c-kit pharmdx polyklonala kaninantikroppar detekterar specifikt c-kit-protein i CD117-antigenuttryckande celler.

c-kit pharmdx Kod K1906 25 tester för manuell användning Avsedd användning För in vitro-diagnostik. Analysen c-kit pharmdx är ett kvalitativt immunhistokemiskt (IHC) kitsystem som används för att identifiera uttryck av c-kit-protein/cd117-antigen (c-kit-protein) i normala och neoplastiska formalinfixerade, paraffininbäddade vävnader för histologisk bedömning. c-kit pharmdx polyklonala kaninantikroppar detekterar specifikt c-kit-protein i CD117-antigenuttryckande celler. c-kit pharmdx indikeras som ett hjälpmedel vid differentiell diagnos av gastrointestinala stromala tumörer (GIST). Efter diagnos av GIST kan resultat från c-kit pharmdx användas som ett hjälpmedel för att identifiera de patienter som är kvalificerade för behandling med Gleevec /Glivec (imatinibmesylat). Resultat från hematoxylin- och eosin- (H&E) färger och en panel av antikroppar kan underlätta vid den differentiella diagnosen av GIST. Tolkningen måste göras av en kvalificerad patolog, under beaktande av patientens kliniska tillstånd, lämpliga kontroller och andra diagnostiska tester. OBS: Detta test är inte avsett som enda basis för diagnos av GIST och är inte avsett som enda basis för val av Gleevec/Glivec-terapi. Resultaten för c-kit-negativa GIST-patienter, som behandlats med Gleevec/Glivec, har inte fastställts. Ett negativt resultat skulle inte nödvändigtvis utesluta diagnos av GIST och inte heller 1, 2, 3 utesluta behandling med Gleevec/Glivec Alla patienter i Novartis Gleevec/Glivec kliniska prövningar valdes ut med användning av ett undersökande Novartis kliniskt prövningsprotokoll (NCTP). Det primära polyklonala anti-c-kit-kaninantikroppsreagenset, som används i NCTP, inköptes från Dako. c-kit pharmdx primärt, polyklonalt antikroppsreagens genomgick samma framställningsmetod, rening och kvalitetskontroll som det NCTP polyklonala anti-c-kitreagenset. Sammanfattning och förklaring Introduktion Proto-onkogen c-kitet, även kallat CD117-antigen eller stamcellfaktorreceptor, är en transmembran tyrosinkinasreceptor på 145 kd av typ III. C-kit-genen kodar en transmembran tyrosinkinasreceptor som strukturellt liknar trombocythärledda tillväxtfaktorreceptorer A och B, såväl som den kolonistimulerande faktor 1-receptorn och anses spela en viktig roll vid hematopoes, spermatogenes, och melanogenes. c-kit-proteinet innehåller extracellulära domäner med 5 Ig-liknande öglor, en starkt hydrofobisk transmembrandomän och en intracellulär domän med tyrosinkinasaktivitet, delad av ett kinasinlägg i en ATP-bindande region och i en fosfotransferasdomän. Receptoraktivering åtföljs av receptordimerisering, substratfosforylering och autofosforylering, receptorinternalisering, aktivering av proteinkinaser och fosfolipaser och transkription av olika proto-onkogener. 4 C-kit tyrosinkinasreceptorns reaktionsväg har visat sig vara viktig för tumörtillväxt och progression i flera cancertyper. 5 Mutationer i c-kit-genen leder till ligandoberoende fosforylering (aktivering) av c-kit-tyrosinkinaset och anses spela en central patogen roll vid t.ex. gastrointestinala stromala tumörer. 6 Gastrointestinala mesenkymala tumörer har historiskt sett varit svåra att differentiera och diagnostisera. 2001 godkändes imatinibmesylat (Gleevec, Novartis, Basel, Schweiz) av US Food and Drug Administration (motsv. Läkemedelsverket i Sverige) för behandling av gastrointestinala stromala tumörer (GIST). Godkännandet baserades på en klinisk studie i vilken vuxna personer med GIST, som uttryckte c-kit-protein som påvisats med immunhistokemi (Novartis, kliniskt prövningsprotokoll), rekryterades och behandlades med imatinibmesylat. 7 GIST-fall beskrivs som tre morfologiska kategorier: spindelcell, epitelioida och blandade typer. Oavsett morfologin uttrycker huvuddelen av GIST c-kit-protein i en signifikant del av tumörcellerna. 