Bruksanvisning. Dynals AllSet + - och CombiSet + SSPfamiljer

Bruksanvisning Dynals AllSet + - och CombiSet + SSPfamiljer 0088

INNEHÅLL Sid AVSEDD ANVÄNDNING... 3 SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING... 3 FÖRFARANDETS PRINCIPER... 3 REAGENSER... 4 Som Ingår I Typningssatsen... 4 Förvaring... 4 VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSANVISNINGAR... 5 UTRUSTNING SOM BEHÖVS MEN SOM INTE TILLHANDAHÅLLS AV DYNAL... 5 FÖRFARANDE... 6 Provtagning och provberedning... 6 Inställning av PCR-förstärkning... 6 PCR-förstärkning... 8 PCR-detektering med agarosgelelektrofores... 9 FÖRFARANDETS BEGRÄNSNINGAR... 10 FÖRVÄNTADE VÄRDEN... 10 Kvalitetskontroll... 10 Intern test... 10 Tolkning av resultaten... 11 Tolkning me Dynal SSPTool... 11 FELSÖKNINGSGUIDE... 12 BIBLIOGRAFI... 13 GARANTI... 14 DOKUMENTETS/PRODUKTENS VARUMÄRKEN... 14 DOKUMENTETS/PRODUKTENS PATENT... 14 KONTAKTINFORMATION... 15 Sid 2 av 15

För diagnostiskt in vitro-bruk AVSEDD ANVÄNDNING DNA-typning av klass I eller klass II HLA-alleler. TYPNINGSUPPLÖSNING Lågupplösningskit: Alleleler löses på den allmänna nivån, eller allelgruppnivån, som i allmänhet överensstämmer med de serologiskt definierade specificiteterna. Högupplösningskit: Högupplösningskit, eller undertypningskit, sörjer för hög upplösning eller genotypning på allelnivån SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING Så gott som alla DNA-baserade vävnadstypningstekniker använder PCR-tekniken 1 för att förstärka det HLA-lokus som ska undersökas. Vid de flesta DNA-baserade metoder för vävnadstypning används PCR-tekniken som typningsförberedande förstärkningssteg för att öka mängden mål-dna. Därefter kräver HLA-typningsprocessen ett förförstärkningssteg för att skilja mellan de olika allelerna. Till skillnad mot andra PCR-baserade metoder skiljer den SSP-metodologi 2,3,4,5 som tillämpas av Dynal Biotech Ltd AllSet + och CombiSet + SSP mellan de olika allelerna under PCR-processen. Detta kortar ner bearbetningstiden för förförstärkningen till enbart ett enkelt detekteringssteg för gelelektrofores. FÖRFARANDETS PRINCIPER Dynal SSP-metoden utgör en PCR-baserad teknik som använder sig av sekvensspecifika primers (Sequence Specific Primers SSP) för DNA-baserad vävnadstypning. Dynal SSP-produkterna består av paneler med primerblandningar, där varje primerblandning innehåller ett eller flera specifika primerpar, dvs. de allel- och/eller gruppspecifika primerna, liksom också ett kontrollprimerpar, som motsvarar icke-alleliska sekvenser i proven. Kontrollprimerparet fungerar som en intern PCR-kontroll för verifiering av PCR-förstärkningarnas effektivitet. Dynal SSP bygger på principen att en perfekt anpassad primer används effektivare i PCR-reaktionen än en primer med en eller flera missanpassningar i sin 3 ände. Typningssystemets specificitet utgör en del av PCR-förstärkningssteget, och efterförstärkningsbearbetningen av proven reduceras till ett minimum. Tilldelningen av allelerna består enbart i fastställandet av huruvida försträkning har skett eller inte, dvs. visualisering och detektering av förstärkningen med agarosgelelektrofores. PCR-SSP-tekniken ger en höggradig upplösning eftersom varje primerpar identifierar två länkade, cis-placerade polymorfiska platser. Metoden sörjer för hög känslighet, specificitet och reproducerbarhet. Sid 3 av 15

