Kod K4002: Följande är tillräckligt för 150 vävnadssnitt, baserat på 100 µl per snitt:

Transkript

1 Dako EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit Kod K ml Kod K ml Avsedd användning För in vitro-diagnostik. Dessa instruktioner gäller för Dako EnVision +, Peroxidase (DC EnVision+ System, HRP). Denna sats är avsedd för användning med primärantikroppar från kanin tillhandahållna av användaren för kvalitativ identifiering av antigener genom ljusmikroskopi hos normala och patologiska paraffininbäddade vävnader, kryostatvävnader eller cellpreparat. Vävnader behandlade i olika fixativ inklusive etanol, B-5 Bouins, zinkformalin och neutralbuffrat formalin kan användas. Se Allmänna instruktioner för immunhistokemisk färgning eller detektionssystemets Instruktioner för IHCprocedurer för:(1) Procedurprinciper, (2) Material som behövs, men inte medföljer, (3) Förvaring, (4) Provberedning, (5) Färgningsprocedur, (6) Kvalitetskontroll, (7) Felsökning, (8) Färgningstolkning, (9) Allmänna begränsningar. Sammanfattning och förklaring Procedurprinciper Medföljande reagenser EnVision+ System, HRP är en IHC-färgningsteknik i två steg. Detta system är baserat på en HRP-märkt polymer som är konjugerad med sekundära antikroppar. Den märkta polymeren innehåller inte avidin eller biotin. Ospecifik färgning som resulterar från endogen avidinbiotinaktivitet i lever, njure, lymfvävnader och kryostatsnitt elimineras eller reduceras följaktligen avsevärt. Reagensen i EnVision+, HRP är bruksfärdig. Detta är en extremt känslig metod och följaktligen är optimala spädningar av primär antikropp upp till 20 gånger högre än de som används till den mer traditionella PAP-tekniken och fler gånger större än de som används i traditionella ABC- eller LSAB-metoder. Detta protokoll erbjuder ett förhöjt genereringssystem för detektering av antigener som finns i låga koncentrationer eller för lågtiterprimärantikroppar. Primära antikroppar producerade i kanin reagerar väl med den märkta polymeren. Tolkningen av positiv färgning eller avsaknad av denna bör kompletteras av morfologiska och histologiska studier med rätta kontroller. Endogen peroxidasaktivitet hämmas av att provet inkuberas med en passande endogen blockeringsreagens. Provet inkuberas sedan med en lämpligt karakteriserad och spädd primär kaninantikropp följt av inkubation med den märkta polymeren med hjälp av två sekventiella 30 minuters inkubationer. Det bör noteras att för antikroppar som behöver enzymdigestion eller target retrieval, kan en förlängning av inkubationstiderna för primär antikropp och märkt polymer med 5 till 10 minuter vara nödvändig. Färgning slutförs genom en 5 10 minuters inkubation med passande substratkromogen. Kod K4002: Följande är tillräckligt för 150 vävnadssnitt, baserat på 100 µl per snitt: Flaska nr Mängd Beskrivning 2 1x15 ml Märkt polymer: Peroxidasmärkt polymer konjugerad till get antikaninimmunoglobuliner i Tris-HCl-buffert som innehåller stabiliserande protein och en antimikrobiell agent. Kod K4003: Följande är tillräckligt för 1100 vävnadssnitt, baserat på 100 µl per snitt: Flaska nr Mängd Beskrivning 1 1x110 ml Märkt polymer: Peroxidasmärkt polymer konjugerad till get antikaninimmunoglobuliner i Tris-HCl-buffert som innehåller stabiliserande protein och en antimikrobiell agent. ( ) SE_003 s. 1/6