8-11 Observera att ett litet antal GIST inte uttrycker c-kit-protein. Relativt få andra tumörer kan vara c-kit-proteinpositiva. Dessa innefattar metastatiskt melanom, angiosarkom, Ewings sarkom, mastocytom, seminom, och pulmonärt småcelligt karcinom. GIST är vanligen positivt för caldesmon med hög molekylvikt, ofta positivt för CD34 (60 80 %) och vanligen negativt för desmin och S100-protein. 12 Specificitet Anti-c-kit polyklonala antikroppar från kanin erhölls genom subkutan injektion av en 14-aminosyra (aa) peptid (position 963 976 hos den intracellulära C -änden i c-kit-proteinet) kopplad till tyroglobulin. Antiserum renades specifikt genom antigenbunden, aktiverad tiol-avidgel F-affinitetskromatografi. Ett litet antal mjukvävnadssarkom har också visat sig vara positiva för c-kit-protein. 6 Vissa av dessa prover (t.ex. leiomyosarkom) testades för c-kit-uttryck. Studien innefattade en jämförelse mellan c-kit pharmdx -analysen och Novartis kliniska prövningsprotokoll (NCTP) som användes för urval av patienter för behandling med Gleevec i de kliniska prövningarna som utfördes av Novartis. Två av totalt tjugoåtta prover som testades, visade positiv färgning. Resultatet var konsekvent med användning av de två protokollen. All positiv (111767-003) 305757SE_001 s. 1/14

immunfärgning avslutades efter absorption av den primära antikroppen med en syntetisk peptid (C-änden med 16 aminosyror hos c-kit-proteinet). Den primära antikroppen som används i c-kit pharmdx -analysen reagerade specifikt med c-kit-proteinet i två positivt färgade mjukvävnadssarkom. Egna studier med användning av c-kit pharmdx påvisade uttryck av c-kit-protein i flera olika normala celler. Dessa celler innefattar duktala och myoepitelceller i bröst, purkinje-cellprocesser, lamina propria-celler i tjocktarm, tubulärt epitel i njure, melanocyter och hudmyoepitelceller, interstitiella cajalceller i tunntarm samt mastceller. Den cytoplasmiska reaktiviteten i granulocyter orsakades av endogen peroxidasaktivitet och var synlig med negativt kontrollreagens. Reagenser Kod K1906 är för manuell färgning Det angivna materialet är tillräckligt för 25 tester (25 patientglas och 10 kontrollglas, inkuberade med primärt antikroppsreagens mot c-kit-protein och 25 objektglas inkuberade med motsvarande negativa kontrollreagens). Antalet tester är baserat på användning av det manuella protokollet för c-kit pharmdx med bruksfärdiga reagenser. Kitet innehåller tillräckligt med material för maximalt 10 individuella färgningskörningar. Medföljande material Kvantitet Beskrivning 1 x 4 ml c-kit pharmdx polyklonalt kanin-igg Polyklonalt antihumant c-kit-igg från kanin i en Tris-HCl-buffert, innehållande stabiliserande protein och 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 4 ml Kanin-IgG-negativt kontrollreagens Polyklonalt kanin-igg vid en högre eller samma koncentration som positiv anti-c-kit i en Tris- HCl-buffert, innehållande stabiliserande protein och 0,015 mol/l natriumazid. 2 x 5 objektglas c-kit pharmdx kontrollpreparat Varje objektglas innehåller snitt med två pelleterade, formalinfixerade, paraffininbäddade mus- (+) och humana (-) cellinjer som representerar både måttliga och inga uttrycksnivåer av c-kitprotein. IHC-färgningspoäng för cellpellets är 2+ och 0 Procedurprincip Material som behövs, men inte ingår c-kit pharmdx IHC-kitet innehåller polyklonala antikroppar och kontrollpreparat som krävs för att fullborda en IHC-färgningsprocedur för formalinfixerade och paraffininbäddade prover. Efter inkubering med de primära polyklonala antikropparna mot humant c-kit-protein, är detta kit optimerat för användning med ett bruksfärdigt visualiseringsreagens baserat på dextranteknik. Detta reagens består av både sekundära antikaninantikroppsmolekyler från get och pepparrotsperoxidasmolekyler bundna till en gemensam dextranpolymerstam, vilket sålunda eliminerar behovet av sekventiell applicering av länkantikropp och peroxidaskonjugat. Den enzymatiska omvandlingen av därefter tillsatt kromogen resulterar i att en synlig reaktionsprodukt bildas på antigenplatsen. Provet kan sedan kontrastfärgas och förses med täckglas. Resultaten tolkas med hjälp av ett ljusmikroskop. Kontrollpreparat, som innehåller två formalinfixerade, paraffininbäddade mus- och humana cellinjer med färgningsintensitetspoäng 2+ respektive 0, ingår för kvalitetskontroll av kitets reagensprestanda. c-kit pharmdx IHC-protokollet validerades med användning av följande Dako färgningsreagenser: Wash Buffer (kod S3006) Dual Endogenous Enzyme Block (kod S2003) Target Retrieval Solution (kod S1699 eller S1700) EnVision+ HRP, Anti-Rabbit (kod K4002 eller K4003) DAB+ (kod K3467 eller K3468) (111767-003) 305757SE_001 s. 2/14

