Examensarbete 15hp C- nivå, VT 2008 Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Development of method for myosin- and actin-measurements in musclefibers Rebeca Corpeno Handledare: Yvette Hedström Institutionen för nerurovetenskap, Klinisk neurofysiologi, akademiska sjukhuset, Uppsala
ABSTRACT The purpose of this study was to gain more knowledge about the deleterious effects of decreased muscle protein concentration on skeletal muscle function, by measuring the concentrations of myosin and actin in single pig muscle fibres. The pigs were earlier used in an experimental animal model to study the early stages of acute quadriplegic myopathy (AQM), a disease that is found in mechanically ventilated intensive care unit patients. Percutaneous biopsies were taken from these pigs and where now used in this study. Even though the method used was accurately tested and theoretically working, certain problems arose. These problems were unexpected and caused problems to the study. The method used to measure the concentration of myosin and actin, an ELISA, gave no logical results. The reason could not be found and because of the time limit of this project no results from the AQM-pigs were gained. The efforts to make the method work is described and discussed. KEYWORDS Protein concentration, muscleprotein, myosin heavy chain (MHC), acute quadriplegic myopathy (AQM), ELISA,
INTRODUKTION Både för människor och djur utgör fungerande muskler en viktig del av det som krävs för vår överlevnad. Vår andning kräver muskelarbete och likaså krävs friska muskler för att hämta och få i oss föda. För att fritt kunna röra oss hur vi behagar och kunna utföra frivilliga rörelser behöver vi fungerande skelettmuskler. En ringa skada på dessa musklers allra minsta beståndsdel kan dock resultera i att de inte längre kan fungerar normalt, vilket kan leda till en försämrad livskvalité då skelettmusklerna kanske inte längre kan styras med fri vilja. Bristerna kan då vara alltifrån små skador till förlamning av hela kroppen. Acute quariplegic myopathy (AQM) är en sjukdom som främst drabbar mekaniskt ventilerade intensivvårdspatienter. I dessa patienters muskelceller ses ofta en förlust av speciellt myosin. Förlusten av detta protein har en betydande negativ effekt av funktionen i musklerna och leder till muskelförtvining, muskelsvaghet och minskad muskelfiberkraft [1]. De mekanismer som ligger bakom denna kraftreducering är dock ännu inte väl förstådda. Muskelatrofi är en viktig faktor men kraftreduceringen som sker, kan inte endast förklaras med denna faktor. Varje muskel i vår kropp består av tusentals muskelfibrer (muskelceller). Varje fiber har formats genom hopsmältningen av flera mononukleära celler som kallas myoblaster [2]. En individuell muskelcell utgörs av flera cylindriska strukturer som kallas myofibriller. Myofibriller byggs i sin tur upp av upprepade enheter som benämns sarkomerer [3]. Antalet muskelceller är i stort sett desamma från födseln. Antalet förändras inte under en människas liv. All tillväxt av en muskel beror på tillväxt av muskelcellerna antingen i längd genom addition av sarkomerer eller i tjocklek genom addition av myofibriller som kan öka upp till 15 gånger [3]. När man använder en muskel ökar antalet arbetsenheter, sarkomerer, och på motsvarande sätt minskar antalet när muskeln inte används. Muskelfibrer är ungefär 10-100µm i diameter och innehåller flera kontraktila proteiner vilka bygger upp myofibrillerna som har en diameter på 1-2µm. Sarcomeren är ca 1-2µm lång, men varierar något beroende på art [2]. Sarcomeren utgörs av tunna och tjocka filament tillsammans med titin- och nebulinfilament som gradvis sträcker ut sig i Z-diskar [4].