REAGENSER Reagenser i samtliga Dynal AllSet + SSP- eller CombiSet + SSP-kit Enhet 1. PCR-brickor med föralikvoterade och torkade SSP-primerblandningar Beskrivning Varje brunn på PCR-brickan innehåller en torkad SSPprimerlösning, som består av såväl allel- och/eller gruppspecifika primers som av ett kontrollprimerpar anpassat till icke-alleliska sekvenser. Kontrollprimerparet förstärker ett fragment av en konserverad gen som förekommer i samtliga prov. 2. PCR-lock Lock för förslutning av PCR-brickorna Antal PCRreaktioner per test Antal flaskor med huvudblandning som ingår i kitet (samtliga 1,8 ml) 3. Huvudblandning (hur många flaskor som ingår i kitet beror på antalet PCR-reaktioner per test se tabellen till höger) 1-9 1 10-20 2 21-40 3 41-95 4 96 5 1 x Koncentration klar för användning. Huvudblandningen har optimerats för användning med AmpliTaq DNA Polymerase (Roche Molecular Systems, Inc.) Formuleringinformation återfinns på hla@dynalbiotech.com 4. Broschyr med bruksanvisning för produkten/satsspecifik produktinformation 5. Tolkningsarbetsblad Broschyr med bruksanvisning och satsspecifik produktinformation (BSPI). Ett arbetsblad för att fastställa av vilken allel eller allelgrupp respektive primerblandning identifierar. Förvaring 1. PCR-brickorna och huvudblandningen måste förvaras vid en temperatur på 2-8 C. 2. Frys inte reagenserna. 3. Vid korrekt förvaring är dessa reagenser och primerblandningar stabila fram till det sista användningsdatum som anges i broschyren med satsspecifik produktinformation. Sid 4 av 15

VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSANVISNINGAR 1. För diagnostiskt in vitro-bruk 2. Allt arbete med Dynal AllSet + och CombiSet + SSP ska utföras med tillämpning av god laboratoriepraxis, och i enlighet med lokala riktlinjer, exempelvis EFI-standarderna eller CPAriktlinjerna 3. Varning för biologisk risk Hantera alla prover som om de kan överföra sjukdomar. Allt arbete ska utföras med lämpliga handskar och lämplig skyddsutrustning 4. Varning för biologisk risk Rör med skruvlock ska användas vid provberedningen, för att förebygga provstänk och risken för kontaminering 5. Varning för biologisk risk: Hantera alla prover som om de är infektiösa, med tillämpning av säkra laboratorieförfaranden som exempelvis dem som redovisas i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 6 och i NCCLS-dokument M29-T 7. Rengör och desinficera alla arbetsytor omsorgsfullt med 1-procentigt blekmedel (NaClO). Autoklavera utrustning och material som kommit i kontakt med kliniska prover före kassering 6. Varning för biologisk risk: Den etidiumbromid som används för DNA-färgningen utgör en potentiell cancerogen. Använd alltid nitrilhandskar vid hantering av färgade geler och etidiumbromid. 7. Försiktighet: Använd UV-blockerande ögonskydd, och titta inte direkt in i UV-ljuskällor med oskyddat öga, vid betraktande eller fotografering av geler. 8. Försiktighet: De pipetter som används för PCR-avslutande åtgärder ska inte användas för PCR-förberedande åtgärder 9. Försiktighet: Kontaminering. Undvik mikrobiell kontaminering av reagenser när alikvoter tas ur reagensflaskorna. Använd alltid handskar för att eliminera risken för provkontaminering. Vi rekommenderar att sterila engångspipetter och filterpipettspetsar används. Använd inte reagenser som uppvisar tecken på grumlighet eller mikrobiell kontaminering 10. Kasseringsanvisning: Kassera oanvända reagenser och avfall i enlighet med gällande nationella och lokala föreskrifter 11. Materialsäkerhetsdatablad (MSDS) kan laddas ner från www.tissue-typing.com, och kan också erhållas från Dynal Biotechs lokala kontor. (Se kontaktinformationen på den sista sidan av denna bilaga) UTRUSTNING SOM BEHÖVS MEN SOM INTE TILLHANDAHÅLLS AV DYNAL: 1. Utrustning för manuell pipettering (exempelvis Eppendorf eller Gilson) 2. Engångsfilterpipettspetsar för denna utrustning 3. Virvelblandare 4. Mikrocentrifug 5. PCR-rack för mikrorörsförvaring 6. Perkin-Elmer GeneAmp PCR system 9600 eller 9700, eller annan godkänd termalcykler med motsvarande specification 7. Värmeplatta/mikrovågsugn för uppvärmning av agaroslösningar 8. Elektroforesapparat (exempelvis ABgene Electro-Fast Stretch 108 Complete, AB-0708) 9. UV-transilluminator 10. Gelfotograferings/bilddokumenteringssystem 11. Rekombinant Taq-polymeras (Dynal rekommenderar AmpliTaq ) 12. Agaros av elektroforeskvalitet 13. Etidiumbromid Sid 5 av 15