OBS: För att tillförsäkra korrekta färgningsresultat bör endast dessa färgningsreagenser användas med c-kit pharmdx. Avvikelser från detta rekommenderade protokoll har inte validerats. Andra material, som krävs för att utföra c-kit pharmdx, innefattar följande: Hematoxylin, alkohol- eller vattenbaserad, t.ex. Dakos Hematoxylin (kod S3301 eller S3302) Täckglas Vattenbad, lämpligt kalibrerat och som kan hålla 95 99 C eller tryckkokare, lämpligt kalibrerad och s om kan upphettas till 125 C Destillerat eller avjoniserat vatten (vatten av reagenskvalitet) Torkugn som kan hålla 56 60 C Etanol, absolut och 95 % Ljusmikroskop (4 40x objektivförstoring) Monteringsmedium, t.ex. Dakos Faramount (kod S3025) eller Dakos Glycergel (kod C0563) eller Dakos Ultramount (kod S1964) Positiva och negativa vävnader att använda som processkontroller (se avsnittet om Kvalitetskontroll) Objektglas, Fishers SuperFrost Plus, poly-l-lysinbelagda objektglas, laddade objektglas, eller Dakos Silanized Slides (kod S3003) (se avsnittet om provberedning) Färgningskärl eller -bad Tidtagarur (som kan mäta 2 30 minuters intervall) Tvättflaska Xylen, toluen eller xylensubstitut 1 ml-pipett Fuktkammare OBS: Alla reagenser som medföljer eller finns att tillgå separat, t.ex. Dakos Wash Buffer (kod S3006), är särskilt utformade för att användas med detta test. Inga utbyten kan göras om testet skall fungera enligt specifikationen. Försiktighetsåtgärder 1. För yrkesanvändning. För in vitro-diagnostik. 2. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN 3), en kemikalie som är mycket giftig i ren form. I produktkoncentrationer kan NaN3, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten vid kassering så att inte metallazider ackumuleras i avloppet. 3. I likhet med alla produkter som kommer från biologiska källor måste korrekta hanteringsprocedurer användas för såväl prover som reagenser. 4. Andra inkuberingstider, temperaturer eller metoder än de som specificeras kan ge felaktiga resultat. 5. Byt inte ut primärantikroppar eller negativa kontrollreagenser mot primärantikroppar och negativa kontrollreagenser från andra tillverkningssatser (lotnummer finns på flaskornas etikett) eller mot reagenser från andra tillverkare. Detta kan ge felaktiga resultat. 6. Kitreagenserna är optimalt spädda för användning med de rekommenderade reagenserna. Ytterligare spädning rekommenderas ej och kan resultera i minskad antigenfärgning. Användaren måste bekräfta alla sådana förändringar. 7. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögonen och huden. 8. Oanvänd lösning skall kasseras i enlighet med lokala och statliga föreskrifter. 9. Datablad för materialsäkerhet finns tillgängliga för professionella användare på begäran. Risker och säkerhet DAB-kromogen* Innehåller: 1-5% Bifenyl-3,3,4,4 -tetrayltetraammoniumtetraklorid / risksymbol: Farligt R 40 Misstänks kunna ge cancer. R43 Kan ge allergi vid hudkontakt. R68 Möjlig risk för bestående hälsoskador. S35 Produkt och förpackning skall oskadliggöras på säkert sätt. S 36/37 Använd lämpliga skyddskläder och skyddshandskar. Som huvudregel får personer under 18 år inte arbeta med denna produkt. Användarna måste vara ordentligt utbildade i lämplig arbetsprocedur, produktens farliga egenskaper samt nödvändiga säkerhetsinstruktioner. (Enligt EU-direktivet 94/33/EC). Se databladet för materialsäkerhet för ytterligare information. (*DAB-kromogen är ett material som krävs men inte ingår i detta kit). Förvaring Förvara c-kit pharmdx vid 2 8 C. Kontrollpreparaten måste också förvaras vid 2 8 C. Använd inte satsen efter det utgångsdatum som finns tryckt på kartongens utsida. Det finns inga tydliga tecken på instabilitet för denna produkt. På grund av detta bör positiva och negativa kontroller köras samtidigt som patientprover. Användaren måste validera alla förvaringsförhållanden som avviker från de som anges i produktbladet. 