Tunna filament består av approximativt 360 actinmonomerer medan tjocka filament består av ungefär 350 myosinmolekyler [1]. Myosin är en dominant strukturell komponent i skelettmuskler och anses vara motorn i omvandlingen från fri energi till mekaniskt arbete genom hydrolys av ATP [5]. Den karakteristiska myosinmolekylen med två huvuden (myosinfamilj II) är en hexamer som består av en dubbel uppsättning av en tung kedja (MHC) med molekylvikt 220 kd och två lätta kedjor (MLC). Dessa har en molekylvikt på 17-23kD [6]. Från de tunga kedjorna går två alphahelixar ut och i början av dessa svansar sitter de lätta kedjorna för att ge de tunga kedjorna stadga och tjocklek. Varje huvud kan fungera självständigt ifrån varandra. Myosin är både ett strukturellt och ett regulatoriskt protein och utgör ungefär 20% av totalproteinet i friska muskler [5]. Skelettmuskulaturen hos däggdjur innehåller fyra huvudsakliga isoformer av MHC. Den långsamma MHCI β och tre snabba, MHCIIa, MHCIIb och MHCIId (MHCIId anses vara likvärdiga med MyHCIIx)[6,7]. Detta leder till att det finns fyra typer av rena fiber, som endast innehåller en typ av dessa isoformer. De är de långsamma TypI (MHCI β ) och de snabba typiia (MHCIIa), typiib (MHCIIb) och typiid/x (MHCIId/x). Därefter har man upptäckt att det även finns hybrid muskelfiber som innehåller två eller flera isoformer av MHC [7]. Aktin finns i tre isoformer i kroppen, α, β, och γ. α - aktin är den isoform som finns i muskelvävnaden och den utgör ungefär 50% av myosins koncentration i muskelcellerna [3]. Aktin består av en enda polypeptidkedja, som innehåller fyra domäner i en dubbelhelix. De tunna filamenten har till uppgift att fungera som ankare till myosin arrangerade i ordnade serier av bindningsställen där myosin kan binda [3]. Aktin är huvudkomponenten som bygger upp de tunna filamenten tillsammans med tropomyosin och troponinkomplexet. Troponin bundet till aktin dämpar interaktionen mellan aktin och myosin och den avaktiveras med en höjd kalciumkoncentration [8].
Proteinerna myosin och aktin är således viktiga för musklernas funktion och verksamhet. Långa perioder av viktlöshet, oanvända muskler och även åldrande har en reducerande effekt på skelettmuskelfunktionen, vilket leder både till en minskad proteinsyntes och till förlorad muskelmassa [9]. Syftet med detta projekt var att mäta koncentrationen av myosin och aktin med en ELISA. Proteinkoncentrationerna skulle mätas i singelmuskelfibrer från grisar som tidigare ingått i en studie där man återskapade en modell för intensivvårdspatienter. Som tidigare nämnts är AQM en sjukdom som framför allt drabbar dessa patienter. Man ser ofta en förlust av framför allt myosin i muskelcellerna och förlusten av detta protein har en betydande negativ effekt på funktionen i musklerna. Syftet med grisstudien var att studera de tidiga stadierna av AQM. Sjukdomen diagnostiseras oftast vid ett sent stadium. Sjukdomens tidigare stadium är något man vet lite om och orsakerna till sjukdomen är fortfarande inte klargjorda. Användandet av neuromuscular blocking agent, en grupp mediciner som hämmar signaleringen mellan motorändplattorna och skelettmusklerna, och kortikosteroider är möjliga orsaker eftersom de används inom intensivvården. Syftet med detta projekt var således att öka förståelsen för denna typ av försämrad muskelfunktion. Myosin och aktin skulle bestämmas med hjälp av en ELISA där man utifrån en standardkurva, med kända proteinkoncentrationer, kunde beräkna muskelfibrernas myosin- respektive aktinkoncentrationer. En totalproteinbestämning gjordes också på dessa muskelceller för att kunna använda dessa värden som en referens till erhållna värden från ELISAn. Totalproteinvärdet användes således endast som en typ av kontroll då man vet att myosin är omkring 20% av detta värde i friska muskelceller [4] och att aktin då är ungefär 50% av myosins koncentration. Bestämning av totalprotein vid de låga värden som finns i singelmuskelfiber innebär mer än sällan problem. Många metoder som används idag för bestämning av låga koncentrationer av totalprotein i exempelvis serum, har olika sensitivitet för olika proteinfraktioner [10].