2 Material som behövs, men inte medföljer Absorberande trasorkontrollvävnad, positiv och negativ Kontrastfärg; vattenbaserad, som t.ex. Mayer's Hematoxylin eller Lillie's Modified Mayer's Hematoxylin (kod S3309) Täckglas Destillerat vatten Blockeringsreagens för endogena peroxidaser, såsom Dual Endogenous Enzyme Block (kod S2003) Etanol, absolut och 95 % Ljusmikroskop (20x 800x) Monteringsmedier, som t.ex. Glycergel Mounting Medium (kod C0563) eller Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kod S3025) eller icke vattenbaserat permanent monteringsmedium, Ultramount (kod S1964) Primära antikroppar och negativ kontrollreagensobjektglas, poly-l-lysin-belagda eller Silanized Slides (kod S3003) Färgburkar eller bad Substratkromogenlösning som t.ex. AEC+ Substrate-Chromogen (kod K3469, 110 ml, bruksfärdig) eller Liquid DAB+ (kod K3468) Timer (med kapacitet för 3 40 minuters intervaller)tvättflaskor Tvättbuffertlösning Xylen, toluen eller xylenersättning Valfritt material som behövs, men inte medföljer Ammoniumhydroxid, 15 mol/l spädd till 0,037 mol/l PAP Pen (kod S2002) Försiktighetsåtgärder 1. För professionella användare. 2. Använd inte reagenser efter utgångsdatum för föreskriven förvaringsmetod. Om reagenserna förvaras under andra förhållanden än de som specificeras här, måste dessa valideras av användaren. 3. Använd inte reagenser från andra satsnummer eller från satser från andra tillverkare. 4. Enzymer och substratkromogener kan påverkas negativt om de utsätts för alltför starkt ljus. Förvara inte satsdelarna eller utför färgning i starkt ljus som t.ex. direkt solljus. 5. Inkubationstider eller temperaturer andra än de som anges kan ge felaktiga resultat; alla sådana ändringar måste godkännas av användaren. 6. Som med alla produkter som kommer från biologiska källor måste korrekta procedurer användas vid hanteringen. 7. Bär lämplig personskyddsutrustning för att undvika kontakt med ögon och hud. 8. Oanvänd lösning bör kastas enligt lokala, statliga och federala bestämmelser. Förvaring EnVision+, HRP ska förvaras i 2 8 C. Får ej frysas. Använda inte efter det utgångsdatum som står på reagensflaskorna och satsetiketten. Förändringar i utseendet hos reagensen, som t.ex. utfällning, kan indikera instabilitet eller försämring. I sådana fall bör reagenserna inte användas. Det finns inga tydliga tecken som indikerar instabilitet hos dessa produkter. Därför bör positiva och negativa kontroller köras samtidigt med patientprover. Kontakta Dako tekniska support om oväntad färgning observeras som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och problem med satsen misstänks. ( ) SE_003 s. 2/6

3 Reagensberedning Nedanstående reagenser bör beredas före färgning. TvättbuffertlösningTBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (kod S3006) är den rekommenderade tvättbufferten för automatiserad och manuell IHC-detektering. TBS, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline (kod S1968) och PBS, 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (kod S3024) är också lämpliga tvättbuffertlösningar för manuell färgning. Tvättbuffertlösningar innehållande natriumazid rekommenderas ej. Natriumazid inaktiverar pepparrotsperoxidas (HRP), vilket resulterar i negativ färgning. Förvara oanvänd buffert i 2 8 C. Kas ta bufferten om den är grumlig till utseendet. Destillerat vatten kan användas för sköljning av peroxidasblock, substrat och kontrastfärg. Primär antikroppnp-series Plus bruksfärdiga antikroppar är optimerade och rekommenderas för användning med Dako Plus högsensitiva detektionssystem. Koncentrerade antikroppar finns också tillgängliga från Dako. Optimering av koncentrerade antikroppar fordras av slutanvändaren. Spädningar bör beredas med hjälp av Antibody Diluent (kod S0809) eller en spädningsvätska som innehåller 0,05 mol/l Tris- HCl-buffert med 1% bovinserumalbumin (BSA). Dako N-Series bruksfärdiga antikroppar