13 Kvalitetsdeklaration Reagenserna i c-kit pharmdx-kitet har kvalitetskontrollerats med immunhistokemi med användning av följande förhållanden: målåtervinning i en Pascal pressure cooker (kod S2800) programmerad för 30 sekunder vid 125 C, nedkylning till 90 C, följt av EnVision+ R abbit, HRP system. (111767-003) 305757SE_001 s. 3/14

Provberedning Biopsiprover måste hanteras så att vävnaden bevaras för IHC-färgning. Standardmetoder för vävnadsbearbetning skall användas för alla prover. 14 Paraffininbäddade snitt Formalinfixerade och paraffininbäddade vävnader är lämpliga att använda. Alternativa fixativ har inte validerats och kan ge felaktiga resultat. Biopsiprover skall delas till en tjocklek på 3 eller 4 mm och fixeras under så lång tid som är lämpligt för fixativet. Vävnaderna dehydreras sedan och klargörs i en serie alkoholer och xylen, följt av infiltrering med smält paraffin. Paraffintemperaturen får inte överstiga 60 C. Korrekt fixerade och i nbäddade vävnadsblock, som uttrycker c-kit-proteinet, har obegränsad hållbarhet före snittning och montering på objektglas om de förvaras svalt (15 25 C). 14,15 Vävnadsprover skall snittas i 3 5 µm tjocka snitt. Efter snittning skall vävnaderna monteras på Fishers SuperFrost Plus, Dakos Silanized (kod S3003), laddade objektglas eller poly-l-lysinbelagda objektglas och placeras i torkställ. Objektglasställen skall slås mot en absorberande handduk för att avlägsna vatten som fastnat under paraffinet och på glaset och sedan torkas i rumstemperatur i en timme. Glasstället skall sedan placeras i en inkubator som håller 56 60 C i en timme. Allt över skottsvatten som finns kvar på objektglasen efter att de tagits ut från inkubatorn skall avlägsnas genom att objektglasen slås mot handdukar och får torka i ytterligare en timme i inkubatorn. När objektglasen tagits ut från inkubatorn skall de hållas vid rumstemperatur tills de har svalnat och paraffinet har hårdnat. För att konservera antigenicitet bör snitten som monterats på objektglas färgas inom 2 månader efter snittning när de förvaras vid rumstemperatur (20 25 C). Se Dako Handbok: Immunochemica l Staining Methods 16 eller referenserna 14 och 15 för ytterligare information om provberedning. Användning av avkalkade vävnader har inte validerats och rekommenderas inte. De preparat som krävs för c-kit-utvärdering och för att bekräfta närvaro av tumör skall framställas samtidigt. Minst 5 objektglas bör framställas, 1 objektglas för tumörnärvaro, 2 objektglas för c-kit-proteinutvärdering och 2 objektglas för backup. Reagensberedning Följande reagenser måste beredas före färgningen: Target Retrieval Solution (kod S1699) Bered en tillräcklig mängd Target Retrieval Solution (målåtervinningslösning) genom att späda Target Retrieval Solution 10x 1:10 med destillerat eller avjoniserat vatten (vatten av reagenskvalitet) för tvättstegen. Kassera Target Retrieval Solution efter användning. OBS: Vid användning av Dakos Target Retrieval Solution (kod S1700) behövs ingen spädning. Wash Buffer Solution (kod S3006) Bered en tillräcklig mängd tvättbuffert genom att späda Wash Buffer 10x, 1:10 med destillerat eller avjoniserat vatten (vatten av reagenskvalitet) för tvättstegen. Förvara oanvänd lösning vid 2 8 ºC i högst 7 dagar. Kassera bufferten om den ser grumlig ut. Substrate-Chromogen Solution (DAB+) (kod 3467 eller K3468) Denna lösning skall blandas ordentligt före användning. Eventuella fällningar som utvecklas i lösningen påverkar inte färgningskvaliteten. Bered DAB+ Substrate-Chromogen Solution genom att tillsätta 1 droppe flytande DAB+ kromogen till en ml DAB+ substratbuffert och blanda. Kassera all oanvänd lösning. Beredd DAB+ är stabil i cirka 5 dagar när den förvaras vid 2 8 