Pigment Cell Res 2002; 15(3): Jungbluth AA, Iversen K, Coplan K, Kolb D, Stockert E, Chen YT, Old LJ, Busam K. T311-an antityrosinase monoclonal antibody for the detection of melanocytic lesions in paraffin embedded tissues. Pathol Res Pract 2000; 196(4): Clarkson KS, Sturdgess IC, Molyneux AJ. The usefulness of tyrosinase in the immunohistochemical assessment of melanocytic lesions: a comparison of the novel T311 antibody (anti-tyrosinase) with S-100, HMB45, and A103 (anti-melan-a). J Clin Pathol 2001; 54(3): Hofbauer GF, Kamarashev J, Geertsen R, Boni R, Dummer R. Tyrosinase immunoreactivity in formalinfixed, paraffin-embedded primary and metastatic melanoma: frequency and distribution. J Cutan Pathol 1998; 25(4): Slingluff CL Jr, Petroni GR, Yamshchikov GV, Barnd DL, Eastham S, Galavotti H, Patterson JW, Deacon DH, Hibbitts S, Teates D, Neese PY, Grosh WW, Chianese-Bullock KA, Woodson EM, Wiernasz CJ, Merrill P, Gibson J, Ross M, Engelhard VH. Clinical and immunologic results of a randomized phase II trial of vaccination using four melanoma peptides either administered in granulocyte-macrophage colonystimulating factor in adjuvant or pulsed on dendritic cells. J Clin Oncol 2003; 21(21): Zajac P, Oertli D, Marti W, Adamina M, Bolli M, Guller U, Noppen C, Padovan E, Schultz-Thater E, Heberer M, Spagnoli G. Phase I/II clinical trial of a nonreplicative vaccinia virus expressing multiple HLA-A0201-restricted tumor-associated epitopes and costimulatory molecules in metastatic melanoma patients. Hum Gene Ther 2003; 14(16): Coulie PG, Brichard V, Van Pel A, Wölfel T, Schneider J, Traversari C, et al. A new gene coding for a differentiation antigen recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on HLA-A2 melanomas. J Exp Med 1994;180: Kawakami Y, Eliyahu S, Delgado CH, Robbins PF, Rivoltini L, Topalian SL, et al. Cloning of the gene coding for a shared human melanoma antigen recognized by autologous T cells infiltrating into tumor. Proc Natl Acad Sci 1994;91: Ilg EC, Schäfer BW, Heizmann CW. Expression pattern of S100 calcium-binding proteins in human tumors. Int J Cancer 1996; 68: Vanstapel M-J, Gatter KC, de Wolf-Peeters C, Mason DY, Desmet VD. New sites of human S-100 immunoreactivity detected with monoclonal antibodies. Am J Clin Pathol 1986; 85: Herrera GA, Turbat-Herrera EA, Lott RL. S-100 protein expression by primary and metastatic adenocarcinomas. Am J Clin Pathol 1988; 89: Coindre J-M, de Mascarel A, Trojani M, de Mascarel I, Pages A. Immunohistochemical study of rhabdomyosarcoma. Unexpected staining with S100 protein and cytokeratin. J Pathol 1988; 155: ( ) SE_001 s. 4/5

5 Utgåva 03/09 ( ) SE_001 s. 5/5