FÖRFARANDE OBS: Detta förfarande ska utföras inom två delar av laboratoriet (PCR-förförstärkning och PCRefterförstärkning) enligt vad som framgår av anvisningarna nedan. PROVTAGNING OCH PROVBEREDNING Försiktighet: Hantera alla prover som om de kan överföra smittämnen. a) VI REKOMMENDERAR INTE ANVÄNDNING AV HEPARINISERAT BLOD 8 b) DNA kan extraheras från humana celler med kärnor med valfri metod c) För att få en optimal PCR-SSP-förstärkning, och optimala typningresultat, ska man använda DNA med hög renhetsgrad (OD 260:280 förhållande 1,6-1,8). d) Den slutliga DNA-koncentrationen före PCR-SSP ska vara ungefär 50 ng/µl e) Extraherat DNA ska spädas i dh 2 0 f) DNA kan förvaras vid en temperatur på 20 C eller lägre under längre tidsperioder (> 1 year) utan att resultaten påverkas negativt. DNA som förvaras vid en temperatur på +4 C under längre tid kommer att försämras, vilket leder till flera artefakter och därmed till icke-specifika förstärkningar. INSTÄLLNINGAR FÖR PCR-FÖRSTÄRKNINGAR (utförs inom för-pcr-området) För att utföra en enstaka typning bereder man följande PCR-blandning. De volymer som behövs framgår av tabellen på nästa sida (beroende på antalet PCR-reaktioner per test). Huvudblandning Prov-DNA (vid 50 ng/µl) AmpliTaq DNA-polymeras (vid 5.i.u./µl ) Blanda ordentligt Dispensera 10 µl av ovanstående PCR-blandning i varje brunn på Dynal AllSet + - eller CombiSet + SSP-brickan Sätt på PCR-locken och dra åt dem ordentligt så att rören blir väl förslutna. Ett förslutningsverktyg kan användas. PCR-kompatibla, häftande förslutningsark kan också användas. Proven är nu klara för PCR-förstärkning Förvara återstående kitreagenser vid en temperatur på 2-8 C Sid 6 av 15

Beräkningstabell för PCR-blandningar: PCRreaktioner per test MMlösning (µl ) Prov-DNA (µl ) AmpliTaq (µl ) 1 32 7,6 0,32 4 48 11,4 0,48 6 64 15,2 0,64 8 80 19,0 0,80 10 96 22,8 0,96 12 112 26,6 1,12 14 128 30,4 1,28 16 144 34,2 1,44 18 160 38,0 1,60 20 176 41,8 1,76 22 208 49,4 2,08 24 224 53,2 2,24 26 240 57,0 2,40 28 256 60,8 2,56 30 272 64,6 2,72 40 352 83,6 3,52 42 384 91,2 3,84 44 400 95,0 4,00 46 416 98,8 4,16 48 432 102,6 4,32 96 864 206,0 9,00 OBS: Vid ojämna antal PCR-reaktioner per test, som inte är medtagna i tabellen ovan, ska man i stället använda närmast högre jämna värde (vid exmeplvis 13 PCR-reaktioner per test ska man använda sig av beräkningarna för 14 PCR-reaktioner). Sid 7 av 15