C. Viktigt: Färgen på Liquid DAB+ Chromogen i flaskan kan variera från klar till ljust lavendel-brun. Detta påverkar inte produktens prestanda. Späd enligt beskrivningen ovan. Om du tillsätter för mycket Liquid DAB+ Chromogen till DAB+ Substrate Buffer kommer den positiva signalen att försämras. Monteringsmedel Icke-vattenbaserat, permanent monteringsmedel är också lämpligt, t.ex. Dako Ultramount (kod S1964). Vattenbaserat monteringsmedel såsom Dako Faramount Mounting Medium, bruksfärdigt (kod S3025) eller Dako Glycergel Mounting Medium (kod C0563) är också lämpliga. Gör Glycergel flytande genom att värma det till cirka 40 (±5) C före användning. Procedur för manuell färgning Anm. om proceduren Användaren bör läsa dessa anvisningar noggrant och bekanta sig med alla komponenter innan de används (se Försiktighetsåtgärder). Alla reagenser skall anta jämvikt vid rumstemperatur (20 25 C) före immunfärgning. Likaså skall alla inkuberingar utföras vid rumstemperatur. Låt inte vävnadssnitten torka under färgningsproceduren. Torkade vävnadssnitt kan uppvisa ökad icke-specifik färgning. Placera objektglasen i en fuktkammare för att undvika att vävnaderna torkar ut. OBS: Reagenserna och instruktionerna som medföljer detta system har utformats för att ge optimal prestanda när de används med de rekommenderade reagenserna och materialen. Ytterligare spädning av reagenserna eller ändring av inkuberingstider eller temperaturer kan ge felaktiga eller motsägelsefulla resultat. Avparaffinering och rehydrering (111767-003) 305757SE_001 s. 4/14

Innan färgningen utförs måste objektglas med vävnadspreparat avparaffineras för att avlägsna inbäddningsmedlet och rehydreras. Se till att allt paraffin avlägsnas. Resterande inbäddningsmedium kommer att resultera i ökad icke-specifik färgning. STEG 1. Placera objektglasen i ett xylenbad och inkubera i 5 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. STEG 2. Slå bort överskottsvätska och placera objektglasen i absolut etanol i 3 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. STEG 3. Slå bort överskottsvätska och placera objektglasen i 95 % etanol i 3 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. STEG 4. Slå bort överskottsvätska och placera objektglasen i vatten av reagenskvalitet i 5 (±1) minuter. STEG 5. Slå bort överskottsvätska och placera objektglasen i tvättbuffert. Börja analysen enligt beskrivningen i färgningsproceduren. Xylen- och alkohollösningar skall bytas efter 40 objektglas. Toluen eller xylensubstitut, t.ex. Histoclear, kan användas i stället för xylen. Målåtervinning Rekommenderad procedur: Vattenbad STEG 1. Fyll färgningskärl, t.ex. Coplin-burkar, med den spädda Target Retrieval Solution (se Reagensberedning). Placera färgningskärlen innehållande Target Retrieval Solution i vattenbad. Hetta upp vattenbadet och Target Retrieval Solution till 95 99 C (får ej koka). Täck kärlen med lock för at t stabilisera temperaturen och undvika avdunstning. STEG 2. Nedsänk de avparaffinerade snitten, som antagit rumstemperatur, i förvärmd Target Retrieval Solution i färgningskärlen. Återbringa vattenbadstemperaturen i jämvikt och Target Retrieval Solution tillbaka till 95 99 C. Inkubera i 20 (±1) minuter vid 95 99 C. STEG 3. Avlägsna hela kärlet med objektglas från vattenbadet. Låt objektglasen svalna i Target Retrieval Solution i 20 (±1) minuter vid rumstemperatur. STEG 4. Häll ut Target Retrieval Solution och skölj snitten i Wash Buffer (se Reagensberedning). STEG 5. För optimal prestanda skall snitten blötläggas i Wash Buffer i 5 (±1) minuter efter målåtervinning och före färgning. Målåtervinning Tryckkokare (30 sekunder vid 125 C) Det är mycket viktigt att bibehålla konsekvens i målåtervinningsprotokollet för att tillförsäkra reproducerbarhet av färgningsresultaten. Tryckkokaren som används måste kunna uppnå och hålla 125 C och varje tryckkokarkörning bör innefatta sa mma totala vätskevolym (Target Retrieval Solution och vatten i tryckkokare) såväl som samma antal preparat. Optimalt protokoll är enligt följande: STEG 1. För varje körning tillsätt