Nanobioteknologi för framtidens proteinanalys

Transkript

1 Nanobioteknologi för framtidens proteinanalys Simon Ekström Dept. of Measurement Technology and Industrial Electrical Engineering / CREATE Health Lund University, Sweden

2 Institutionen för Mätteknik och Industriell Elektroteknik i Lund Grundad av Professor Hellmuth Hertz Medicinskt Ultraljud Thomas Laurell fokus på Nanobiotechnologi och Lab-on-achip / klassisk proteomik / medicinskt US Dept. of Measurement Technology and Industrial Electrical Engineering Create Health - A Strategic Centre for Translational Cancer Research

3 Genomik Genomet, vårt arv är lagrat i from av DNA DNA är uppbyggt av 4 olika byggstenar ( A, T, G, C) Människan 5 x10 9 baspar = 2 meter utvecklat Duva ca 16 meter

4 Proteomik Proteom = den mängd olika proteiner som finns i en organism Proteinerna är uttrycket av vår genetiska potential Proteiner är involverade i alla biologiska processer E. coli bakterie innehåller ca 4000 olika proteiner

5 Lab-on-a-chip // Nanobioteknologi Microfluidik => laminärt flöde => svårt att blanda saker Korta diffusionsavstånd => snabb blandning genom diffusion För en 1 mm kanal tar det ca 100 s. att diffundera över men för en 10 um kanal tar det 10 millisekunder Ytarea till volym förhållandet ökar (med r -1 ) = ytegenskaper viktiga Ytspänning och viskositet blir viktiga parametrar Värmetransfer och avdunstining snabbare Små små provvolymer => många/billigare analyser

6 Problem med Protein Analys 1. Human Genome Data komplett, men ger inte svar på hur biologiska processer fungerar. 2. Protein uttrycket i en organism är dynamiskt ( sekunder veckor) 3. Ca gener = 1 miljon olika proteiner i det humana proteomet? 4. Proteins finns i oilka koncentrationer Ingen universell analys teknik 6. Proteiner antar tre-dimensionella strukturer som bestämmer funktionen $

7 Pharma perspektivet... >90% av substanserna som går till klinisk pröving är skräp Kostnaden för att sätta ett nytt läkemedel på marknaden är flera miljarder

8 Samhällsperspektiv --- Åldrande befolkning 2050 = 30% 2030 = 20% = 10%

9 Ni -- vem är sjuk och vilken medicin kommer ge bäst resultat Domenici E, Wille R, Tozzi F, Prokopenko I, Miller S, McKeown A, Brittain C, Rujescu D, Giegling I, Turck CW, Holsboer F, Bullmore ET, Middleton L, Merlo-Pich E, Alexander RC, Muglia P. (2010) Plasma protein biomarkers for depression and schizophrenia by multi analyte profiling of case-control collections. PLoS One 5:e9166

10 Protein Biomarkörer har stort kliniskt värde Sedan när? Hur många tester? Hur noggrant? Årtionden > 10 million/år 100pg/ml Cardiac damage Cancer Inflammation Liver Damage Coagulation Allergy Infectious disease TnI, CK-MB, Mb, MPO, BNP PSA, CA-125, Her-2 CRP, SAA, cytokines, RF ALT, ALP, AST, GGT (enzyme assays) AT-III, proteins C&S, fibrinogen, VWF IgE against various antigens HIV-1, Hepatitis BsAg

11 Number of Resolved Species Utvecklingen för protein analys i plasma Number of Zones/Spots Sequence Identified Unique Proteins 2-D 3 + -D 1175 d 607 a b 319 c 10 1-D The human plasma proteome: History, character, and diagnostic prospects. Anderson, N.L. and Anderson, N.G., Molecular and Cellular Proteomics, 1.11, (2002) a. J. N. Adkins, et al, Mol Cell Proteomics 1, b. R. S. Tirumalai, et al, Mol Cell Proteomics 2, c. R. Pieper, et al, Proteomics 3, d. H_Plasma_NR-v2

12 Fler proteiner observerade ---- men inte så många nya Protein Assays!!!

13 Varför så få nya protein assays? Några kritiska faktorer: Den lågt hängade frukten är plockad? Prover som verkligen representerar en kliniskt biologisk frågeställning utan bias? Teknologier som kan hitta skillanderna i proverna mellan sjuk och frisk? Validering av upptäckta protein biomarkörer (eller mönster) är både tidskrävande och dyrt! Patent (multiplexa assays med olika markörer ett problem)?

14 Men det ser ljusare ut Tekniken --- Studie Design ---- Biobankerna --- Bioinformatik

15 Mass Spectrometry för Protein Analys Off-line (MALDI) eller on-line (ESI) beroende på applikation Inte lika känslig som fluorescens (än) Ger ett svar på vilken analyt som detekterats! Man kan idag detektera 1000-tals proteiner från ett pyttelitet prov och kvantifiera 100- tals proteiner under 1 enda körning

16 MALDI-TOF MS -- Enklast att förklara Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry

17 Protein indentifikation

18 Proteomik Analys

19 Nanobiotech exempel Array baserad SPE Antikropps arrayer på poröst kisel Akustisk trapping av celler

20 Rationale för Array baserad SPE Optisk detektion kräver labelling (false positives/negatives och risk för artefakter) MS kan ge en 100% id. För den detekterade analyten Det finns massor med affinitets media och protokoll som man kan stjäla och implementera Ta fram biologiskt prov Masspektrometri Prov beredning Tid~15% Tid ~80% Tid~5%

21 ISET- Integrated Selective Enrichment Target An array based solid-phase affinity binding platform for sample preparation, discovery screening and diagnostic assays? 1. Ta bort skräp 2. koncentrera analyter 3. Hög recovery 4. Snabbt o billigt 5. Automatiserbar 6. Lätt att använda Same dimensions as the standard MALDI target. e.g. 5.5 x 5 cm and 96 perforated nanovials (30 nl volume) Electrophoresis, 2004, 25, Journal of Proteome Research, 2006, 5,

22 ISET provbearbetning och masspektrometri på samma chip

23 Generic platform for SPE MALDI MS Requirements: 384 micro plate holder for vacuum, maldi adaptor All fixtures/chips matched to 384 pitch and positions!