BRICKLAYOUT Rätt brickorientering säkerställs av primerblandningen i brunn nummer ett (som även identifieras med hjälp av blå färg), som är märkt med satsnumret tryckt på sidan. 1 2 3 4 5 6 7 8 e.g HLA-X 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 BORTSE FRÅN EVENTUELLA ANDRA NUMMER SOM GJUTITS IN I PLASTBRICKAN, SOM EXEMPELVIS 1, 2, 3 INSTÄLLNINGAR FÖR PCR-FÖRSTÄRKNINGAR (utförs inom efter-pcr-området) 1. Placera AllSet + - eller CombiSet + SSP-brickan i termalcyklern Programmera termalcyklern med följande parametrar: Steg Ett denatureringssteg 10 cykler 96 65 20 cykler 96 61 72 Temperatur Tid (sek.) Åtgärd ( C) 96 120 Denaturering 15 60 10 50 30 Denaturering Bindning Förlängning Denaturering Bindning Förlängning För specifik termalcyklerinformation hänvisas till tillverkarens handbok 2. Starta programmet 3. Ta bort proverna från termalcyklern när programmet är slutfört OBS: Flytta inte förstärkt DNA till PCR-förförstärkningsområdet Sid 8 av 15

PCR-DETEKTERING MED AGAROSGELELEKTROFORES OBS: Vi rekommenderar att samma buffert används för såväl framställningen av gelen som för bufferten. Om man exempelvis använder 0,5 x TBE i gelen ska man alltså också använda 0,5 TBE i bufferten. 1. Bered en 2-procentig (viktprocent) agarosgel (ABgene MultiABgarose, AG-0100c) i 0,5 x TBE-buffert a) Lös upp agasrosen (2 g/100 ml 0,5 x TBE-buffert) genom att koka den i en mikrovågsugn tills den är helt löst. Kyl till en temperatur på 60 C. Tillsätt etidiumbromid till en slutlig koncentration på 0,5 µg/ml gel. b) Gjut en 3-4 mm tjock gel med 3 mm breda brunnar. Låt gelen sätta sig i minst 15 minuter. 2. a) Överför agarosgelen till en submarin gelelektroforesenhet. Gelen ska täckas med 0,5 x TBE till ett djup på omkring 1-2 mm. Ta bort kammen försiktigt. Ladda hela PCR-produkten på gelen direkt och omsorgsfullt. 3. Kör gelerna i 0,5 x TBE-buffert. Kör minigeler (en gel med mindre än 10 cm mellan elektroderna) i 10 minuter vid 15 V/cm, och större geler i 15 minuter vid 10 V/cm. För att beräkna spänningen mäter man avståndet (i centimeter) mellan ELEKTRODERNA i elektroforesbadet (gelens längd SAKNAR BETYDELSE). 4. Undersök gelen med UV-belysning och dokumentera med fotografering. 1. Samma 0,5 TBE-buffert kan användas flera gånger, men prestanda blir eventuellt bättre om färsk buffert används. VARNING: Etidiumbromid är en kraftfull mutagen. Använd nitrilhandskar och ögonskydd vid hantering av geler eller lösningar som innehåller etidiumbromid Sid 9 av 15