Följaktligen kan en metod ge precisa värden för ett protein som används vid framtagandet av standardkurvan och därefter visa annorlunda mönster vid mätning andra proteiner [10]. I denna studie användes ett kommersiellt kit för att bestämma totalprotein. MATERIAL OCH METODER Material ELISA MF20, biotinkonjugerade myosinsarkom-specifika antikroppar köptes från Development studies Hybridoma bank, The university of Iowa för att påvisa myosin i muskelfibrerna. För aktin användes biotinkonjugerade aktin-specifika antikroppar från Santa Cruz Biotechnology. Poly-HRP streptavidin från Endogen Pierce användes som sekundär antikropp. Muskelfibrer Muskelfiber från 8 inhemska grisar användes. Grisarna ingick i en studie för att efterlikna tillståndet för intensivvårdspatienter. Syftet med studien var då att studera det tidiga stadierna av AQM. 8 grisar med en medelvikt på 22,8 kg (22-24kg) användes. De sövdes intravenöst och fick därefter kontinuerlig intravenös tillförsel av lugnande sömnmedel och smärtstillande. Grisarna ventilerades med konstant flöde, en volymkontrollerad mekanisk ventilation. Efter den förberedande behandlingen fick gris 1-6 en kombination av kortikosteroider, neuromuscular blocking agent och endotoxin som inducerar sepsis. Gris 7 fick endast kortikosteroider och gris nummer 8 hölls endast med mekanisk ventilation utan att utsättas för några mediciner. Experimentet pågick under 5 dagar och grisarna fick sedan en dödlig dos av pentobarbiturat följt av arteriell blödning för att avsluta försöket. Biopsier togs från biceps femoris och från muskulus masseter (en tuggmuskel) dag 1, 3 och dag 5.
Muskelcellerna behandlades och förvarades enligt publicerad metod [11]. Kort kan det beskrivas så att muskelcellerna lades i skinninglösning och behandlades med sukros innan de frystes ned för bevaring i buntar (bundles). Skinninglösningen är till för att skada cellmembranet och för att sukrosen lättare ska nå muskelfibrerna. Sukrosen skyddar fibrerna vid frysning och motverkar kristallbildning. När muskelfibrerna därefter användes desukroserades muskelcellerna. De togs från -80 o C och lades direkt i 2,0M sukroslösning på is. Muskelcellerna flyttades sedan var trettionde minut till sukroslösningar i sjunkande koncentrationer 1,5M, 1,0M och sedan 0,5M. Därpå lades muskelbunten i skinninglösning innan den lades i en relaxlösning för att kunna ta ut singelmuskelfiber under mikroskop. Relaxlösningen är till för att få muskelcellen att relaxera och man lättare kan ta ut fibrerna ur muskelbuntarna. Singelmuskelfibrerna lades i 20µL vit ureabuffert, en buffert som används för att denaturera cellerna, och behandlades därefter för att lysera dem göra proteinet tillgängligt för antikropparna. Muskelfibrer från gris nummer 8 användes för standardkurvan. Metod Totalproteinbestämning För att mäta totalprotein från muskelfibrer användes Nanoorange protein quantification, ett kit från Molecular Probes- Invitrogen detection Technologies. Instruktioner och standardprov (bovint serum albumin, BSA) från distributören användes. Indirekt ELISA Singelmuskelfibrernas proteinkoncentration (myosin och aktin) bestämdes med indirekt ELISA. Brunnarna coatades med 50µL fiberprov. Proverna, som låg i vit ureabuffert, späddes innan 1:400 med 0,05M karbonat-bikarbonatbuffert, ph 9,0. Plattan täcktes med parafilm och inkuberades över natt i 4 o C. Efter inkuberingen avlägsnades fiberprovlösningen och 0,01M phosphate buffered saline, ph 7,4 (PBS), 1% BSA användes för blockering. 200µL blockeringsbuffert tillsattes och plattan inkuberades i fuktkammare vid rumstemperatur i 2 timmar.