24 ISET prov laddning Sample through pre-packed beads Sample bound to beads transfered to ISET

25 ISET vätskehanterings robot - low end Beckman-Coulter Biomek 3000 Proverna dras genom ISET mha vakuum Efter tvätt och eluering (1ml) landar de uppreande proverna kring utloppet, redo för MALDI MS

26 ISET vätskehanterings robot - high end 8-channel non-contact solenoid dispensing robot (25 nl-10 ml) from Seyonic SA (Neuchâtel, Switzerland) Advanced sample prep. protocols (digest, derivatization ) Maximal sensitivity by nanovolume elution (2 x 200 nl)

27 Jämfört med traditionella SPE tekniker 50 fmol (5 nm) standard prov analyserat ISET Comp 1 Comp 2

28 Intensity <3123.4> Fosfopeptid analys med TiO 2 kulor ISET 1:10 serum spiked with β-casein on ISET 2061 Da 500 fmol of casein Da r_f15 50 fmol of casein r_g14 5 fmol of casein m/z 5500 r_i14 C:\Documents and Settings\bogdanal\Desktop\Mass Spec\ISET_4_direct_031407\r_I14.txt (12:53 03/15/07)

29 På ISET digestion av upprenade protein This type of ISET sample preparation requires the high-end robotics

30 In ISET digestion av standard protein 1 pmol (red), 200 fmol (blue) and 50 fmol (black) Identifiera antikropps fångade proteins / QA på recombinant protein

31 Studier av Enzym Aktiviet ISET SPE sample prep Ratio substrate:product Ratio light:heavy PKA CYP2D6 To reach the lower (nm) levels we need to get rid of background

32 Poröst kisel för antikropps arrayer Stor yta 3D hög kapacitet Kisel är hydrofilt (-Si-OH) less risk of denaturing Ab s Nanotextured surface behaves hydrophobic

33 Screening porous silicon morphologies for protein microarrays Contact angle <90 Contact angle >90 Glass Silanized glass Porous silicon High density arrays ( spots/cm 2 ) High sensitivity

34 Quantitative assaying in 80 patient samples 10 mm 50 mm Samples analyzed: 80 EDTA plasma samples obtained from patients undergoing clinical PSA testing, covering a clinically relevant range

35 Immunoassay på nanostrutured Porous Silicon följt av ISET RP SPE och MALDI MS Analytical Chemistry, 2011, 83,

36 Immunoassay on nanostrutured Porous Silicon using the Biomek 3000

37 Immunoassay on nanostrutured Porous Silicon is as good as Magnetic beads without tedious immobilization of antibodies and complex sample handling Mag beads to ISET Porous silicon to ISET Non-porous silicon to ISET

38 Immunoassay on nanostrutured Porous Silicon spiked plasma On chip capture using Ang 1 Antibody from 10 ul sample volume subjected to ISET RP SPE 5 nm Ang 1 spiked into plasma 1 nm Ang 1 spiked into plasma

39 Acoustic trapping of beads or cells followed by MS Pressure Allows us to get rid of the background = lower sensitivity Use less material beads or rare cells Reproducible number of cells ( RBC) Force Observe cell-cell or protein-ligand interactions functional assays

40 Volume reconstruction from confocal microscopy Beads collected in channel centre Non-contact trapping Confocal volume scan: Green channel 4.2 um FITC (bead cluster) Red channel reflective data (capillary walls) Volumetric calculation gives ~ cells (RBC)

41 Workflow for the Acoustic Trapping ISET SPE MALDI-MS Analysis ISET SPE sample preparation Acoustic Trapping MALDI-MS Analysis

42 Proof of principle experiment 10 ul Blood diluted x 10 PBS Menbrane impermeable peptide at 40 um Membrane binding small molecule at 2 um Acoustic trapping -> wash -> lysis -> ISET -> MALDI MS

43 Automated trapping of cells or beads Automation Aspiration/perfusion Defined # of cells Temporal resolution

44 MALDI MS read-out Peptide Drug Differential peaks

45 Utmaningar i framtida protein analys Biomarkör discovery från jättesmå biobank prover Stora kohorter i Kliniska studier Screening av stora mängder protein/antikroppar (HPR, ScFv,,,) Validering av assays Funktionella assays Diagnosiska assays som kostnads effektivt kan implementeras på kliniken

46 Vision Biological question Biomarker Discovery Screening Targets Nanobiotech Mass Spectrometry Affinity probes Nya assays och teknik plattfromar för patient stratifiering och point-of-care analys

47 Thomas Laurell Björn Hammarström Johan Nilsson Simon Ekström György Marko-Varga Prof. Hans Lilja Memorial Sloane Kettering Cancer Centre New York Belinda Adler Asilah Tajudin Per Augustsson Dr. Johan Malm Dept. Laboratory medicine, Malmö University Hospital, Sweden Crafoord Foundation Carl Trygger Foundation