FÖRFARANDETS BEGRÄNSNINGAR 1. Till följd av den höga analytiska känsligheten hos PCR ska man vara ytterst noga med att vidmakthålla kitreagensernas och förstärkningsblandningarnas renhet. Se till att arbetsflödet vid laboratoriet bara löper i en enda riktning, och att ingen PCR-amplikon förs till PCRinställningsområdet. Reagensernas renhet kan bara bevaras genom tillämpning av god laboratoriepraxis, och testprestanda kan endast garanteras om man följer anvisningarna i denna förpackningsbilaga noga. 2. Test Dynal AllSet + och CombiSet + har utvecklats med användning enbart av ickehepariniserade helblodsprover eller renade DNA-prover. Prestanda med andra prover har inte utvärderats. 3. DNA-provet utgör mallen för PCR-förstärkningsprocessen, och dess kvalitet med avseende på att såväl renhet som koncentration måste ligga inom de intervall som specificeras för detta förfarande. 4. Varje typ av godkänd termalcykler kan användas med denna produkt, förutsatt att instrumentets specifikationer motsvarar dem för Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9600 eller 9700. 5. Kontrollera att alla instrument och all urustning har kalibrerats enligt tillverkarens rekommendationer FÖRVÄNTADE VÄRDEN Kvalitetskontroll Kvalitetskontrollen och uppdateringen av DNA-baserad vävnadstypning utgör mycket viktiga moment. Syntetiserade oligonukleotider måste testas omsorgsfullt mot kända cellinje-dna:er. Primerlösningar måste testas mot såväl positiva DNA:er som negativa DNA:er med hög sekvenslikhet. Detta kvalitetskontrollförfarande används: Test av primersyntes mot en panel väl karakteriserade cellinje-dna:er Test av specifika primerlösningar mot en panel negativa och positiva DNA:er Test av komplett SSP-sats Test av slutprodukt Intern positiv PCR-kontroll Kontrollprimerparet 9 finns med för att bekräfta PCR-reaktionens effektivitet. Dess närvaro bekräftar att avsaknaden av en specifik förstärkning vid en viss given reaktion verkligen är en följd av avsaknaden av den polymorfismen i DNA-provet, och inte beror på misslyckad PCR-förstärkning. Till följd av de annorlunda koncentrationerna och bindningstemperaturerna för de specifika primerparen, jämfört med det interna kontrollprimerparet: - minskar många gånger kontrollbandets intensitet i närvara av en specifik förstärkning, samt - blir de interna kontrollprimerna känsligare för icke-optimala PCR-förhållanden och kan användas för övervakning av PCR-effektiviteten Misslyckad förstärkning av de interna kontrollfragmenten inom linjer utan specifika förstärkningar ska betraktas som ett tecken på ett icke-optimalt system. Möjliga orsaker och korrigerande åtgärder redovisas i felsökningsavsnittet. Specifik information om den interna positiva kontrollen återfinns i den satsspecifika produktinformationsbroschyr som medföljer varje kit. Sid 10 av 15

TOLKNING AV RESULTATEN Alleler tilldelas genom förekomsten av en specifik PCR-produkt. En specifik förstärkning i en linje indikerar att DNA-provet innehåller den allel, eller en allel inom allelgruppen, som definieras av primerparet i den aktuella PCR-reaktionen. Använd den tolkningstabell som medföljer varje sats för att bestämma vilken allel eller allelgrupp respektive primerlösningar identifierar. I många, men inte alla, Dynal AllSet + - eller CombiSet + SSP-kit förstärks varje allel eller allelgrupp av mer än en primerlösning. Det är viktigt att kontrollera att alla övriga primerlösningar, som ska vara positiva för att bära allelen eller allelgruppen, verkligen är positiva. Alleleler tilldelas genom närvaron av PCR-produkten, men PCR-produkternas relativa storlekar kan vara till nytta vid tolkningen av SSP-typningarna. Man kan använda de ungefärliga storlekarna på de specifika PCR-produkterna i syfte att skilja på en verkligt positiv förstärkning respektive: - primeroligomerartifakter (primerdimer) - överföring från intilliggande brunnar - icke-specifika förstärkningar Den tolkningstabell som medföljer varje redovisar sekvensen för de tre mest avslutande nukleotiderna, som bestämmer 3 -ändspecificiteten för såväl framåt- som bakåtprimern. För HLA klass I-produkter redovisas positionen för nukleotiden i den 2:a, 3:e eller 4:e exonen som motsvarar primernas 3 -ände. För HLA klass II AllSet + SSP-kit redovisas positionen för den kodon som motsvarar primernas 3 -ände. Om sekvensen för en ny allel som inte omfattas av tolkningstabellen finns tillgänglig kan primersekvensinformationen användas för att ta reda på den nya allelens förstärkningsmönster. Kontakta i så fall den tekniska serviceavdelningen kontaktas per e-post på adressen hla@dynalbiotech.com, eller per fax på nummer +44 151 346 1223. Tolkning med Dynal SSPTool Dynal SSPTool är en specialprogramvara som hjälper dig att tolka resultaten. Varje enskilt AllSet + - och CombiSet + SSP-kits satsspecifika tolkningstabell läggs in i programvarudatabasen. Databasen uppdateras kontinuerligt vid lansering av nya produktsatser. För hjälp med och information om inläggning av resultat och tolkning av programvaran hänvisas till hjälpfunktionen i SSPTool. Kontakta Dynal Biotechs lokala representant för att beställa ett kostnadsfritt exemplar av Dynal SSPTool (produktkod 990.80). Sid 11 av 15