är inte optimerade för användning med Dako Plus detektionssystem. För de flesta primära antikroppar som används med denna sats räcker det med en inkubationstid på 30 minuter. Negativ kontrollreagens Under ideala förhållanden innehåller en negativ kontrollreagens en antikropp som inte visar någon specifik reaktivitet med humana vävnader eller normalt/ icke-immunt serum i samma matrix/lösning som den spädda primära antikroppen. Den negativa kontrollreagensen bör vara samma subklass och djurart som den primära antikroppen, spädd till samma immunglobulin- eller proteinkoncentration som den spädda primära antikroppen med användning av samma spädningsvätska. Inkubationsperioden för den negativa kontrollreagensen bör motsvara den primära antikroppen. Vid användning av Dako NP-Series Plus bruksfärdiga antikroppar, rekommenderas Universal Negative Control+ optimerade för användning med kanin (kod NP001) NP-Series Plus bruksfärdiga antikroppar som negativ kontrollreagens. För specifik information angående beredning av negativ kontrollreagens, se avsnittet Kvalitetskontroll. Kontrastfärg Den färgade slutprodukten av färgningsreaktionen är alkohollöslig och kan användas med alkohol- eller vattenbaserade kontrastfärger som Mayer's hematoxylin eller Lillie's Modified Mayer s Hematoxylin (kod S3309). Efter kontrastfärgning med hematoxylin, skölj ordentligt i destillerat vatten och doppa objektglasen med vävnad i ett bad av 0,037 mol/l ammoniak eller liknande blåningsmedel. 0,037 mol/l ammoniakvatten bereds genom att blanda 2,5 ml 15 mol/l (koncentrat) ammoniumhydroxid med 1 liter vatten. Oanvänd 0,037 mol/l ammoniak kan förvaras i rumstemperatur (20 25 C) i en tättslutande flaska i upp t ill 12 månader. Se tillverkarens riktlinjer för alternativa kontrastfärgningsprocedurer. Monteringsmedier Glycergel Mounting Medium (kod C0563) eller Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kod S3025) rekommenderas för vattenmontering. Glycergel måste värmas till åtminstone 50 C precis före användning. Icke vattenbaserat permanent monteringsmedium (Ultramount, kod S1964) kan också användas. Provberedning Se Allmänna instruktioner för immunhistokemisk färgning och/eller antikroppsspecifikationsbladet. Före IHC-färgning måste vävnaderna fixeras och behandlas. Fixering förhindrar autolys och röta av använda vävnader, bevarar antigenicitet, förhöjer brytningsindex av vävnadsbeståndsdelarna och höjer motståndet mot vävnadsbehandling hos cellulära element. Vävnadsbehandling inkluderar dehydrering, klarnande av dehydreringsmedel, infiltration av inbäddade medier, inbäddning och delning av vävnader. De vanligaste fixativen för IHC-vävnadspreparat diskuteras i de allmänna instruktionerna för immunhistokemisk färgning. Detta är endast riktlinjer. Optimala procedurer måste bestämmas och verifieras av användaren. ( ) SE_003 s. 3/6

4 Färgningsprocedur Anmärkningar om proceduren Användaren bör läsa dessa instruktioner noggrant och bekanta sig med produktinnehållet före användning. Den reagens och de instruktioner som medföljer har utformats för optimalt genomförande. Ytterligare spädning av reagensen eller förändring av inkubationstiderna eller temperaturerna kan ge felaktiga resultat. Alla reagenser bör balanseras till rumstemperatur (20 25 C) före immunfärgning. På samma sätt bör alla inkubationer utföras i rumstemperatur. Låt inte vävnadssnitten torka under färgningsproceduren. Torkade vävnadssnitt kan visa ökad ospecifik färgning. Täck objektglas som utsätts för drag. Om förlängda inkubationer används, placera vävnaderna i fuktig omgivning. Sensitiviteten hos EnVision+ System, HRP kan höjas ytterligare genom att förlänga inkubationstiderna i steg 2 och 3 i 5 10 minuter. Färgningsprotokoll STEG 1 PEROXIDASBLOCK Knacka av överflödig buffert. Använd en luddfri vävnad (som t.ex. Kimwipe eller gasbinda), torka försiktigt runt provet för att avlägsna eventuell resterande vätska och för att hålla reagensen inom det föreskrivna området. Applicera tillräckligt mycket peroxidasblock från flaska 1 för att täcka provet. Inkubera i 5 (±1) minuter. Skölj försiktigt med destillerat vatten eller buffertlösning från en tvättflaska (rikta inte flödet direkt på vävnaden) och placera i ett färskt buffertbad. STEG 2 PRIMÄR ANTIKROPP ELLER NEGATIV KONTROLLREAGENS Knacka av överflödig buffert och torka objektglasen som tidigare. Applicera tillräckligt mycket optimalt spädd primär antikropp eller negativ kontrollreagens för att täcka provet. Inkubera i 30 (±1) minuter. Skölj försiktigt med buffertlösning från en tvättflaska (rikta inte flödet direkt på vävnaden) och placera i ett färskt buffertbad. Om färgningsproceduren måste avbrytas, kan objektglasen förvaras i ett buffertbad efter inkubationen av den primära antikroppen (steg 2) i upp till en timme i rumstemperatur (20 25 C) utan att påverka färgningen. STEG 3 STEG 4 STEG 5 PEROXIDASMÄRKT POLYMER Knacka av överflödig buffert och torka objektglasen som tidigare. Applicera tillräckligt mycket märkt polymer från flaska 2 för att täcka provet. Inkubera i 30 (±1) minuter. Skölj objektglasen som i steg 2. SUBSTRATKROMOGEN Torka objektglasen som tidigare. Applicera tillräckligt mycket substratkromogenlösning för att täcka provet Inkubera i 5 10 minuter. Skölj försiktigt med destillerat vatten från en tvättflaska (rikta inte flödet direkt på vävnaden). SamLa substratkromogenavfallet i en behållare för farligt material för korrekt avfallshantering. HEMATOXYLINKONTRASTFÄRG (valfritt) Sänk ned objektglasen i ett bad av vattenbaserat hematoxylin (kod S3309). Inkubationslängden beror på styrkan hos det hematoxylin som används. Skölj försiktigt i bad med destillerat vatten. Doppa objektglasen 10 gånger i ett bad av 0,037 mol/l ammoniak eller liknande blåningsmedel. Skölj objektglaset i ett bad med destillerat eller avjoniserat vatten i 2 5 minuter. STEG 6 MONTERING Prov kan monteras och täckas med ett vattenbaserat monteringsmedium som t.ex. Glycergel Mounting Medium (kod C0563) eller Faramount (kod S3025) eller icke vattenbaserad permanent monteringsmedium, Ultramount (kod S1964). Objektglasen kan också dehydreras och monteras permanent. Kvalitetskontroll Skillnader i vävnadsbehandling och tekniska procedurer i användarens laboratorium kan producera betydande ändringar i resultaten, vilket framtvingar regelbundet utförande av interna kontroller. Se riktlinjerna för kvalitetskontroll från College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry och referenserna 1 till 3 för ytterligare information. Se specifikationsbladet för varje primär antikropp som används för detaljerad beskrivning angående sensitivitet och immunoreaktivitet. Se Allmänna instruktioner för immunhistokemisk färgning för vidare information om positiva och negativa kontroller. ( ) SE_003 s. 4/6

