Test av immunohistokemiska markörer för differentialdiagnostik mellan Spitz nevus och melanom.

Transkript

1 Institutionen för naturvetenskap Examensarbete Test av immunohistokemiska markörer för differentialdiagnostik mellan Spitz nevus och melanom. Biljana Stojakovic Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap Nivå: Grundnivå Nr: 2010:BL4

2 Test av immunohistokemiska markörer för differentialdiagnostik mellan spitz nevus och melanom. Biljana Stojakovic Examensarbete, biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng Filosofie Kandidatexamen Handledare: Leg. Läkare, Suzanne Johansson Universitetslektor, Christina Gustafson- Svärd Examinator: Universitetslektor, Maria Mattsson Avdelning för Klinisk Patologi Länssjukhuset Kalmar Kalmar Institutionen för naturvetenskap Linneuniversitetet Kalmar Institution för naturvetenskap Linneuniversitetet Kalmar Examensarbetet ingår i Biomedicinska analytikerprogrammet 180 högskolepoäng Sammanfattning Spitz nevus beskrevs först av Sophie Spitz 1948 som juvenile melanoma och är en typ av benign melanocytär tumör som består av spolformiga eller epiteloida celler. Att skilja spitz nevus från malignt melanom/ spitzoida melanom kan vara mycket svårt histologiskt. Kännetecken för melanom är att de saknar symmetri och utmognad mot djupet i dermis. I övrigt ses kärnpolymorfism och hyperkromatiska kärnor. Syftet med studien var att undersöka om det går att använda de immunohistokemiska markörerna Anti- humant HMB-45 (human melanosoma black 45), Anti- humant CD99 och Anti- humant Ki- 67, för att bestämma om en tumör kan betraktas som benign eller malign vid differentialdiagnostik mellan spitz nevus och malignt melanom/ spitzoida melanom. I studien ingick 21 fall med formalinfixerad paraffininbäddad vävnad, som tidigare diagnostiserade spitz nevus, spitzoida melanom eller malignt melanom. Immunohistokemin omfattar olika metoder där man med hjälp av antikroppar kan detektera olika antigen i en vävnad. Metoderna innebär att en antigen- antikropps reaktion visualiseras med hjälp av olika visualiseringssystem, där enzym är vanligast. I utförandet gjordes infärgningen enligt EnVision teknik (Dako, Danmark), som är en indirekt metod med en dextranryggradkedja bestående av sekundära antikroppar och enzymet HRP (horseradish peroxidase). Metoden kräver förbehandling av paraffininbäddad formalinfixerad vävnad, där en epitopåtervinning sker. Vanligaste epitopåtervinningen sker med hjälp av en upphettningsmetod HIER (heat induced epitope retrieval). Resultatet bedömdes mikroskopiskt där en brunfärgad slutprodukt sågs efter den immunohistokemiska färgningen. I alla kontrollsnitt sågs en tydlig positivitet. Antihumant HMB- 45 färgade in cytoplasman i omogna melanocyter. I samtliga fall sågs en stark, diffus infärgning i den ytliga delen av dermis. Anti humant Ki- 67 var en svårbedömd antikropp då prolifierande lymfocyter blev positiva. Anti- humant CD99 infärgade plasmamembranet. Ingen skillnad sågs mellan spitz nevus och spitzoida melanom/ maligna melanom. Studien var en pilotstudie, där resultatet visade att man ännu inte kan vara hjälpt av immunohistokemiska markörer vid differentialdiagnostik mellan spitz nevus och malingt melanom/ spitzoida melanom.

3 Abstract Spitz nevus was first described by Sophie Spitz in 1948 as juvenile melanoma. The lesion is a benign melanocytic tumor, which consists of epiteloid- and spindelshaped cells. Histological is spitz nevus difficult to distinguish from malign melanomas and spitzoid melanomas. Loss of symmetry, loss of maturation in the deep component, nuclear polymorphism and hyper chromatic nucleus are features which can be found in melanomas. Some of these features are often seen in spitz nevus. The purpose of this study was to investigate what help we have from immunohistochemical markers Anti- human HMB-45 (human melanosoma black 45), Anti- human CD99 and Anti- human Ki- 67 antigen to distinguish spitz nevus from spitzoid melanomas and malign melanomas. The study included 21 cases with formalin fixed paraffin embedded tissue. These cases where previous diagnosed as spitz nevus, spitzoid melanomas and malign melanomas. Immunohistochemical staining includes several methods where antibodies are used to detect antigen in tissues. Different visualization systems are used to visualize an antibody- antigen reaction. The most common visualization systems are enzymes. The study was made according to EnVision method (Dako, Denmark), which is an indirect method with secondary antibodies and HRP (horseradish peroxidase) bound to a dextranchain. Paraffin embedded, formalin fixed tissue requires an antigen retrieval before immunohistochemical staining. HIER (heat induced epitope retrieval) is most common use in this purpose. The results were assessed microscopic, where browning endproduct was seen after immunohistochemical staining. Immunohistochemical staining gave clear positive controls. Anti- human HMB- 45 was present in all immature melanocytic cells. Strong, diffuse staining in superficial component was seen in all cases with Anti- human HMB- 45. Anti- human Ki- 67 was an unpredictable antibody, because lymphocytes had high proliferation and where hard to distinguish from melanocytes. Anti- human CD99 gave a brown stained plasma membrane. There was no difference in staining between spitz nevus and spitzoid melanoma/ malign melanoma with Anti- human CD99. This pilot study shows that staining with immunohistochemical markers is not a helpful tool to distinguish spitz nevus from spitzoid melanomas and malign melanomas.

4 Innehållsförteckning Introduktion.1 Huden.1 Spitz nevus..3 Malignt melanom/ Spitzoida melanom...4 Immunohistokemi...5 Antigen och antikroppar.6 Antikroppstiter och inkubationstid 6 Fixering och antigen retrieval Immunohistokemisk färgning HMB Ki CD Hypotes...9 Syfte...9 Material och metod.10 Provmaterial...10 Etik 10 Snittning 10 Kontrollmaterial.10 Antigen retrieval 11 Optimering av Anti- human CD Immunohistokemisk färgning...11 Dehydrering och montering...11 Utvärdering Resultat Diskussion...18 Tackord.21 Referenser 22 Bilagor Bilaga 1...I Bilaga 2..II