FELSÖKNINGSGUIDE PROBLEM ORSAK ÅTGÄRD Ingen förstärkning (vare sig förstärkning av de interna kontrollfragmenten eller specifik förstärkning) För liten mängd DNA DNA:et innehåller PCR-inhibitorer, exempelvis proteiner, etanol (från fällningsstegen). DNA:et har extraherats från hepariniserat blod Slumpmässigt förstärkningsfel PCR-rörlock som inte är ordentligt åtskruvade leder till avdunstning och därav följande förstärkningsfel Kontrollera att volymen och koncentrationen på det DNA som tillsattes var korrekt. Mät DNA-kvaliteten. Tillämpa leverantörens DNAextraheringsmetod exakt. Prova en alternativ DNA-extraheringsmetod Extrahera DNA på nytt Använd icke-hepariniserat blod, eller prova med heparinasbehandling (se ref. 8) DNA:et har lösts i en buffert som innehåller EDTA Upprepa DNA-extraktion och lös DNA:et i sterilt vatten Kontrollera att alla lock är ordentligt åtskruvade Använd förslutningsverktyg Misstag vid gelladdning Användning av okalibrerade pipetter Kontrollera att rätt antal brunnar har laddats och att varje brunn innehåller ungefär samma mängd PCR-blandning Kalibrera alla pipetter rutinmässigt enligt tillverkarens rekommendationer Pipetteringsfel Genomför pipetteringen mer omsorgsfullt Prov-DNA, Taq-polymeras eller PCR-förblandningar har inte blandats ordentligt före användning Blanda helt kort genom virvling före användning Svaga interna Mät DNA-kvaliteten. Upprepa DNA-extraktionen med nyberedda Orent DNA kontrollfragment lösningar. Icke-specifik förstärkning (stegar eller utstrykningar) Allt svagare förstärkningssignaler med tiden Liten DNA-mängd Alltför hög bindningstemperatur. Termalcyklern är inte kalibrerad För liten mängd termostabilt DNA-polymeras Dålig kvalitet på det termostabila DNA-polymeraset Orent DNA (Vissa primerblandningar har en ökad tendens att generera ickespecifik förstärkning se fotnoterna i respektive specificitetstabell) Den etidiumbromidbaserade agarosgelfärgningslösningen är gammal Mät DNA-koncentrationen och justera den till 50 ng/µl Kalibrera termalcyklaren och kontrollera PCR-programmet. Termalcyklare som används för rutinmässig PCR-SSP ska kalibreras var sjätte månad Använd mer enzym i PCR-reaktionerna Använd Amplitaq från Perkin-Elmer Alla fragment som är större än det interna kontrollframgentet kan ignoreras Kontrollera DNA-kvaliteten. Upprepa DNA-extraktionen Frånvaro av DNA kan också leda till utstrykningar Bered ny etidiumbromidlösning för att få en bättre färgning av gelen En av UV-lamporna är trasig Kontrollera UVbelysningsutrustningen. Falskt negativa förstärkningar Falskt positiva förstärkningar Underliga förstärkningsmönster Alltför hög bindningstemperatur. Termalcyklern är inte kalibrerad Kan orsakas av kontaminering Orent DNA För låg bindningstemperatur Termalcyklerna är inte kalibrerad Fel tolkningstabell används Förstärkningsmönsttret innehåller en 'falskt positiv' Ny allel som inte omfattas av tolkningstabellen Kalibrera termalcyklaren och kontrollera PCR-programmet. Termalcyklare som används för rutinmässig PCR-SSP ska kalibreras var sjätte månad. Använd handskar och pipettspetsar med filterproppar. Använd separata områden för för- respektive efter-pcr. Omsorgsfull provhantering i alla skeden. Kontrollera med avseende på kontaminering med Dynals kontamineringskontrollprimrar (produktkod 990.05) Mät DNA-kvaliteten. Upprepa DNA-extraktionen med nyberedda lösningar. Kalibrera termalcyklaren och kontrollera PCR-programmet. Termalcyklare som används för rutinmässig PCR-SSP ska kalibreras var sjätte månad. Kontrollera att satsnumret för den produkt som används överensstämmer med den tolkningstabell som används. Kontrollera om alla specifika förstärkningar har rätt storlek, eller om en artefakt (överföring, primerdimer) kan ha misstolkats som en förstärkning Upprepa typningen. Om det nya förstärkningsmönstret är reproducerbart ska du kontakta Dynal Biotechs lokala representant för information om alleler som beskrivits under senare tid. Använd rekommenderad TBE-buffert. Kör med lägre spänning Otydliga, suddiga band Elektroforesbufferten kanske är varm Den kam som används har för breda skåror Använd tunna kammar (4 x 1 mm) Amplikonen laddas inte som den ska Avvikande styrka på den buffert som används Bufferten är inte kompatibel med PCR-amplikonen Luftbubblor i pipetten Använd samma buffert för gelen och körningsbufferten 0,5 x TBE rekommenderas Pipettera korrekt Sid 12 av 15