en konsekvent volym vatten av reagenskvalitet till tryckkokaren (500 ml eller se tillverkarens instruktioner). STEG 2. Fyll var och en av två värmebeständiga färgningskärl i plast som kan hålla ett ställ med 24 objektglas med 250 ml beredd Target Retrieval Solution (se Reagensberedning). STEG 3. Nedsänk de avparaffinerade snitten, som antagit rumstemperatur, i Target Retrieval Solution i färgningskärlen. OBS: För konsekvens skall 48 objektglas placeras i tryckkokaren under varje körning, där de tomma objektglasen används för att fylla ställen om färre än 48 provglas skall behandlas; om 24 eller färre objektglas skall behandlas kan den andra behållaren fyllas med 250 ml vatten för att bevara Target Retrieval Solution. STEG 4. Placera de två färgningskärlen i tryckkokaren och förslut locket ordentligt. STEG 5. Ställ in tryckkokaren för att uppvärmas till 125 C; inkubera objektglasen vid 125 C i 30 se kunder. Låt tryckkokaren svalna i 30 minuter, utan att avlufta trycket före öppning. STEG 6. Före öppning av tryckkokaren måste du se till att trycket har släppts. Avlägsna färgningskärlen, häll ut Target Retrieval Solution och skölj snitten i Wash Buffer eller vatten av reagenskvalitet. STEG 7. Blötlägg snitten i Wash Buffer i 5 (±1) minuter efter målåtervinning och före färgning. OBS: Target Retrieval Solution är utformad endast för engångsbruk. Får ej återanvändas. Manuellt färgningsprotokoll STEG 1. Dual Endogenous Enzyme Block (kod S2003) Slå bort överskottsvatten. Använd en luddfri duk och torka försiktigt runt provet för att avlägsna all återstående vätska och för att hålla reagenserna inom det föreskrivna området. Tillsätt tillräckligt med Dual Endogenous Enzyme Block för att täcka provet [minst 3 droppar (100 µl)]. Inkubera i 5 (±1) minuter. Skölj varsamt med Wash Buffer från en tvättflaska (rikta inte strålen direkt på vävnaden eftersom vävnaden kan glida av objektglaset). Placera i ett bad med färsk Wash Buffer i 5 (±1) minuter. (111767-003) 305757SE_001 s. 5/14

STEG 2. Primär antikropp eller negativt kontrollreagens Placera objektglasen i en fuktkammare under inkuberingen av den primära antikroppen/negativt kontrollreagens och märkta polymeren för att undvika att vävnaderna torkar ut. Slå bort överskottsbuffert och torka av objektglasen som tidigare. Tillsätt tillräckligt med optimalt spädd primär antikropp eller negativt kontrollreagens för att täcka provet. [minst 3 droppar (100 µl)]. Inkubera 30 (±1) minuter i en fuktkammare. Skölj objektglasen som i steg 1. STEG 3. EnVision+ HRP, Anti-Rabbit (kod K4002 eller K4003) Slå bort överskottsbuffert och torka av objektglasen som tidigare. Tillsätt tillräckligt med märkt polymer för att täcka provet [minst 3 droppar (100 µl)]. Inkubera 30 (±1) minuter i en fuktkammare. Skölj objektglasen som i steg 1. STEG 4. DAB+ Substrate-Chromogen Solution (kod K3467 eller K3468) Slå bort överskottsbuffert och torka av objektglasen som tidigare. Tillsätt tillräckligt av DAB+ Substrate-Chromogen Solution för att täcka provet. [minst 3 droppar (100 µl)]. Inkubera i 10 (±1) minuter. Skölj varsamt med vatten av reagenskvalitet från en tvättflaska (rikta inte strålen direkt på vävnaden eftersom vävnaden kan glida av objektglaset). Samla avfall av DAB+ Substrate-Chromogen Solution i en behållare för riskavfall för korrekt kassering. Placera i ett bad med vatten av reagenskvalitet i 2 5 minuter. Fortsätt till kontrastfärgning och montering. Kontrastfärgning (anvisningar för hematoxylin) Färgningsreaktionens färgade slutprodukt är olöslig i alkohol och vatten. Hematoxylin, antingen alkohol- eller vattenbaserad, t.ex. Dakos Hematoxylin (kod S3301, automatisk; eller S3302, manuell), kan användas. Använd inte regressiva kontrastfärger. STEG 1. Sänk ned objektglasen i ett bad med hematoxylin. Inkubera i 2 5 minuter beroende på styrkan av det hematoxylin som används. STEG 2. Skölj varsamt i ett vattenbad av reagenskvalitet. Kontrollera att alla hematoxylinrester har försvunnit. OBS: Användning av Dakos Hematoxylin (kod S3302) rekommenderas starkt. Med en 3-minuters