5 Introduktion Huden Huden är människans största organ och består av tre olika lager, epidermis (överhud), dermis (läderhud) och subcutis (underhud/fettväven) (1). Det översta hudlagret, epidermis består i huvudsak av keratinocyter och melanocyter. Keratinocyterna är de dominerande cellerna. Epidermis består av olika skikt: stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum och stratum corneum. Stratum basale befinner sig intill basalmembranet och här sker en kontinuerlig nybildning av keratinocyter. Keratinocyterna vandrar sedan upp mot hudens yta via stratum spinosum och stratum granulosum. Under vandringen mot hudens yta plattas cellerna till och en produktion av det kväverika proteinet keratin sker. Stratum corneum bildar hornskiktet och består av de tillplattade keratinocyterna. Dessa fungerar som en barriär och skyddar oss mot yttre påverkan. Keratinocyternas levnadsförlopp vara i drygt en månad innan de sedan dör och flagnar bort från hudytan. I den basala delen av epidermis finns melanocyter. Melanocyternas uppgift är att producera pigmentet melanin genom en melaninproducerande organell, melanosomen. Melanin har som uppgift att skydda oss mot ultraviolett strålning och ju mörkare hy desto mer melaninpigment har man. När kroppen belyses av solen får huden en mörkare färg på grund av att mer pigment bildats för att skydda kroppen. Då mängden melanin inte räcker till kan överdrivet solande leda till solskador så som hudcancer (2). Dermis (som även kallas läderhud) förankras med epidermis via basalmembranet. Dermis innehåller talgkörtlar, hårsäckar, blodkärl, svettkörtlar och nerver. Dermis innehåller även mycket elastin och kollagen, vilket ger huden en styrka och elasticitet. Vid åldrande minskar dessa elastiska fibrer och huden blir mer slapp. Exponering för mycket ultraviolett strålning under åren leder också till att de elastiska fibrerna förstörs och huden blir slappare. Dermis varierar något i tjocklek beroende på vilken kroppsdel det är. Handflator, fotsulor och rygg är kroppsdelar som har ett tjockare lager av dermis. Under dermis finns subcutis, som till största delen består av bindväv och fettceller. Subcutis är 2-10 mm tjock och fungerar som skydd mot inneliggande benhinnor och muskulatur (se figur 1) (2). Figur 1. Figuren visar hudens uppbyggnad där epidermis, dermis och subcutis ingår. Bilden kommer från hudmottagningen, Falun Lasarett, som givit sitt tillstånd att använda och publicera bilden (3). 1

6 Huden har flera olika funktioner. En av de viktigaste är att fungera som yttre barriär mot skadliga organismer, såsom virus och bakterier. Andra funktioner är att förhindra vätskeförlust, utsöndra vatten och salt via svettning, skydda kroppen mot ultraviolett strålning, bilda D- vitamin, fungera som sinnesorgan (tryck, känsla, värme och smärta) och att hålla kroppstemperaturen jämn. Kroppstemperaturen kan bibehållas tack vare blodkärlen i dermis. Vid låga kroppstemperaturer kommer blodkärlen i dermis att kontraheras vilket medför minskad blodgenomströmning genom huden. Mindre blodgenomströmning gör att mindre värme lämnar kroppen. Detta kan uppmärksammas på människor genom att de blir blekare. Vid högre kroppstemperaturer ses en motsatt effekt. Man blir rödare, då blodgenomströmningen genom de utvidgade kärlen i huden ökar (2). Melanocytära förändringar kan vara godartade (benigna) eller elakartade (maligna). De maligna tumörerna kan antingen uppstå de novo (uppstår utan tidigare melanocytär tumör) eller från tidigare existerande benignt nevus. Benigna melanocytära tumörer (nevus) uppstår i tidig ålder och mognar ut i vuxen ålder. Normal ses enstaka melanocyter i den basala delen av epidermis, men vid utveckling av pigmentnevus prolifierar melanocyterna. Epidermalt-, sammansatt- och intradermalt nevus är de tre olika typerna av utvecklingsstadier vid pigmentnevus. Epidermalt nevus består av melanocyter i grupper i reter tapparna (se figur 2 cirkel B, ser ut som istappar ner i dermis). När dessa melanocyter vandrar ner i dermis bildas ett så kallat sammansatt nevus. Vid ett intradermalt nevus har alla melanocyterna vandrat från epidermis till dermis (se figur 2). Mot djupet i dermis sker sedan en utmognad av melanocyterna, som morfologiskt kan ses genom att cellerna blivit mindre (4). Figur 2. Figuren visar Hematoxylin- och eosininfärgning (HE). A visar ett intradermalt nevus där melanocyterna ses djupare ner i dermis (syns som mörkblå kärnor). B visar en normal hudyta med så kallade reter tappar. I detta fall förekommer melanocyterna vid basalmembranet. Bilden kommer från Patologilaboratoriet, Länssjukhuset Kalmar (24x). En hudförändring kan kliniskt bedömas med hjälp av dermatoskopi. Dermatoskopi utförs med hjälp av ett dermatoskop. En droppe immersionsolja (benzylbenzoat) placeras på nevuset och därefter pressas dermatoskopet hårt mot förändringen. Immersionsolja används för att förbättra upplösningen. Vid undersökning av lesionen följs ABCD- regeln. ABCD står för asymmetry, border, color och diameter. Asymmetri innebär att lesionens båda halvor har olika form. Border betyder kant och som namnet säger undersöker man lesionens kant och avgör om det förekommer ojämnheter eller inte (4). 2

7 Spitz nevus Spitz nevus beskrevs först av Sophie Spitz 1948 som juvenile melanoma och är en typ av benign melanocytär tumör som består av spolformiga eller epiteloida celler (4). Spitz nevus är en förändring som i de flesta fall inte leder till någon konsekvens, dock kan utveckling till malignt melanom ske (5). Det visar sig ofta kliniskt som en snabbt växande tumör och är vanligast hos barn. Innan Spitz beskrev tumören karaktiserades den som malignt melanom. Spitz nevus kan förekomma var som helst på kroppen, men vanligast är i ansiktet och på benen. Trots att enstaka fall av spitz nevus uppmärksammats hos den mörkhyade befolkningen är trots allt åkomman vanligast hos den vita befolkningen (4). Spitz nevus är en röd till icke- pigmenterad, palpabel förändring. Histologiskt ses symmetriska förändringar som engagerar papillära och retikulära dermis samt reaktiv hyperplasi i epidermis. Reaktiv hyperplasi ses genom att reter tapparna blir utdragna och ojämna (se figur 3 A). Celltypen är spolformig eller epiteloid och det finns mognad av cellerna mot djupet (se figur 3 B). Tumören är oftast mindre än 6 mm i diameter (4, 6-10). Figur 3. Figuren visar spitz nevus i 40x (A) och 100x (B) förstoring med HE infärgning. Bilden kommer från Patologi Laboratoriet, Länssjukhuset Kalmar. A visar en hyperplasi av retertapparna (se pil). Figur B visar melanocyterna med mörkblå kärnor, där epiteloida och spolformiga melanocyter är vanligt. 3