Brunnarna tvättades därefter 6 gånger med tvättbuffert (0,01M PBS, ph 7,4 med 0,05% Tween 20) innan 50µL av den primära antikroppen, spädd 1:50 med 0,01M PBS, 0,1% BSA med 0,05% Tween 20, tillsattes och plattan på nytt inkuberades i fuktkammare vid rumstemperatur i 2 timmar. Efter inkuberingen avlägsnades antikroppen och plattan tvättades 6 gånger med tvättbuffert varpå 100µL av den sekundära antikroppen, en polymer of HRP (horseradish peroxidase) konjugerad till streptavidin (poly-hrp streptavidin) spädd 1:200 med 0,01M PBS, ph 7,4, 0,1% BSA med 0,05% Tween 20 tillsattes i mörker. All hantering med poly-hrpstreptavidin måste ske i mörker på grund av dess ljuskänslighet. Efter en timmes inkubering i fuktkammare vid rumstemperatur tvättades plattan på nytt 6 gånger med tvättbuffert. Därefter tillsattes 100µL substrat, tetrametylbenzidin, och även detta steg skedde i mörker då substratet också är ljuskänsligt. Plattan inkuberades 10-15 minuter varpå reaktionen stoppades med 50µL 1M H 2 SO 4. Absorbansen lästes sedan i en spektrofotometer vid 450nm. RESULTAT OCH DISKUSSION Mätning av totalprotein i muskelfiber Mätning av totalprotein visade att en viss proteinmängd fanns i muskelfiberproverna. Proteinmängderna som man kommer ner i då de mäts i muskelceller är mycket låga. Mätning av totalprotein gjordes i 100 muskelfiber, 7 av dessa visade så pass låga absorbansvärden att proteinkoncentrationen ej gick att bestämma. Standardkurvan som användes i metoden för beräkning av provernas proteinkoncentration hade alla en korrelationskoefficient på över 95%. Granskar man kurvans utseende ser man att den ser mer tvivelaktig ut ju mer koncentrationerna sjunker. Detta gör att proteinkoncentrationer som ligger så pass lågt som de gör i muskelfiberproverna (motsvarande mindre än 1µg BSA/ml) inte kan betraktas som helt pålitliga. Syftet med denna studie var dock inte att undersöka det exakta värdet av totalproteinet i muskelfibrerna utan detta värde användes endast som en kontroll.
Totalproteinmängden användes som ett referensvärde då man vet att myosin är approximalt 20% av den totala proteinmängden i muskelceller [4] varpå aktin är ungefär 50% av myosins koncentration. Mätning av myosin och aktinkoncentration i muskelfiber med ELISA Metoden kunde efter åtskilliga försök inte ge några pålitliga resultat. Resultaten som erhölls från standardkurvan visade alla mycket oregelbundna aborbansvärden och följde inte koncentrationsmönstret av de spädningar som gjordes. Alla absorbanvärden från spädningarna, med sjunkande koncentrationer, låg istället hela tiden på ungefär samma nivå (se figur 1). De resultat som kunde erhållas från muskelfiberproverna var således inte tillförlitliga och kunde heller ej beräknas utifrån en acceptabel standardkurva. Dessutom visade blanken som sattes på varje enskild ELISA-platta i dessa försök förhöjda absorbansvärden som även de låg i närheten av absorbansen på spädningarna som gjordes till standardkurvan. 0,7 ELISA 0,6 0,5 0,4 Absorbans 0,3 0,2 0,1 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 Myosin µg/ml Figur 1. Exempel på värden som erhölls från spädningar av standardmuskelfiberextrakt i sjunkande koncentrationer. Figuren visar att värderna inte följer koncentrationsmönstret. Korrelationsgradienten är här endast 42%. Kurvans utseende visar vid senare försök att hitta orsaken, inte några stora förändringar.
Försök att hitta orsaken Eftersom resultat från dessa försök av ELISA visade ungefär samma absorbansvärden på alla prov, tyder detta på att det specifika problemet förelåg hos en gemensam nämnare för dessa som ändrats sedan metoden senast fungerade korrekt. Byte av tvättbuffert Precis då studien startades tillreddes ny tvättbuffert. Denna buffert kunde därför vara en möjlig felkälla till de orimliga värderna eftersom metoden innan detta buffertbyte, fungerade korrekt. Detta var dessutom den enda variabeln som ändrats sedan dess. För att kontrollera detta tillverkades en ny tvättbuffert och ett nytt försök gjordes. Provresultaten visade dessvärre ingen förändring. Samma problem kvarstod med oregelbundna koncentrationmönster på standardens spädningar och ett förhöjt absorbansvärd på blanken. Substratet tetrametylbenzidin Nästa gemensamma parameter, som misstänktes var substratet till peroxidaset, tetrametylbenzidin (TMB). Anledningen var att vid början av detta projekt det sista användes ur en redan öppnad flaska. Det hade då inte tidigare varit några problem med denna lösning men eftersom denna flaska varit öppnad en tid, gjordes ändå ett försök med TMB från en helt oöppnad flaska. Absorbansvärderna från ELISAn visade inga förändrade resultat vid byte av TMBlösningen, vilket gjorde att även TMB kunde uteslutas som en felkälla i metoden. Spektrofotometern Flera försök gjordes för att utesluta så många varibaler som möjligt. Spektrofotometern var en av de parameterar som tidigt kunde uteslutas som en möjlig fekälla. Spektrofotometern används även för andra metoder på laboratoriet. Bland annat användes samma spektrofotomer i metoden för mätning av totalprotein. Absorbansen som mäts vid 450nm ställs in för varje mätning, därför är inställningar på fotometern heller ingen felkälla.