inkubering producerar denna kontrastfärgning en milt lila/blå slutprodukt som inte skymmer specifik immunfärgning. Stark kontrastfärgning kan maskera svagt c-kit/cd117-uttryck. STEG 3. Skölj varsamt i ett bad med vatten av reagenskvalitet i 2 5 minuter. Montering Icke-vattenbaserat, permanent monteringsmedel är också lämpligt, t.ex. Dako Ultramount (kod S1964). Vattenbaserat monteringsmedel såsom Dako Faramount Mounting Medium, bruksfärdigt (kod S3025) eller Dako Glycergel Mounting Medium (kod C0563) är också lämpliga. Gör Glycergel flytande genom att värma det till cirka 40 (±5) C före användning. OBS: Det rekommenderas att objektglasen avläses inom sex veckor efter färgningen. Viss blekning kan emellertid förekomma beroende på flera faktorer inklusive, men inte begränsat till, kontrastfärgning, monteringsmaterial och metoder samt objektglasens förvaringsförhållanden. Förvara objektglasen mörkt i rumstemperatur (20 25 C) för att minimera blekning en. Kvalitetskontroll Avvikelser från de rekommenderade procedurerna för vävnadsfixering, behandling och inbäddning i användarens laboratorium kan ge upphov till väsentliga variationer i resultaten, vilket gör det nödvändigt med regelbundna egna kontroller utöver användningen av kontrollpreparaten från Dako. I USA gäller kvalitetskontrollriktlinjerna från College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry. Se också CLIS Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline, 17 och referenserna 18 21 för ytterligare information. c-kit pharmdx kontrollpreparat (medföljer) Vart och ett av de medföljande kontrollpreparaten innehåller två pelleterade, formalinfixerade, paraffininbäddade mus- (+) och humana (-) cellinjer med färgningsintensitetspoäng 2+ och 0. Ett objektglas skall färgas i varje färgningsprocedur. Utvärderingen av cellinjerna hos kontrollpreparaten från Dako indikerar färgningskörningens giltighet. De bör inte användas som hjälp vid tolkning av patientresultat. Positiv kontrollvävnad Kontrollerna skall vara färska obduktions-/biopsi-/kirurgiprover fixerade, behandlade och inbäddade så snart som möjligt på samma sätt som patientproverna. Positiva vävnadskontroller indikerar korrekt beredd vävnad och korrekt färgningsteknik. En positiv vävnadskontroll för varje uppsättning testvillkor bör ingå i varje färgningskörning. Vävnaderna som används för positiva vävnadskontroller skall ge svag positiv färgning så att de kan detektera små förändringar i primärantikroppens sensitivitet. Kontrollpreparaten som levereras med detta system eller (111767-003) 305757SE_001 s. 6/14

prover som behandlats annorlunda än patientprover validerar bara reagensresultatet och verifierar inte vävnadsberedning. Kända positiva vävnadskontroller bör endast användas för att övervaka korrekt prestanda av bearbetade vävnader och testreagenser, INTE som hjälpmedel för att utforma en specifik diagnos av patientprover. Om positiva vävnadskomponenter inte uppvisar riktig positiv färgning bör resultat med testproverna anses som ogiltiga. Normala celltyper, som kan användas som ett svagt c-kit-positivt prov, innefattar basala epidermala melanocyter och glandulära hudmyoepitelceller, såväl som bröstepitel- och myoepitelceller. Starka interna kontroller kan vara nervceller (interstitiella cajalceller) och mastceller i tarmen. Negativ kontrollvävnad Använd en negativ kontrollvävnad (som är känd c-kit-proteinnegativ), fixerad, behandlad och inbäddad på ett sätt som är identiskt med patientproverna med varje färgningskörning för att verifiera specificiteten hos primärantikroppen och för att ge en indikation på specifik bakgrundsfärgning. Mångfalden av olika celltyper, som förekommer i de flesta vävnadssnitt, erbjuder interna, negativa kontrollställen (detta bör verifieras av användaren). Om specifik färgning inträffar i de negativa kontrollvävnaderna skall resultaten med patientprover betraktas som ogiltiga. Vävnadselement som kan användas som negativa kontroller inkluderar kardiomyocyter från hjärtat. Pankreatiska acinära celler är också c-kit-negativa, medan pankreatiskt