8 Diagnosen spitz nevus ställs genom kliniska fynd, dock måste dessa kliniska fynd säkerställas genom histologiska undersökningar. För att kunna utföra de histologiska undersökningarna måste en hudexcision av förändringen utföras. Vid en hudexcision tas hela eller delar av förändringen bort (4). Malignt melanom/ Spitzoida melanom Malignt melanom är en malign hudtumör som utgörs av melanocyter, varav de vanligaste typerna är malignt melanom av ytlig spridningstyp och nodulärt melanom. Malignt melanom är lika vanligt hos båda könen och majoriteten med malingt melanom upptäcks hos den vuxna befolkningen. Under det senaste decenniet har en ökning av malignt melanom skett i förhållande till andra cancertyper. Detta beror till största delen på den stora solexponeringen vi utsätts för. I Sverige drabbas 1/ 70 personer av malignt melanom och personer som är ljushyade, fräkniga och solskadade tillhör riskgruppen (11, 12). Spitzoida melanom är en malign hudtumör som kan utvecklas från tidigare existerande spitz nevus eller uppstå de novo % av melanomen utvecklas från tidigare existerande nevus (13). Spitzoida melanom förekommer främst hos vuxna men det har inträffat flera fall där barn har utvecklat spitzoida melanom (13). Makroskopiskt ses förändringen som en knölig upphöjning där storleken är mer än 1 cm i diameter. Förändringen är asymmetrisk och pigmentfattig, men det förekommer fall där spitzoida melanom är pigmenterade, såriga och skorpiga (13,14). Prognosen för vuxna med spitzoida melanom är densamma som för andra melanom. Prognosen beror på Breslow thickness (se tabell I) och patientens ålder. Yngre patienter med spitzoida melanom har en bättre överlevnadsprognos än vuxna med samma tumörtjocklek. Mellan åren 1949 och 2006 hittades 82 fall med spitzoida melanom hos barn under 17 år med utvecklad metastas. 5- års överlevnad för barn mellan 0 och 10 år var 88 % jämfört med 49 % för barn mellan 11 och 17 år (13). Tabell I. Tabellen visar Breslows Thickness (15). Där man kan se samband mellan tumörtjockleken och överlevnaden. Breslow Thickness Ungefärlig 5- års överlevnad <1 mm % 1-2 mm % 2,1-4 mm % >4 mm 50 % Behandling av spitzoida melanom och andra maligna melanom baseras på Breslows thickness och Clark s level. Clark s level är en metod som indikerar hur djupt tumören spridit sig. Nivå I som kallas melanom in- situ innebär att tumören endast spridit sig till epidermis. I nivå II ser man en spriding av tumören ner till dermis. Nivå III- IV innebär att tumören spridit sig djupare in i dermis men fortfarande är kvar i hudlagret. I den sista nivån, nivå V, har tumören spridit sig till fettet i subcutis. Enligt en riktlinje för melanom in- situ ska en excisionsmarginal på 0.5 cm skapas. För invasiva melanom som är mindre än 1 mm i tjocklek ska en marginal på 1 cm utföras. På en tumörtjocklek mellan 1-2 mm ska en marginal på 1-2 cm utföras och för en tumörtjocklek mellan 2-4 mm ska en marginal på 2 cm utföras (15). 4

9 Att skilja spitz nevus från maligna melanom kan vara mycket svårt. Speciellt svårt är det att skilja spitz nevus från spitzoida melanom, då dessa delar många histopatologiska drag. Kännetecken för melanom är att de saknar symmetri och utmognad mot djupet i dermis samt kärnpolymorfism (kärnorna har olika form och storlek). Cellerna har ofta hyperkromatiska kärnor och det förekommer kärnor med flera nukleoler. Nukleolernas storlek kan vara upp till halva diametern av kärnas storlek. Den maligna typen är även mitosrikare (se figur 4) (13). Figur 4. Figuren visar ett misstänkt spitzoid melanom i 40 x förstoring med HE infärgning. I figuren ses en morfologisk bild så som i spitz nevus. Melanocyterna, som ses med mörkblåa kärnor finns på djupet i dermis med en mer omogen form. Bilden kommer från Patologilaboratoriet, Länssjukhuset Kalmar. Immunohistokemi Immunohistokemi omfattar olika metoder där man med hjälp av antikroppar kan detektera olika antigen i en vävnad. Metoderna används främst vid diagnostik av olika typer av tumörer. Metoderna innebär att en reaktion mellan ett antigen och en antikropp visualiseras med hjälp av olika visualiseringssystem, där enzym och fluorescens är vanligast (16, 17). Albert H. Coons och hans kollegor var först med att märka antikroppar med fluorescerande molekyler. Dessa kunde senare användas för identifiering av antigen i olika vävnader. Immunohistokemins utveckling fortsatte vidare och 1966 använde sig Nakane och Pierce av enzymet peroxidas för att märka antikropparna. Några år senare, 1978, kom Mason och Sammons på att man kunde märka antikroppar med enzymet alkalisk fosfatas (18). 5

10 Antigen och antikroppar Immunoglobuliner är glykoproteiner som bildas av B- celler vid immunisering. Det finns fem olika klasser av immunoglobuliner IgA, IgG, IgD, IgE och IgM, där IgG är den mest använda antikroppen vid immunohistokemiska tekniker. Immunoglobulinerna är uppbyggda av två tunga och två lätta kedjor. Dessa kedjor hålls samman med disulfidbryggor. Antikropparnas olika klasser skiljs åt i de tunga kedjorna, exempelvis har IgG gamma som tung kedja. Däremot är de lätta kedjorna lika för de olika klasserna och är antingen av lambda- eller kappa- typ. Antikroppen har två bindnade site som utgör den variabla delen (F ab ). I den variabla delen finns en specifik aminosyrasekvens vars struktur är komplementär till determinanten på antigenet. Hur hårt en antikropp binder till antigenet beror på antikroppens affinitet för antigenet. Antigener är oftast proteiner och deras egenskaper ligger i flera mindre områden som kallas determinanter eller epitoper. Bindningen som sker mellan antikropp och epitop beror på en blandning av flera olika bindningstyper såsom Van der Waals krafter, hydrofoba interaktioner, jonbindningar och vätebindningar (19). För att kunna utföra immunohistokemiska färgningar måste olika typer av anti-humana antikroppar framställas. Det finns två olika typer av antikroppar, poly- och monoklonala. Polyklonala antikropparna finns i serum hos ett däggdjur och är en hetrogen mix av antikroppar mot många olika epitoper. Polyklonala antikroppar kan framställas genom att antigenet injiceras i ett däggdjur. Sedan isoleras antikropparna från däggdjurets serum (19). Monoklonala antikroppar är en homogen mix av antikroppar. I en homogen mix av antikroppar är alla antikroppar likadana och riktade mot endast en epitop. Monoklonala antikroppar produceras genom cellodling. När antigenet injiceras i däggdjuret (oftast mus eller kanin) kommer detta djur att börja producera antikroppar mot den sökta epitopen. Under två månader injiceras antigenet med två veckors intervall och därefter avlivas djuret och B- celler isoleras från mjälten. Genom att använda genfragment från den hypervariabla delen av en musantikropp och sätta in i genen för en människoantikropp så erhålls en antikropp där det antigenbindande sitet binder till tumörcellen. Denna antikropp blir identisk med patientens egna tumörantikroppar. Genom att föra in genen i cancercellernas genom bildas en hybridomcell, som via cellodling ger stora mängder antikroppar av samma klon (19). Antikroppstiter och inkubationstid Optimal antikroppstiter innebär den koncentration av antikroppen som behövs för att uppnå en specifik färgning och en minimal bakgrundsfärgning. Bakgrungsfärgning uppstår vid ospecifik bindning av antikroppen. Den absoluta mängden närvarande antikropp bestämmer lösningens koncentration. Antikroppstiter, temperatur och inkubationstid är faktorer som tillsammans kombineras för att ge opimal färgning. Det finns ett samband mellan antikroppstiter och inkubationstid, ju högre antikroppstiter desto kortare inkubationstid behövs för ett optimalt resultat. Inkubationstiden varierar från 10 minuter till 24 timmar. Vanligast idag är mellan minuter (19). Fixering och antigen retrival För att en immunohistokemisk färgning ska kunna utföras och bedömas på rätt sätt så måste vävnaden och cellerna bevara sin struktur. Färska preparat måste omedelbart fixeras för att autolys ska undvikas. Autolys är en process som startar så fort vävnaden lämnat kroppen. Den mest använda fixeringsmetoden för detta ändamål är 4 % formaldehyd. Formaldehyd ger 6