BIBLIOGRAFI 1) Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4. 2) Wu, D. Y., Ugozzoli, L., Pal, B. K. & Wallace, R. B. (1989). Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia. Proc Natl Acad Sci U S A 86(8), 2757-60. 3) Newton, C. R., Graham, A., Heptinstall, L. E., Powell, S. J., Summers, C., Kalsheker, N., Smith, J. C. & Markham, A. F. (1989). Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res 17(7), 2503-16. 4) Olerup, O. & Zetterquist, H. (1992). HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) in 2 hours: an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation [se kommentarer]. Tissue Antigens 39(5), 225-35. 5) Bunce, M., O'Neill, C. M., Barnardo, M. C. N. M., Krausa, P., Browning, M. J., Morris, P. J. & Welsh, K. I. (1995b). Phototyping: Comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilising sequence-specific primers (PCR- SSP). Tissue Antigens 46(5), 355-367. 6) Richmond, Y. and McKinney, W. (red.) 1993. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 7) National Committee For Clinical Laboratory Standards. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue. Tentative Guideline. NCCLS Document M29-T Villanova, PA:NCCLS, 1989. 8) Satsangi J, Jewell DP, Welsh K, Bunce M, Bell JI.Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet. 1994 Jun 11;343(8911):1509-10. 9) Bein G, Glaser R, Kirchner H. Rapid HLA-DRB1 genotyping by nested PCR amplification. Tissue Antigens. 1992 Feb;39(2):68-73 Sid 13 av 15

