Protein folding
Centrala Dogmat DNA RNA Protein
Anfinsens klassiska experiment
Proteinstrukturer
Faktorer som påverkar den nativa strukturen Termodynamisk förklaring G = Η Τ Τ S G = - RT ln K K = [veckat protein] / [ uppveckat protein] För stabilisering krävs: H blir mindre eller S större
Vad menas med ett proteins stabilitet? Uppveckat protein Veckat protein
Hur mäter man protein stabiliteten? T m eller C m
CD: circular dichroism The far-uv (190-240nm) CD spectrum of proteins can reveal important characteristics of their secondary structure. It can be used to study how the secondary structure of a molecule changes as a function of temperature or of the concentration of denaturing agents (Guanidine hydrochloride or urea). In this way it can reveal important thermodynamic information such as G and Tm. The near-uv CD spectrum (>250 nm) of proteins provides information of the tertiary structure.
CD spectrometer
Fluorescens
Stability using ANS as an extrinsic fluorescent probe Fluorescence Intensity (A.U) 2,6e+006 2,4e+006 2,2e+006 2e+006 1,8e+006 1,6e+006 1,4e+006 1,2e+006 1e+006 8e+005 6e+005 4e+005 2e+005 0 20 40 60 80 Temperature (C)
Binding of Methotrexate to TPMT by displacement of ANS
Bestämma 3d strukturen av ett protein
Proteinkristaller
Bestämma 3D strukturen av ett protein
Varför stabilisera proteiner? Förhindra enzymer från nedbrytning Förhindra uppveckning i närvaro av detergent Öka termostabiliteten
Exempel på stabiliserade proteiner Enzymer i bakning Enzymer i tvättmedel
Strategier för att förändra proteinstabiliten Riktad mutagenes (rationell design) Slumpartad mutagenes (random design)
Kloning av protein
Genen för humant karboanhydras 5 ATGGCCCATCACTGGGGGTACGGCAAACACAACGGACCT GAGCACTGGCATAAGGACTTCCCCATTGCCAAGGGAGAGCG CCAGTCCCCTGTTGACATCGACACTCATACAGCCAAGTATG ACCCTTCCCTGAAGCCCCTGTCTGTTTCCTATGATCAAGCA ACTTCCCTGAGGATCCTCAACAATGGTCATGCTTTCAACGT GGAGTTTGATGACTCTCAGGACAAAGCAGTGCTCAAGGGAG GACCCCTGGATGGCACTTACAGATTGATTCAGTTTCACTTT CACTGGGGTTCACTTGATGGACAAGGTTCAGAGCATACTGT GGATAAAAAGAAATATGCTGCAGAACTTCACTTGGTTCACT GGAACACCAAATATGGGGATTTTGGGAAAGCTGTGCAGCAA CCTGATGGACTGGCCGTTCTAGGTATTTTTTTGAAGGTTGG CAGCGCTAAACCGGGCCTTCAGAAAGTTGTTGATGTGCTGG ATTCCATTAAAACAAAGGGCAAGAGTGCTGACTTCACTAAC TTCGATCCTCGTGCCTCCTTCCTGAATCCCTGGATTACTGG ACCTACCCAGGCTCACTGACCACCCCTCCTCTTCTGGAATG TGTGACCTGGATTGTGCTCAAGGAACCCATCAGCGTCAGCA GCGAGCAGGTGTTGAAATTCCGTAAACTTAACTTCAATGGG GAGGGTGAACCCGAAGAACTGATGGTGGACAACTGGCGCCC AGCTCAGCCACTGAAGAACAGGCAAATCAAAGCTTCCTTCA AATAA-3 Riktad mutagenes Genetiska koden
Riktad mutagenes
Modellproteiner T4 Lysozym Cold-shock protein Karboanhydras
T4 Lysozym Ett av de mest välstuderade proteinerna om protein stabilitet Över 2000 mutanter och 400 kristallstrukturer Erhållit klara samband mellan struktur och funktion (stabilitet)
T4 Lysozym Förbättra helixpropensitet, t.ex mutant V131A Minska entropin i det uppveckade tillståndet, t.ex mutant A82P Optimera hydrofobinteraktion t.ex mutant I3L Stabilisering av positiva laddningar i helix, t.ex mutant S38D
Design av stabilt protein Jämförelse mellan protein från mesofil och termofil organism Bs-Csp mesofil Bc-Csp termofil
Hur stabilisera mesofila Bs-Csp? Bs-Csp, mesofil, Tm=53.6 Bc-Csp, termofil, Tm=76.9 10 20 30 40 50 60 MLEGKVKWFNSEKGFGFIEVEGQDDVFVHFSAIQGEGFKTLEEGQAVSFEIVEGNRGPQAANVTKEA MQRGKVKWFNNEKGYGFIEVEGGSDVFVHFTAIQGEGFKTLEEGQEVSFEIVQGNRGPQAANVVK-L Ref: D.Perl & F.X Schmid, J.Mol.Biol. (2001), 313, 343-357
Resultat av rationell design E66L E3R Ref: D.Perl & F.X Schmid, J.Mol.Biol. (2001), 313, 343-357
Proteinveckning Uppveckat protein Molten globule Veckat protein 1 Fractional change 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 2 4 6 [G u H C l] (M )
Stabilitet HCA II och NGCA 1 1 Fractional change 0,8 0,6 0,4 0,2 Fractional change 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 2 [GuHCl] (M) 4 6 0 0 2 4 G u H C l (M ) 6
Jämförelse HCA II & NGCA
Design av disulfidbrygga A Ala 23 Leu 203 B N-terminal C-terminal Ref: Mårtensson, L-G, Karlsson; M & Carlsson U. (2002) Biochemistry 41, 15867-15875
Energy minimized A23C/L203C
Ramachandran plots
Stabilitet disulfidvariant A23C/L203C 354 352 350 348 A23C/L203C red. 346 344 342 340 338 336 A23C/L203C ox. HCA II pwt 0 1 2 3 4 (GuHCl] (M) Ref: Karlsson, M., Mårtensson, L.-G., Olofsson P. & Carlsson, U. (2004) Biochemistry In press
Slumpartad design Förändra genen helt slumpartat Leta efter den gen som ger ett protein med hög stabilitet Selektionsproblem
Framtiden? Förutsäga 3D struktur från aminosyrasekvensen In silico design