11 upphov till fixeringen genom att reagera med basiska aminosyror i vävnaden. Denna reaktion leder till att det bildas korsbindingar bestående av metylenbryggor. Metylenbryggor har länge varit ett stort problem inom immunohistokemi, då många antigen maskeras och blir inaktiva. Numera finns det tekniker för att återaktivera antigen (19). Demaskering av antigen kan idag utföras med hjälp av antigen retrival reagens som bryter korsbindingen hos proteinet. De vanligast använda metoderna för demaskering av antigen är HIER (heat induced epitope retrival) och PIER (proteolytic induced epitope retrival). PIER är en metod där man med hjälp av enzymer spjälkar bort blockerande molekyler. De enzym som används mest är trypsin, pepsin, proteinas K och pronas. Enzymen har som uppgift att katalysera spjälkningen av peptidbindningen mellan vissa aminosyror som ligger i närheten av de bildade metylenbryggorna. På så sätt kan antigenets epitoper bli tillgängliga (20). HIER är en förbehandling som används i samband med immunohistokemi. Syftet är att förbättra antikroppsbindningen så att en optimal infärgning uppnås. HIER innebär att man använder upphettning och energi för att bryta metylenbryggorna och på så sätt demaskera antigen. Under HIER s utveckling var upphettning med vattenbad, mikrovågsugn och autoklav det vanligaste, men detta sågs länge med skepsis då proteiner har en tendens att denaturera vid höga temperaturer. I mitten på talet såg många forskare möjligheten att utveckla metoden genom att använda buffert med tillsatts av citrat eller EDTA (etylendiamintetraättiksyra). Citratbuffert ph 6.1 och TRIS/ EDTA ph 9.0 är de mest använda antigen retrival reagens. Kalciumjoner som finns i vävnaden bidrar till att göra metylenbryggorna starkare. Vid upphettning med buffert kommer metylenbryggorna att brytas, vilket medför att kalciumjoner frigörs. Frigjorda kalciumjoner binds upp av citrat och EDTA som förhindrar att metylenbryggorna återskapas (20). Kombinationen mellan tid och temperatur är en viktig faktor vid användning av HIER. Den optimala tiden är mellan minuter (20). Immunohistokemisk färgning En av de vanligaste immunohistokemiska färgningsteknikerna använder sig bl.a. av enzymsubstratreaktionen som gör att de färglösa kromogenerna får färg. Valet av enzym är viktigt då enzymet måste vara stabilt och endogent enzym måste blockeras. De två vanligaste enzymerna som används idag är HRP (horseradish peroxidase) från pepparrot och AP (alkalisk fosfatas) från kalvtarm. Indirekt teknik består av flera olika metoder men gemensamt för dessa är att reaktionen består av både primära och sekundära antikroppar. I en av metoderna består detektionsreagenset av en dextranryggrad med kovalent bundna peroxidasmolekyler (HRP) och sekundära get- anti mus och get- anti- kanin- antikroppar. Den primära antikroppen kommer specifikt att binda till sitt antigen och sedan själv utgöra antigenet för den sekundära antikroppen (se figur 5). I slutsteget tillsätts kromogenen DAB (3,3 diaminobenzidintetrahydroklorid) och väteperoxid, som kommer att utgöra substratet för HRP. HRP kommer att katalysera väteperoxid och bilda slutprodukten väte och atomärt syre. I reaktionen fungerar DAB som en elektrondonator som efter oxidationen bildar en brun slutprodukt vid platsen för målantigenet (19). Hematoxylin som ger blå kärnor är en motfärgning till den immunohistokemiska färgningen. Hematoxylin kommer från kärnan hos kampeschträdet, som är en art från Centralamerika (19). 7

12 Figur 5. Figuren visar en modifierad bild från George L Kumar, Lars Rudbeck. Education Guide Immunohistochemical Staining Methods Fift Edition Dako North America s.59. Figuren visar en av de många indirekta metoderna, där både primär och sekundär antikropp används. Den sekundära antikroppen är bunden till en dextrankedja tillsammans med HRP. HRP utgör enzymet som katalyserar väteperoxid. HMB- 45 HMB- 45 (Human Melanosoma Black 45) är ett intracellulärt antigen som uttrycks i majoriteten av melanom och andra tumörer som har en melanocytär differentiering (24). Anti- humant HMB- 45 är en monoklonal antikropp som med hjälp av immunohistokemiska metoder kan användas för att kvalitativt identifiera omogna melanocyter. Detta är ett användbart hjälpmedel för att se utmognadsprocessen i melanocytära tumörer. Anti- humant HMB- 45 binder till ett 10 kd- segment av ett neuraminidassensitivt sialyerat glykokonjugat, som är epitopen för denna antikropp (21). Anti- humant HMB- 45 är även en användbar antikropp vid diagnostik av amelanocytära melanom. Vilket gör att de i många fall feldiagnostiseras som carcinom eller sarkom. Amelanocytära melanom har en avsaknad av pigment (13, 21). Ki-67 Anti- humant Ki- 67 används för att påvisa Ki- 67- antigen i normala eller neoplastiska celler. Ki- 67- antigen är ett kärnprotein där två isoformer på 320 och 359 kda har identifierats. Genom att en använda monoklonal Ki-67- antikropp kunde Ki- 67- proteinet identifierades och beskrivas 1983 av Gerades et al (22). Vid normal proliferation är celldelningen reglerad och består av fem olika faser. Celldelningens olika faser är G 0, G 1, S, G 2 och M. G 0 - fasen kallas vilofasen och består av celler som är i vila och väntar på cellcykeln. Cellerna kan antingen hamna i G 0 - fasen tillfälligt eller befinna sig där permanent. I första fasen, (G 1 - fasen) förbereds cellen inför celldelning genom att öka i storlek. När en viss storlek uppnås går cellen in i nästa fas (Sfasen). Här sker en DNA- syntes och arvsmassan fördubblas. Det är i S- fasen det bildas en kopia av varje kromosom. Innan cellen går vidare till mitos (M- fas) måste cellen passera G 2 - fasen. G 2 - fasen består av kontrollmekanismer som kontrollerar att DNA- syntesen har utförts 8

