BIOLOGISKA TESTMETODER

Transkript

1 Emma Larsson Biologiskt aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling, 5p, HT 2007 Inst. F. Läkemedelskemi, avd. f. Farmakognosi Uppsala Universitet BIOLOGISKA TESTMETODER In vivo vs. in vitro metoder Med in vivo menar man att experiment och tester är gjorda på levande organismer, i motsats till in vitro som betyder att experiment är gjorda i en konstlad miljö som t ex provrör eller agarplatta. In vivo metoder går ut på att testa hela organismer, vävnader eller celler i en levande kropp. Ofta använder man sig av s.k. biomarkörer för att påvisa en viss företeelse/sjukdom/tillstånd (NE, 2007). Exempelvis kan sägas att om förhöjda halter cancerantigener (biomarkör) påträffats i blodprov så indikerar det att försöksdjuret kan ha drabbats av vissa cancerformer. Exempel på in vivo metoder är klassiska djurförsök, där djur utsätts för den eller de substanser som är av intresse och sedan observeras för olika effekter såväl morfologiskt som fysiologiskt (t ex blodprov). Andra exempel är då läkemedel testas på människa eller djur och halten av metaboliter från biotransformationen mäts genom t ex blod och urinprover. Av de in vitro metoder som används inom läkemedelsutveckling kan nämnas kemoterapeutiska assays (infektioner/cancer) som t ex olika antibakteriella assays och assays för att påvisa leukemi. Vanligt är även biokemiska (enzymatiska) assays såsom cyklooxygenas assay (Claeson & Bohlin, 1997). Cyklooxygenaser är enzymer som omvandlar fleromättade fettsyror till prostaglandiner och tromboxanter. Genom att inhibera produktionen av prostaglandiner med cyklooxygenas fås en antiinflammatorisk effekt (NE, 2007). Ames test är ett vanligt in vitro test för att påvisa ev. mutagenicitet hos en substans. Strängar av Salmonella bakterien används, med en defekt på genen som behövs för histidinsyntes. Mutagener kan orsaka en förändring i DNA som gör att histidin ändå kan produceras, vilket betyder att om bakterien kan föröka sig trots sin ursprungliga defekt så är substansen (troligtvis) mutagen (Bruce et al., 2002). 1

2 Figur 1. Schematisk bild över metoden för Ames test (Figur The Ames test of mutagenicity ur Alberts et al., 2002). In vivo metoderna är essentiella verktyg för att validera och understödja in vitro resultat och för att röja undan alternativt avslöja osäkerheter från in vitro prover med avseende på botillgänglighet och toxikokinetik. Dessvärre är dessa metoder ofta dyra och tidskrävande, samt att det finns en etisk faktor inblandad då försöksdjur används som ibland måste sövas och opereras vilket kan orsaka lidande. Därför föredras ofta in vitro metoder, som ofta är snabbare och billigare och dessutom inte involveras levande djur. En annan fördel är att testerna ofta kan specificeras mycket bättre än in vivotester, där man egentligen inte vet om effekten kommer från försöket eller något annat. En nackdel med in vitro testerna är dock att de olika signalsystem som återfinns i en levande organism inte finns med i bilden och det är svårt att avgöra hur det kommer att fungera i ett levande system utan in vivometoder (Behnisch et al., 2001). High Throughput Screening (HTS) Med High Throughput Screening (HTS) menas en process där ett stort antal substanser kan testas för aktivitet på ett automatiserat sätt. Både antagonister och agonister kan undersökas för viss aktivitet hos ett biologiskt mål såsom en receptor eller ett enzym (Claeson & Bohlin, 1997). De senaste åren har många nya metoder uppkommit till följd av ett ökat intresse för ännu snabbare och mer precisa HTS, och även andra naturvetenskapliga grenar såsom bioinformatiken har kommit att spela större roll i utvecklandet av nya programvaror och tester (Entzeroth, 2003). 2

3 Figur 2. Översiktlig bild av förfarandet vid HTS av komplexa prover mha HPLC kopplat till såväl biokemiska verktyg som kemisk analys och detektion med masspektrometri (Figur 2 i Entzeroth, 2003). Exempel på viktiga verktyg är cellbaserade HTS assays med jäst (funktionsgenomik), HTS proteinarrays (proteomik) och fluorescerande tekniker kompletterade med enzymatiska assays. Nytt är även de HTS metoder som bygger på NMR, HPCL och CE (kapillärelektrofores). HTS assays kopplade till spec. NMR används ofta för att studera interaktioner mellan läkemedelssubstanser och proteiner. För mer komplexa blandningar används CE och HPLC som komplement, som t ex CE baserade screeningssystem som integrerats i mikrochips för att övervaka olika enzymatiska reaktioner. En genomgående trend är också att försöka minska på de stora bibliotek av tester och resultat som fås av HTS, genom att använda t ex NMR eller fluorescens. Det blir allt viktigare att få ut mer specifik information från screeningarna, för att inte bara få ett högt antal prover scannade utan också mer information om innehållet (Entzeroth, 2003). För och nackdelar med HTS Fördelarna med HTS är många. En uppenbar fördel är automatiseringen, som gör att mindre personal krävs för arbetet. Det ökade avancemanget inom bioteknologin har medfört vätskebaserade HTS tekniker, vilket underlättar vid små provmängder och också reducerar den volym som behöver användas av t ex medium och andra laboratorievätskor. Den viktigaste fördelen torde dock vara snabbheten numera klarar HTS teknikerna ca assays/dag eller mer och brukar därför kallas för ultrahts (uhts) (Hertzberg & Pope, 2000). 3