5 Färgningstolkning Produktspecifika begränsningar Se Allmänna instruktioner för immunhistokemisk färgning för tolkningsriktlinjer. Vävnadsfärgningen är beroende av korrekt hantering och behandling av vävnader före färgning. Inkorrekt fixering, frysning, tining, tvättning, torkning, uppvärmning, delning eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan framkalla artefakter, instängning av antikroppar eller falskt negativa resultat. Användning av gamla eller obuffrade fixativ eller exponering av vävnader för höga temperaturer (högre än 60 C) under behandlingen kan resultera i nedsatt färg ningssensitivitet. Endogen peroxidas eller pseudoperoxidasaktivitet kan hittas i hemoproteiner som hemoglobin, myoglobin, cytokrom och katalas samt i eosinofiler. 4,5 Denna aktivitet kan hämmas genom att inkubera proverna med peroxidasblock i fem minuter före applicering av den primära antikroppen. Blod- och benmärgsutstryk och frysta vävnader kan också behandlas med denna reagens. Denna procedur utplånar dock inte det rödaktigabruna pigmentet från hemoproteiner. Alternativt kan en lösning av metanolväteperoxid användas. Vissa antigener kan denatureras med denna procedur. Vävnader från personer infekterade med hepatit B-virus och som innehåller hepatit B ytantigen (HbsAg) kan uppvisa ospecifik färgning med pepparrotsperoxidas. 6 Normala/icke-immuna sera från samma djurkälla som de sekundära antisera som används i blockeringsstegen kan orsaka falskt negativa eller falskt positiva resultat på grund av autoantikroppar eller naturliga antikroppar. Reagenserna i denna sats har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan resultera i förlust av antigendetektion. Felsökning Problem Möjlig orsak Föreslagen åtgärd 1. ngen färgning av något objektglas. 2. Svag färgning av alla objektglas. 3. Överdriven bakgrundsfärgning i alla objektglasen. 1a. Reagenser inte använda i rätt ordning. 1b. Natriumazid i buffertbad. 2a. Snitten behåller för mycket lösning efter vattenbadet. 2b. Objektglasen ej inkuberade tillräckligt länge med antikroppar eller substratblandning. 3a. Proven innehåller hög endogen peroxidasaktivitet. 3b. Paraffinet ofullständigt avlägsnat. 3c. Objektglasen inte ordentligt sköljda. 3d. Snabbare än normal substratreaktion p.g.a. t.ex. för hög rumstemperatur. 3e. Snitten torkade under färgningsproceduren. 3f. Ospecifik bindning av reagenser till vävnadssnitt. 1a. Granska appliceringen av reagenser. 1b. Använd färsk, azidfri buffert. 2a. Knacka försiktigt av överflödig lösning företorkning runt snittet. 2b. Granska rekommenderade inkubationstider. 3a. Använd längre inkubationstid av peroxidas- block, flaska 1. 3b. Använd färska xylen- eller toluenbad. Om olika objektglas färgas samtidigt, bör det andra xylenbadet innehålla färsk xylen. 3c. Använd färska lösningar i buffertbad och tvättflaskor. Använd alternativt TBST 0,05 mol/l Tris-buffert innehållande 0,3 mol/l NaCl och 0,1% Tween (kod S3306). 3d. Använd kortare inkubationstid med substratkromogen lösning. 3e. Använd fuktkammare. Torka endast tre till fyra objektglas på samma gång före applicering av reagensen. 3f. Applicera en blockeringslösning innehållande irrelevant protein. 3g. Antikropp alltför koncentrerad. 3g. Använd högre spädning av den primära antikroppen. ANM.: Om problemet inte kan tillskrivas någon av ovannämnda orsaker, eller om föreslagen korrigeringsåtgärd inte löser problemet, kontakta Dako tekniska support för vidare assistans. Ytterligare information om färgningstekniker och provberedning finns i Handbook -Immunochemical Staining Methods 7 (tillgänglig hos Dako), Atlas of Immunohistology 8 och Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 9 ( ) SE_003 s. 5/6

6 Referenser 1. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24 A:4 3. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73: Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Ytterligare referenser Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3 8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Edition 11/12 ( ) SE_003 s. 6/6