Primära och sekundära antikroppen Både den primära och den sekundära antikroppen var relativt nyinköpta då studien startades och hade redan innan testats för användning. De fungerade då utan några problem och vad gäller den primära antikroppen yttrade sig samma svårigheter vid användning av den myosinspecifika antikroppen som vid nyttjandet av den aktinspecifika antikroppen. Detta betydde att den primära antikroppen med stor säkerhet kunde uteslutas. Hade någon av primära antikropparna legat bakom problemen som uppstod hade metoden gett goda resultat vid utbytandet av denna parameter. Karbonat-bikarbonatbufferten Tankegångarna for sedan vidare till karbonat-bikarbonatbufferten som också misstänktes som en möjlig felkälla. Bufferten hade inte tidigare orsakat några problem, men den tillreddes i juli 2007 och detta kunde följaktligen vara en möjlig orsak till varför bufferten inte längre kunde verka på ett adekvat sätt. Ny karbonatbikarbonatbuffert gjordes därför och metoden sattes ännu en gång på prov. Bytet av bufferten visade ingen som helst förbättring av absorbansvärderna för standardkurvan. Karbonat-bikarbonatbufferten var således inte heller orsaken till de märkliga resultat som upprepade sig. Metodens svårigheter ELISA-metoden har klara svårigheter. Teoretiskt sett är detta en bra och tillförlitlig metod men det är bevisligen även mycket som måste fungera korrekt för att metoden ska kunna ge pålitliga resultat, det vill säga, det är många steg som måste gå rätt till och lösningar som måste fungera som de ska. Proteinextraktionen av muskelfibrerna kan vara ännu en orsak till problem då det inte går att kontrollera på ett riktigt sätt om extraktionen skett ordentligt eftersom man på dessa muskelceller inte vet hur stor proteinmängden bör vara. Problemet ligger då inte vid ELISA-metoden utan vid extraktionssteget för att man får för lite protein att detektera. När det gäller proteinmängderna i proven till standardkurvan, var inte extraktionen orsak till problemet, koncentrationen i den använda pool har tidigare analyserats med gelelektrofores, för att kontrollera myosin- och aktinkvot och för kontroll av fibertyp.
Detta hade även gjorts för vissa prover, så vi visste att proteinmängd fanns tillgänglig men då standardkurvan aldrig blev användbar, utfördes inte några analyser på dessa prov. En del av komplikationerna beror därför också på proven som mäts. Dessa muskelfibrer är delikata och den proteinmängd som ska detekteras oerhört liten, vilket gör att det krävs att metoden är oerhört känslig för att den överhuvudtaget ska kunna detektera proteinet och för att sedan kvantitativt kunna bestämma mängden på ett riktigt sätt. Tidigare har SDS-PAGE provats för att bestämma myosin och aktin på dessa prov. Denna metod kunde inte på ett adekvat sätt kvantitativt bestämma proteinkoncentrationen i muskelfibrerna. Det resultat som förväntades av analysen, var värden till en standardkurva där myosins och aktins kurvor stod parallella mot varandra. Kurvornas lutning skulle alltså vara lika eftersom man spädde båda proteinerna lika (1:2). Man började dock med olika koncentrationer på proteinerna (myosin 50µg/mL och aktin 25µg/mL) så att aktin hela tiden hade en koncentration som var hälften så stor som myosin. Denna standardkurva skulle därefter användas för beräkning av myosin respektive aktinkoncentrationen i muskelfiberproverna som kördes på gelen. Resultaten av analysen visade att proteinernas (myosin och aktin) standardlinjer ej är parallella vid de låga koncentrationer som krävdes. På grund av att ELISAn eller SDS-PAGEn inte fungerade korrekt var det inte heller möjligt att värdera proteinbestämningsmetoden på ett riktigt sätt. Det som kan sägas utifrån de värden som erhölls från standardkurvorna som gjordes för totalproteinbestämning är att desto lägre totalproteinkoncentrationerna blir desto osäkrare blir också resultaten. I detta projekt var detta inte ett stort problem då exakta värden av totalproteinbestämning inte krävdes, då dessa värden, som tidigare nämnts, endast skulle användas som en typ av referens.