13 på ett korrekt sätt. I M-fasen separeras kromosomerna och cellen delas till två identiska dotterceller. Ki- 67 är ett protein som uttrycks i olika faser av cellcykeln. Celler som genomgår cellcykeln uttrycker Ki- 67 under sena G 1 -, S-, G 2 -, och M- faserna, medan celler i vilofasen (G 0 - fasen) inte uttrycker Ki- 67. När cellen avslutar cellcykeln bryts Ki- 67- antigenet snabbt ner (8, 23, 24). Cellcykelns normala kontrollmekanismer kan sättas ur spel, vilket i sin tur kan leda till ökad proliferation och uppkomst av cancer. Inom cancerdiagnostik är man intresserad av att kunna bedöma cancerns proliferationshastighet. Med hjälp av immunohistokemi kan Ki- 67- antigenet identifieras. Ki- 67- antigenet förekommer i alla celler som genomgår cellcykeln, men vid olika cancertyper kan man se en ökad proliferation. Inflammation är en annan process som leder till ökad cellproliferation och ett högre uttryck av Ki- 67 ses (22). CD99 CD99 eller MIC2- genprodukt är ett transmembrant glykoprotein på 32 kda. MIC2- genen är en gen som är lokaliserad till de korta armarna (p-armen) på både X- och Y- kromosomerna (25). CD99 beskrevs först i T- celler vid en akut lymfoblastisk leukemi. Lymfoblaster är förstadier till mogna lymfocyter. CD99 har även detekterats vid nästan alla Ewing s sarkom en primär malign bentumör som troligen har sitt ursprung i benmärgen. CD99 har även rapporterats i andra neoplastiska tumörer, såsom bröstcancer, ovariecancer och solitära fibrösa tumörer. Normalt finns CD99 i leydigceller (producerar testosteron och befinner sig i testiklarna), aktiverade lymfocyter, fibroblaster, endotel- och urotelceller (epitelceller i urinvägarna) och epiteloida celler (26). Hypotes Förväntade resultat med Anti- humant HMB- 45 är att det ska kunna ses en skillnad mellan Spitz nevus och spitzoida melanom/ maligna melanom. Det ska ses skillnad i infägrningen genom att infärgningen av HMB- 45 ska avta mot djupet i dermis i den benigna typen. Infärgningen med Anit- humant Ki- 67 förväntas visa större proliferation i de maligna typerna och minskad proliferation i Spitz nevus. Efter granskning av tidigare studier förväntas CD99 uttryckas i spitzoida melanom men saknas i uttryck hos spitz nevus. Syfte Syftet med studien var att undersöka om det går att använda de immunohistokemiska markörerna Anti- humant HMB-45, Anti- humant CD99 och Anti- humant Ki- 67, för att bestämma om en tumör kan betraktas som benign eller malign vid differentialdiagnostik mellan spitz nevus och malignt melanom/ spitzoida melanom. 9

14 Material och metod Provmaterial Till utförandet användes vävnadsmaterial från tidigare diagnostiserade spitz nevus, spitzoida melanom och maligna melanom. Vävnadsmaterialet bestod av arkiverade klossar med formalinfixerad, paraffininbäddad vävnad. Provet som användes var arkiverad paraffininbäddad vävnad som tidigare processats på laboratoriet av personalen. Vävnaden fixerades under ett dygn i formalin innan det sedan skars och dehydrerades (vatten tas bort ur vävnaden). Vävnaden bäddades därefter ner i smält paraffin som sedan fick stelna via kylning. Efter bedömning av snitten placerades klossarna i ett rumstempererat arkiv. I studien ingick 21 personer (12 kvinnor och 9 män) i åldern 5-82 år (median 31). 13 av 21 personer var diagnostiserade som spitz nevus, 5 av 21 personer var diagnostiserade som spitzoid melanom och 3 av 21 hade fått diagnosen malignt melanom (se bilaga 1). Etik För att få fram provmaterialet söktes patienter i databasen (Sympathy) på avdelningen klinisk patologi, Länssjukhuset Kalmar. Sökningen sträckte sig från till Provmaterial är sparade enligt biobankslagen, vilket innebär att alla patienter som lämnat prover har gett sitt medgivade att de kan sparas. Eftersom proverna användes i utbildningssyfte och var avkodade behövdes inget tillstånd. Snittning Objektsglasen (Superfrost Plus, Thermo Scientific) märktes med fallnummer På objektsglaset droppades några droppar vatten och därefter snittades 4 µm tjocka snitt av den paraffininbäddade vävnaden. Till varje fall snittades 3 snitt som placerades på var sitt objektsglas (totalt 63 glas). På objektsglasen placerades även ett kontrollsnitt. Glasen värmdes därefter vid 46ºC på en värmeplatta för att snitten skulle sträcka sig. Därefter avlägsnades överflödigt vatten och snitten inkuberades över natt vid 60ºC, i ett värmeskåp. Snitten avparaffinerades, där paraffin avlägsnades genom att maskinen placerade glasen i 100 % xylen. Därefter gjordes en rehydrering genom att gå från stigande koncentration alkohol till vatten (99 % alkohol, 95 % alkohol, 70 % alkohol och vatten) för att återfå vatten i cellerna. Dessa två steg utförde i färgmaskinen (Shandon varistain Gemin, England). Kontrollmaterial I utförandet användes positiva interna multiklossar (klossar innehållandes flera olika vävnadsbitar) som kontroll. Till Anti- humant HMB-45 (Dako, Danmark) användes en multikloss innehållandes vävnadsbitar från maligna melanom och pigmentnevus. Till Antihumant CD99 (Dako) och Anti- humant Ki- 67 antigen (Dako) användes multikloss innehållandes vävnadsbitar från pancreas, tonsill, lever och appendix som kontrollmaterial. 10