4 De huvudproblem som dock finns med HTS som enligt Hertzberg och Pope (2000) kan delas in i tre kategorier: (1) Metoder och detektion ( biovaror ), (2) hanteringen av vätskor och robotik (hårdvaror) och (3) processflödet och informationshanteringen (mjukvaror). På senare tid har dock flera framgångsrika metoder för detektering utvecklats och anpassats till HTS, som t ex fluorescensmetoder och radiometrisk/strålningsdetektion. Även vätskemetoder involverande LC och HPLC finns nu tillgängliga och ny apparatur och teknik utvecklas kontinuerligt. Den största nackdelen verkar istället vara hur processövervakningen ska skötas samt hur dataregistrering och mjukvaror bör utformas för att uppnå optimala resultat. Men med den avancerade teknologin och de framsteg som sker idag bör dessa problem i sinom tid kunna gå att undanröja. Bioassay guidad isolering Bioassay guidad isolering är benämningen för de olika bioassays som tillsammans används för att hitta, separera ut och isolera en ren bioaktiv substans för t ex läkemedel. Liksom vid alla biologiska metoder så testas den biologiska aktiviteten i proven. Bioassay guidad isolering används för att (1) kunna detektera (och ev. kvantifiera) närvaron av bioaktiva molekyler i provet, (2) ge vägledning om hur provet kemiskt bör fraktioneras för att kunna isolera substansen och (3) ge en översiktlig bild över den isolerade substansens egenskaper (Claeson & Bohlin, 1997). De fraktioner som visar högst aktivitet screenas ytterligare medan inaktiva eller svags aktiva delar av provet kasseras. Proceduren upprepas tills aktiviteten anses hög nog i hela provet, varpå upprening och isolering av den aktiva substansen sker (med t ex LC/MS) samt identifiering av substansens kemiska struktur (med NMR) (Kapková et al., 2005) 4

5 Figur 3. Exempel på en strategi för bioassay guidad isolering (figur 2 i Kapková et al., 2005). Krav på testsystem (assays) Testsystem/bioassays för användning vid t ex läkemedelsutveckling bör vara både billiga och snabba, eftersom man så fort som möjligt vill kunna utröna potentialen hos substansen som ett framtida läkemedel samtidigt som man inte vill lägga för mycket pengar på det ifall svaret blir nej. Det är också viktigt att systemen är tillförlitliga. Testsystemen bör vara så automatiserade och enkla som möjligt, för att minimera mängden personal som behövs. Exempel på bioassays ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) är en vanligt förekommande enzymbaserad assay, som med hjälp av antikroppar kan användas för att detektera olika substanser. Ett enzym, som vid kontakt med kemikalien av intresse producerar ett färgat precipitat, kopplas till en sekundär antikropp som i sin tur kopplas till en primär antikropp. Exempelvis används enzymet alkalinfosfatas som vid kontakt med vissa ämnen bildar oorganiskt, färgat fosfat. Där färgförändringen kan utläsas är också samma ställe som antikropp antigen komplexet befinner sig (Alberts et al., 2002). FLIPR (Fluorescent Imaging Plate Reader) är en cellbaserad assay, en fluorescensmetod som mäter intracellulära förändringar av Ca 2+ i realtid. Den har använts bl a för att finna ligander till G proteinkopplade receptorer utan känd ligand (s.k. orphan receptors) samt för att screena av olika 5

6 substansbibliotek. FLIPR kan även användas för att mäta jonkanalers funktioner genom att koppla samma aktiviteten hos en målkanal med en spänningskänslig Ca 2+ kanal (Hertzberg & Pope, 2000). Referenser: Alberts, Bruce et al., Molecular Biology of the Cell. Garland Science, New Tork Behnisch, P. A., Hosoe, K., Sakai, S Bioanalytical screening methods for dioxins and dioxin like compounds a review of bioassay/biomarker technology. Environment International 27: Claeson, P., Bohlin, L Some Aspects of Bioassay Methods in Natural product Research Aimed at Drug Lead Discovery. Trends in Biotechnology 15: Entzeroth, Michael Emerging trends in high throughput screening. Current Opinion in Pharmacology 3: Hertzberg, R. P., Pope, A. J High throughput screening: new technology for the 21st century. Current Opinion in Chemical Biology 4: Kapková, P., Heller, E., Unger, M., Folkers, G., Holzgrabe, U Random Chemistry as a New Tool for the Generation of Small Compound Libraries: Development of a New Acetylcholinesterase Inhibitor. Journal of Medical Chemistry 48: Källa Nationalencyklopedin Källa Nationalencyklopedin. 6