För att kunna gå vidare med denna metod bör alla steg kontrolleras och kanske bör även alla lösningar göras om för att man ska vara säker på att allt fungerar korrekt och inga lösningar är för gamla osv. En metod bör också finnas för att kontrollera proteinextraktionen och se att den fungerar riktigt. På grund av de låga koncentrationer som mäts i muskelfibrerna bör man också veta att problemet inte ligger vid detta steg och att allt protein blir tillgängligt för detektion vid ELISAn. Kort efter jag avslutat mitt projekt lyckades man genom detta förfarande få ELISA-metoden att fungera. Orsaken till detta är dock osäker. Man tror att den kan vara blockingbufferten, PBS, då denna lösning var en av de få som jag ej bytte ut. Lösningen som jag använde mig av var gammal, men borde teoretiskt fungera bra eftersom den självfallet förvarades fryst. Metoden fungerar nu utan problem och standardkurvan ser mycket fin ut även vid de lägre koncentrationerna. Problem finns fortfarande med totalproteinbestämningen då mycket låga värden inte kan bestämmas med säkerhet. Trots att inga exakta värden krävs är det fortfarande ett problem att denna metod inte kan ge pålitliga värden. I dagsläget är detta inget som kan lösas och, som tidigare nämnts, är totalproteinbestämningsmetoder inte absolut kvantitativa och därför svåra att utforma. REFERENSER [1] Larsson L, Ochala J. Effects on preferential myosin loss on Ca 2+ activation of force generation in single skeletal muscle fibres. Experimental Physiology published online, physiology in press, February 2008. [2] Young VR. An overview of protein synthesis, degradation and the regulation of protein content in skeletal muscle. Environmental Quality and Safety Supplements 1976; vol 5:20-42 [3] Au Y. The muscle ultrastructure: a structural perspective of the sarcomere. Cellular and Molecular Life Sciences 2004; vol 61:3016-3033
[4] Schiaffino S, Reggiani C. Molecular diversity of myofibrillar proteins: gene regulation and functional significance. Physiological reviews 1996; vol 76.2:371-423 [5] Baldwin KM, Haddad F. Skeletal muscle placticity: cellular and molecular responses to altered physical activity paradigms. American Journal of Physical Medicine and Rehabilitation 2002; vol 81:40-51 [6] Schiaffino S, Reggiani C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. Brief review 1994; vol 77.2:493-501 [7] Pette D, Staron R. Myosin isoforms, muscle fibre types, and transitions. Microscopy Research and Technique 2000; vol 50:500-509 [8] Bagshaw C. Muscle contraction, second edition. Cambridge university press, 1993. [9] Adami R, Bottinelli R, Canepari M, Carlizzi C.N, D antona G, Pelligrino M.A, Rossi R, Saltin B. The effect of ageing and immobilization on structure and function of human skeletal muscle fibres. Journal of physiology 2003; vol 552.2:499-511 [10] Elin J.R, Kestner J, Nishi H.H. Four methods for determining total protein compared by using purified protein fractions from human serum. Clinical Chemistry 1985; vol 31.1:95-98 [11] Eriksson L.I, Kandala K, Kolluri R, Larsson L, Nordquist J, Norman H, Walter S, Zackrisson H. A porcine model of acute quadriplegic myopathy: a feasibility study. Acta Anaesthesiologica Scandinavica 2006; vol 10:111-113