15 Antigen retrival Immunoetiketter skrevs ut och klistrades på glasen (ettiketer med streckkod som är specifik för varje antikropp och fall). Glasen placerades i rack och scannades i datorprogrammet för PT Linken (Dako). Glas som skulle färgas med Anti- humant HMB-45 (Dako) och Antihumant Ki-67 (Dako) förbehandlades i EnVision TM FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (Dako; innehållandes citratbuffert, ph 6.1). Glas där Anti- humant CD99 (Dako) skulle användas förbehandlades i Envision TM FLEX Target Retrival Solution High ph (50x) (Dako; Tris/EDTA- buffert ph 9.0). Förbehandlingen kördes i 30 minuter i 98ºC (± 1º), där starttemperaturen var 65ºC. Färdiga glas överfördes från PT Linken till rumstempurerad EnVision TM FLEX Wash Buffer (20x) (bestående av Tris- buffrad saltlösning innehållande Tween 20, ph 7.6 (± 0.1) (Dako)). Glasen stod där mellan 1-5 minuter. Optimering av Anti- human CD99 Anti- humant CD99 var en ny antikropp som optimerades. Producenten rekommenderar att Anti- humant CD99 används med en spädningsfaktor på 1:50 till 1:75. En spädningsserie gjordes enligt följande: 1:40, 1:50, 1:60, 1:75 och 1:100. Antikroppen späddes med EnVision TM FLEX Antibody Diluent (Dako; Tris- buffrad, ph 7.2, innehållande 15 mmol/l NaN 3 samt protein). På spädningen 1:40 och 1:50 utfördes även försöket med EnVision TM FLEX+ Mouse (LINKER) (Dako). Immunohistokemisk färgning Glasen placerades i Autostainer Plus Link (Dako). Därefter späddes antikropparna HMB- 45, Ki-67 och CD99 med EnVision TM FLEX Antibody Diluent (se tabell II). Sedan placerades reagens och antikroppar i instrumentet enligt följande schema: EnVision FLEX Peroxidas blockning reagent (Dako), Anti- human Ki- 67, Anti- human HMB- 45, Anti- human CD99, EnVision TM FLEX+ Mouse (LINKER), EnVision TM FLEX HRP (Dako), Substrate Working solution (Dako) och EnVision TM FLEX Hematoxylin (Dako) (se bilaga 2). Under tiden fylldes reservoarer med EnVision TM FLEX Wash Buffer (20x) och destillerat vatten. Sedan körde Autostainer Plus Link i 3 timmar (se bilaga 2). Tabell II. I tabellen ses vilka antikroppar som användes, vilken klon de kom ifrån och spädningsfaktorn. Antikropp Klon Spädningsfaktorn Anti- Human Ki- 67 MIB-1 Mus IgG 1 Kappa 1:250 Anti- Human melanosom HMB-45 1 Mus IgG 1 Kappa 1:60 Anti- Human CD99 12E7 1 Mus IgG 1 Kappa 1:40 Dehydrering och montering Färdiga glas dehydrerades (tar bort vatten från vävnaden genom att placera glasen i vatten och därefter stigande koncentration alkohol 70%, 95 % och 99%) i färgmaskinen (Shandon varistain Gemin) och monterades i monteringsmaskinen (Leica CV5030, Tyskland). Glasen torkades under 1 timme vid 60º C i ett värmeskåp. 11

16 Utvärdering Den immunohistokemiska färgningen studerades mikroskopiskt och en histologisk bedömning utfördes. Infärgningen bedömdes vara positiv eller negativ, stark eller svag och fokal eller diffus. Bedömningen utfördes av mig tillsammans med läkaren Suzanne Johansson. 12

17 Resultat Optimering av Anti- humant CD99 gav ett optimalt resultat med spädning 1:40 och 1:50 med EnVision TM FLEX+ Mouse (LINKER). Histologiskt såg man blå kärnor med brunt infärgat plasmamembran i tonsillmaterialets lymfocyter. I spädningen 1:40 och 1:50 utan LINKER blev resultatet svagt positivt (se figur 6). Figur 6. Figuren visar tonsillmaterial infärgat med Anti- humant CD99 i 200x förstoring. Till vänster ses en spädning 1:40 med LINKER. Till höger ses samma spädning utan LINKER. Man ser tydligt blå cellkärnor och brunfärgat plasmamembran. Patologilaboratoriet, Länssjukhuset i Kalmar (B. Stojakovic, S. Johansson).. Kontrollmaterialet till Anti- humant HMB- 45 blev infärgat, där cytoplasman i omogna melanocyter blev brunfärgad. Kärnorna var blåfärgade av hematoxylinet och cytoplasman i andra celler var färglös. I majoriteten av proverna sågs en stark, positiv infärgning av melanocyternas cytoplasma i den ytliga delen av dermis (se figur 7). I 3 av 5 spitzoida melanom avtar intensiteten mot djupet i dermis. Likartade resultat ses i 5 av 13 spitz nevus. Här blev infärgningen av HMB- 45 svagare mot den djupa delen av dermis. Resten av diagnostiserade spitz nevus (8 av 13 fall) hade generell, diffus infärgning eller enstaka grupper infärgade mot djupet i dermis. I 2 av 5 spitzoida melanom sågs en liknande bild. Alla maligna melanom visade stark, tydlig positivitet i den djupa delen av dermis (se tabell III). 13

18 Figur 7. Figuren visar infärgning med Anti- humant HMB- 45 i 200x förstoring. I figuren ses tydligt en cytoplasma infärgning. Detta innebär att det är omogna melanocyter. Patologilaboratoriet, Länssjukhuset i Kalmar (B. Stojakovic, S. Johansson). Tabell III. Tabellen visar resultatet med HMB- 45- infärgningen för de olika patienter som ingick i studien. Patiener Anti- humant HMB- 45 Kommentar Diagnos 1 stark, positiv ytligt avtar i styrka mot djupet SMT* 2 stark, positiv ytligt avtar i styrka mot djupet SMT 3 stark, positiv ytligt enstaka grupper positiva i djupa delen av dermis SMT 4 stark, positiv ytligt avtar i styrka mot djupet SN** 5 stark, positiv ytligt avtar i styrka mot djupet SN 6 stark, positiv ytligt avtar så gott som helt mot djupet SMT 7 diffus, stark positiv SN 8 stark, positiv ytligt enstaka grupper positiva i djupa delen av dermis SN 9 stark, positiv ytligt avtar i styrka mot djupet SN 10 stark, positiv ytligt trasigt snitt i djupa delen av dermis SN 11 stark, positiv ytligt enstaka grupper positiva i djupa delen av dermis SN 12 diffus, stark positiv SN 13 stark, positiv ytligt avtar i styrka mot djupet SN 14 stark, positiv ytligt avtar i styrka mot djupet SN 15 diffus, stark positiv SN 16 diffus, stark positiv SN 17 diffus, stark positiv SMT 18 diffus, stark positiv SN 19 diffus, stark positiv MM*** 20 diffus, stark positiv MM 21 stark, positiv ytligt avtar i styrka mot djupet MM *(SMT)= spitzoid melanocytär tumör, ** (SN)= spiz nevus, ***(MM)= malignt melanom 14