Garanti Endast med avseende på den första köparen garanteras att produkterna överensstämmer vad gäller kvantitet och innehåll med uppgifterna på flaskan och på externa etiketter, under den angivna livslängden. Dynal Biotechs ansvar, och köparens enda ersättning, med avseende på denna garanti begränsas till antingen utbyte, på Dynal Biotechs bekostnad, av eventuella produkter som är defekta med avseende på tillverkning, och som ska återsändas till Dynal Biotech med transporten förutbetald, eller, om Dynal Biotech så väljer, till återbetalning av inköpspriset. Anspråk med avseende på varor som skadats under transporten ska ställas till speditören. Denna garanti gäller inte för produkter som har ändrats sedan de lämnade Dynal Biotech, och inte heller för produkter som varit föremål för missbruk eller felaktig hantering. SAMTLIGA ÖVRIGA GARANTIER, UNDERFÖRSTÅDDA ELLER LAGENLIGA, EXKLUDERAS HÄRMED UTTRYCKLIGEN, INKLUSIVE MEN INTE BEGRÄNSAT TILL GARANTIER MED AVSEENDE PÅ SÄLJBARHET ELLER LÄMPLIGHET FÖR VISS ANVÄNDNING. Dynal Biotechs största ersättningsskyldighet begränsas under alla omständigheter till priset på de produkter Dynal Biotech säljer. DYNAL BIOTECH ÄR UNDER INGA OMSTÄNDIGHETER ANSVARIGA FÖR NÅGRA SPECIALSKADOR, TILLFÄLLIGA SKADOR ELLER FÖLJDSKADOR. I en del länder är det inte tillåtet att begränsa ansvarsskyldigheten, eller ansvaret för vissa transaktioner. Om så är fallet är begränsningarna ovan inte tillämpliga. Denna produkt får inte förpackas om, formuleras om eller säljas vidare i någon som helst form utan skriftligt tillstånd från Dynal Biotech Ltd., U.K. DOKUMENTETS/PRODUKTENS VARUMÄRKEN Dynal utgör ett registrerat varumärke som tillhör DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norge AllSet och AllSet + är varumärken som tillhör DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norge DynaMix är ett varumärke som tillhör DYNAL BIOTECH Ltd., Storbritannien CombiSet och CombiSet + är varumärken som tillhör DYNAL BIOTECH., Storbritannien SSPTool är ett varumärke som tillhör DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norge AmpliTaq är ett registrerat varumärke som tillhör Roche Molecular Systems, Inc., USA Electro-Fast är ett registrerat varumärke som tillhör Advanced Biotechnologies Ltd (ABgene ) GeneAmp är ett varumärke som tillhör Roche Molecular Systems, Inc., USA DOKUMENTETS/PRODUKTENS PATENT _ * Dynal SSP-produkterna säljs under licens på ZENECA Ltd. ARMS i enlighet med Europapatent 0332435 och motsvarande globala patenträttigheter. ARMS är ett varumärke som tillhör ZENECA Ltd. ** Denna produkt har optimerats för användning i PCR-processen (Polymerase Chain Reaction), som omfattas av patent som ägs av Roche Molecular Systems Inc. och F. Hoffmann-La Roche Ltd (Roche ). Ingen licens att använda PCR-processen under dessa patent övergår uttryckligen eller underförstått på köparen genom köp av denna produkt. Ytterligare information om förvärv av licenser att använda PCR-processen kan erhållas genom att kontakta, i USA, Director of Licensing vid Roche Molecular Systems,, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California, 94501, respektive utanför USA, PCR Licensing Manager, F. Hoffman-La Roche Ltd, Grenzacherstr. 124, DH-4070 Basel, Schweiz. Tillverkat av Dynal Biotech Ltd., Storbritannien Utvecklat av Dynal Biotech Ltd., Storbritannien Sid 14 av 15

KONTAKTINFORMATION Dynal Biotech Ltd., 11 Bassendale Road, Croft Business Park, Bromborough, Wirral, CH62 3QL, Storbritannien Tel.: +44 151 346 1234, Fax: +44 151 346 1223 E-post: hla@dynalbiotech.com, Internet: http://www.tissue-typing.com Dynal Biotech A.S.A DYNAL BIOTECH GmbH Box 114 Smestad, Bramfelder Chaussee 41 N-0309, Oslo, Norge 22177 Hamburg, Tyskland Tel.: +47 2206 1000 Tel.: +49 40 36 15 73-0 Fax: +47 22 50 70 15 Fax: +49 40 36 15 73-30 E-post: dynal@dynalbiotech.com E-post: info@dynal.smartnet.de Internet: http://www.dynalbiotech.com Dynal Biotech Inc. Dynal Biotech S.A. HLA Diagnostics Division Centre de Transfert de I U.T.C., 555 Andorra Glen Court 66 Avenue de Landshut Suite 5 Lafayette Hill, PA 19444, USA 60200 Compiègne, Frankrike Avgiftsfritt: +1 1866 DYNAL TT (396 2588) Tel.: +33 3 44 23 45 95 Tel.: +1 610 940 1511 Fax: +33 3 44 23 16 14 Fax: +1 610 940 3606 E-post: dynal.france@wanadoo.fr E-post: hla.us.cust.serv@dynalbiotech.com Dynal Biotech Pty PO Box 204, Carlton South, Victoria 3053, Australien Tel.: 1 800 623 453 Tel.: +61 3 9663 5777 Fax: +61 3 9663 6660 Nya Zealand, avgiftsfritt: 0800 448 246 E-post: techserv@dynal.com.au För information om Dynals distributörer runt om i världen kontaktas Dynal Biotech Ltd Copyright Dynal Biotech Ltd., Storbritannien Med ensamrätt Tryckt 12.03. Rev. 000 Sid 15 av 15