19 Anti- humant Ki- 67 infärgade cellkärnorna i kontrollmaterialets lymfocyter, vilket indikerade att reagensen fungerade. Proverna var svårtolkade, eftersom det var svårt att skilja positiva lymfocyter från positiva melanocyter (se figur 8). I en del fall var det även svårt att skilja positiva stromaceller och keratinocyter från positiva melanocyter. I 12 av 13 spitz nevus sågs en tydlig skillnad i ytlig och djup komponent, där majoriteten av proliferande melanocyter sågs i den ytliga komponenten. I spitzoida melanom sågs ingen tydlig ökning av infärgade melanocyter i den djupa komponenten (djupa delen av dermis). Vid malignt melanom som hade ett högt antal lymfocyter var det svårt att räkna antalet prolifierade melanocyter (se tabell IV). Figur 8. Figuren visar infärgning med Anti- humant Ki- 67 i 200x förstoring. Man ser tydligt en infärgning av lymfocyter och melanocyter (bruna cellkärnor). Dessa är dock svåra att skilja. Patologilaboratoriet, Länssjukhuset i Kalmar (B. Stojakovic, S. Johansson). 15

20 Tabell IV. Tabellen visar resultatet med Ki- 67 infärgning för de olika fall som ingick i studien. Patienter Anti- humant Ki- 67 Kommentar Diagnos 1 avtar mot djupet Ki- 67 infärgningen avtar i den djupa komponenten SMT* 2 ingen tydlig ökning ingen ökad proliferation av melanocyter i djupa komponenten SMT 3 ingen tydlig ökning SMT 4 avtar mot djupet SN** 5 avtar mot djupet SN 6 ingen tydlig ökning SMT 7 ingen tydlig ökning SN 8 avtar mot djupet SN 9 avtar mot djupet SN 10 avtar mot djupet SN 11 avtar mot djupet SN 12 avtar mot djupet SN 13 avtar mot djupet SN 14 avtar mot djupet SN 15 avtar mot djupet SN 16 avtar mot djupet SN 17 ingen tydlig ökning SMT 18 avtar mot djupet SN 19 avtar mot djupet MM*** 20 ingen tydlig ökning MM 21 avtar mot djupet MM *(SMT)= spitzoid melanocytär tumör, ** (SN)= spiz nevus, ***(MM)= malignt melanom Vid infärgning med Anti- humant CD99 blev kontrollmaterialet positivt infärgat i enlighet med visningar från Dako. Lymfocyterna i tonsillen fick ett starkt brunfärgat plasmamembran. I materialet från pancreas blev endast cytoplasman i de langerhandska öarna infärgade. Positiv kontroll visar att reagenset fungerade samt att bakgrundsfärgningen kunde uteslutas. I 2 av 13 fall med spitz nevus såg man en negativ bild, där melanocyternas plasmamembran ej brunfärgades. I ett av 13 spitz nevus sågs en stark positivitet i melanocyternas plasmamembran i ytliga delen av dermis (se figur 9). I majoriteten av proverna blev infärgningen diffus (mer än 75 % av melanocyterna fick en brun plasmainfärgning). I ett av spitz nevus blev snittet obedömbart. I tidigare diagnostiserade spitzoida melanom blev 3 av 5 fall positiva för CD99. I dessa fall såg man en svag eller stark infärgning. De två andra fallen med spitzoida melanom fick en negativ infärgning, där ingen plasmamembraninfärgning har skett. I malignt melanom sågs ett fall med negativ invasiv negativ komponent (djupa delen av dermis), i de andra två fallen blev färgningen av plasmamembranet svag till starkt diffust (se tabell V). 16

21 Figur 9. Figuren visar infärgning med Anti- humant CD99 i 200x förstoring. I figuren ses en tydlig positiv plasmamembraninfärgning. Här ser man även att melanocyterna är spolformiga och epiteloida. Patologilaboratoriet, Länssjukhuset i Kalmar (B. Stojakovic, S. Johansson). Tabell V. Tabellen visar resultatet med CD99- infärgningen för de fall som ingick i studien. Patienter Anti- humant CD99 Kommentar Diagnos 1 negativ ingen plasmamembraninfärgning SMT* 2 diffus, stark positiv mer än 75 % av melanocyternas plasmamembran är positiva SMT 3 diffus, svag positiv SMT 4 diffus, stark positiv SN** 5 diffus, svag positiv SN 6 negativ SMT 7 diffus, stark positiv SN 8 diffus, stark positiv SN 9 diffus, stark positiv SN 10 svårbedömt trasigt snitt, vilket ger en svår bedömining av CD99- infärgning SN 11 diffus, stark positiv SN 12 negativ SN 13 stark, positiv ytligt infärgningen avtar i djupa delen av dermis SN 14 diffus, stark positiv SN 15 diffus, stark positiv SN 16 negativ SN 17 diffus, svag positiv SMT 18 diffus, stark positiv SN 19 stark, positiv ytligt negativ invasiv komponent MM** 20 diffus, stark positiv MM 21 diffus, lätt- stark positiv i både ytlig och djup komponent sågs svaga och starka infärgningar MM *(SMT)= spitzoid melanocytär tumör, ** (SN)= spiz nevus, ***(MM)= malignt melanom 17

22 Diskussion Patienterna som ingick var ett slumpmässigt urval mellan Bland dessa fanns dock inte så många spitzoida melanom, då diagnosen är svårbedömd och ovanlig. Det sågs ingen tydlig skillnad mellan män och kvinnor, men det kan säkerställas att majoriteten av patienter med spitzoida melanom eller malignt melanom var över 40 år (se bilaga 1). Detta stämmer överens med teorin att malignt melanom och spitzoida melanom är ovanliga hos barn (13). Spitz nevus drabbar unga i barn- och ungdomsåren (7). I studien fanns ett flertal unga som fått diagnosen spitz nevus. Några var i 30 års ålder och enstaka fall hittades där patienterna var över 40 år (se bilaga 1). Vid immunohistokemisk färgning är det viktigt att tänkta på att alltid ha med någon form av kontroll. Kontrollen måste vara ett känt positivt fall som styrker att den immunohistokemiska färgningen fungerat för en viss antikropp. Kontrollen placeras på varje glas ovanför provmaterialet. Utan en positiv kontroll skulle ett negativt resultat bli obedömbart. Skulle den interna kontrollen inte uppvisa en positivitet eller endast ge svag positiv infärgning kan det bero på tre olika saker. Antigen har reagensen inte blivit rätt spädda, är för gamla eller så har kontrollen blivit nersnittad, så att de positiva cellerna i vävnaden inte finns kvar. I studien bedömdes alla kontroller som postiva med stark infärgning. Skulle inte kontrollen fungerat skulle fallet uteslutas eller köras om på nytt. Till Anti- humant CD99 fick tonsillmaterialet i multiklossen bytas ut mot nytt tonsillmaterial. Detta beror på att ingen infärgning skedde i tidigare tonsillmaterial. Optimering av en antikropp ska alltid utföras om antikroppen är ny och inte används på laboratoriet. Tonsill och pancreas är två vävnadstyper som enligt Dako uttrycker CD99 på olika sätt. I tonsillen uttrycktes CD99 i alla lymfocyters plasmamembran, vilket stämde med Dakos anvisningar. Eftersom endast cytoplasman i de langerhandska öarnas celler blev positivt infärgade innebär detta att bakgrundsfärgning kan uteslutas. Spädningen 1:40 gav en svag infärgning, vilket gjorde att EnVision TM FLEX+ Mouse (LINKER) tillsattes. LINKERN har till uppgift att ge en signalamplifiering så att signalen förstärks. Med LINKER fick plasmamembranet i tonsill och cytoplasman i pancreas en starkare positivitet och därför drogs slutsatsen att Anti- human CD99 ger mest optimalt resultat vid spädning 1:40 och 1:50 med LINKER. I den här pilotstudien användes en panel bestående av tre antikroppar (Anti- humant HMB-45, Anti- humant Ki- 67 och Anti- humant CD99) för att se om det föreligger en skillnad mellan spitz nevus, spitzoida melanom och maligna melanom. Bedömningen av immunohistokemisk färgning gjordes mikroskopiskt, där man bedömde om infärgningen var positiv eller negativ, stark eller svag och fokal eller diffus. Fokal infärgning definierade vi när det var mer än 20 % av tumörcellerna som blivit positiva för en viss antikropp. Diffus infärgning innebär däremot att mer än 75 % av tumörcellerna har blivit positiva för en viss antikropp. Anti- humant HMB- 45 visade en stark infärgning i alla tumörceller som befann sig i den ytliga delen av dermis, vilket innebär att det föreligger mer omogna melanocyter i den övre delen av dermis. Då spitz nevus som är en benign melanocytär tumör har histologiskt likartade drag som malignt melanom och spitzoida melanom (dvs. saknar utmognad mot djupet av dermis) är Anti- humant HMB- 45 ingen bra markör för att särskilja dessa typer. Anti- humant HMB- 45 kan dock användas för att särskilja malignt melanom från övriga benigna pigmenterade nevus, eftersom man i ett benignt nevus inte ser någon infärgning av melanocyternas cytoplasma i den djupa delen av dermis. 18

23 Generellt är Anti- humant Ki-67 en värdefull proliferationsmarkör som kan användas för att särskilja benigna nevus från maligna melanom. Detta anses bero på att malignt melanom har en högre grad av celldelning än den benigna typen (8). I den här studien var Anti- humant Ki- 67 svårtolkad, då majoriteten av lymfocyter och keratinocyter uttrycker Ki- 67 antigen. Det går framförallt att använda Anti- humant Ki- 67 för att se om det finns skillnad i djup och ytlig delen av dermis. Då liknande studier utförs i framtiden måste en dubbelfärgning med Anti- humant Ki- 67 och Anti- humant MART- 1 (Melan- A) utföras. Anti- humant MART- 1 hjälper till att särskilja lymfocyter från melanocyter genom att ge en infärgning av alla melanocyters cytoplasma (7). Anti- humant CD99 gav inget tydligt resultat, då studien visade att såväl spitzoida melanom, som maligna melanom och spitz nevus infärgades med CD99- antikroppen. Anledningen kan vara att inte tillräckligt med spitzoida melanom och maligna melanom studerades. En tidigare studie visade att 15 av 27 (56 %) spitzoida melanom uttryckte CD99, till skillnad från spitz nevus som endast uttryckte CD99 i 3 av totalt 58 fall (5 %) (26). I de flesta fall fanns en diffus infärgning av melanocyterna. Ett vanligt problem som uppkommer vid immunohistokemi är bakgrundsfärgning. Vissa celler och vävnader (erytrocyter, muskelceller, granulocyter, monocyter, lever och njurar) har endogena (naturligt förekommande) enzymer som har samma egenskaper som enzymerna i det använda detektionssystemet. Endogena peroxidaser kan reagera med substratet och kromogenet och ge en färgreaktion som är oberoende av reaktionen mellan den primära antikroppen och antigenet. Den mest använda proceduren för blockering av endogent peroxidas är inkubation med väteperoxid under 5-10 minuter. Sker ingen blockering av det endogena peroxidaset kan det bli ett falskt positivt resultat. Bakgrundsfärgning uppstår även då preparatet fixerats för långsamt. Denna långsamma fixering kan leda till att antigenet lossnar och diffunderar ut i vävnaden. Extracellulära antigen och antigen av låg molekylvikt har lättare att lossna och diffunderar ut i vävnaden. Felaktig fixering, snittning eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan orsaka artefakter eller falskt negativa resultat. Användning av gamla eller obuffrade fixeringsmedel eller exponering av vävnader för hög värme (högre än 60ºC) i värmeskåp kan leda till minskad färgsensitivitet (19). I studien sågs ingen bakrundsfärgning då exempelvis endast vissa celltyper blev infärgade som förväntat. Vid bakgrundsfärgning måste proverna köras om på nytt för att utesluta falska positiva resultat. Ett detektionsreagens som består av en dextranryggrad till vilken ett antal peroxidasmolekyler (HRP) och sekundära antikroppar finns bundna är universellt, vilket betyder att det kan användas till en primär antikropp av både mus- och kanin- typ. Att detta är möjligt beror på de sekundära antikropparna som är både av anti-kanin och anti- mus typ. Substratsystemet består av två komponenter, en DAB- lösning och en substratbuffert som innehåller väteperoxid. Det är substratsystemet som producerar en skarpt brun slutprodukt vid målantigenplatsen. I studien användes endast primära musantikroppar av IgG 1 kappa typ. De flesta antikroppar inom immunohistokemin är IgG antikroppar (19). Antikropparna som användes vid denna immunohistokemiska färgning var koncentrerade antikroppar. Vid användning av koncentrerade antikroppar kan spädningsfel uppkomma, vilket helt elimineras med Ready- to- Use antikroppar som kommer färdigspädda från producenten. Idag finns möjligheten att köpa majoriteten av antikroppar som Ready- to- Use. Ur diagnostisk synpunkt ger båda typerna av antikroppar samma infärgning och resultat. Spädningsfel kan ofta leda till bakgrundsfärgning (19). 19

24 Tvättbufferten som används inom immunohistokemi får inte ha för hög saltkoncentration, för hög temperatur eller för lågt ph. Dessa faktorer kan påverka den specifika bindningen mellan antigen och antikropp så att det reversibla komplexet dissocierar (19). Detta kan leda till falskt negativa resultat. Därför är alla dessa moment viktiga för att utesluta falsk negativitet och falsk positivitet. Studien var en pilotstudie, där resultatet visade att man ännu inte kan vara hjälpt av immunohistokemiska markörerna Anti- humant HMB- 45, Anti- humant Ki-67 och Antihumant CD99 vid differentialdiagnostik mellan spitz nevus och malignt melanom/ spitzoida melanom, dock är antalet patientfall för få. Än så länge är morfologi och mitoser viktigast vid differentialdiagnostik mellan spitz nevus och maligna melanom/ spitzoida melanom. Studien kan utvecklas genom att titta på större patientmaterial och använd andra relevant antikroppar för studien. 20