gallgångsepitel färgar positivt. Icke-specifikt negativt kontrollreagens Använd det medföljande negativa kontrollreagenset istället för primärantikroppen med ett snitt av varje patientprov för att utvärdera icke-specifik färgning och åstadkomma en bättre tolkning av specifik färgning på antigenplatsen. Inkuberingsperioden för det negativa kontrollreagenset skall motsvara den för den primära antikroppen. Om paneler av antikroppar används på seriesnitt, kan de negativa färgningsområdena på ett objektglas tjäna som en negativ/icke-specifik bindningsbakgrundskontroll för andra antisera. Analysverifiering Före den första användningen av ett färgningssystem i en diagnostisk procedur skall användaren verifiera antikroppens specificitet genom att testa den på en serie egna vävnader med kända IHC-prestandaegenskaper som representerar kända positiva och negativa vävnader. Se kvalitetskontrollprocedurerna som tidigare beskrivits i detta avsnitt av produktbladet och kvalitetskontrollkraven enligt CAP Certification Program for Immunohistochemistry och/eller CLIS Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline. 17 Dessa kvalitetskontrollprocedurer bör upprepas för varje ny sats av antikroppar eller om analysparametrarna förändras. Gastrointestinala stromala tumörer (GIST) med kända c-kit-proteinfärgningsintensiteter och negativa vävnader är lämpliga för verifikation av analysen. Tabell 1: Syftet med daglig kvalitetskontroll Vävnad: fixerade och behandlade som patientprov Specifika antikropps- & detekteringssystem Bakgrund: icke-specifikt negativt kontrollreagens Kontrollpreparat från Dako Positiv kontroll: vävnader eller celler som innehåller målantigen som skall detekteras (kan finnas i patientvävnad). Den ideala kontrollen är svagt positivt färgad vävnad som är mest känslig för antikropps- eller antigendegradering. Negativ kontroll: vävnader eller celler som förväntas vara negativa (kan finnas i patientvävnad eller positiv kontrollvävnad). Färgningsprocedur endast för kontroller Utvärderingen av cellinjerna hos kontrollpreparaten från Dako indikerar färgningskörningens giltighet. Kontrollerar alla stegen i analysen. Validerar reagenser och procedurer som används för c-kit-proteinfärgning Detektion av icke-specifik bakgrundsfärgning. Detektion av oavsiktlig Detektion av icke-specifik korsreaktivitet mellan antikropp och bakgrundsfärgning. celler/cellulära komponenter. Patientvävnad. Detektion av specifik färgning. Detektion av icke-specifik bakgrundsfärgning. (111767-003) 305757SE_001 s. 7/14

Tolkning av färgningsproceduren Utvärdering av objektglasen skall göras av en patolog med ljusmikroskop. Alla bedömningar skall göras i provets tumörregion. För utvärdering av immuncytokemisk färgning och tolkning är ett objektiv med 10x eller 20x förstoring lämpligt. Använd intakta celler för tolkning av färgningsresultatet; nekrotiska eller degenererade celler färgas ofta icke-specifikt. 14,17 Positivt och negativt färgade cellinjer inkluderas i varje c-kit pharmdx -kit för att validera analysprestanda. Korrekt färgning av kontrollpreparaten bevisar att c-kit pharmdx -reagenserna och protokollet fungerar på rätt sätt. Ingen färgning av kontrollcellinjen HT-29 (0) och medelbrun cytoplasmisk eller paranukleär färgning i kontrollcellinjen P815 (2+) indikerar att färgningskörningen är giltig. Avvikelse från den optimala färgningsintensiteten hos den positiva kontrollcellinjen (alltför svag eller alltför stark) kan resultera i ett falskt negativt eller falskt positivt resultat och indikerar att testet måste göras om. Utvärdering av den positiva vävnadskontrollen skall utföras. Svag färgning av hudmyoepitelceller indikerar att reagenserna fungerar på rätt sätt. Om positiva vävnadskomponenter inte uppvisar positiv färgning bör alla resultat med testproverna anses som ogiltiga. Den negativa kontrollvävnaden bör undersökas efter den positiva kontrollvävnaden för att verifiera specificiteten av märkningen av antigenen genom den primära antikroppen. Frånvaron av specifik färgning i den negativa kontrollvävnaden bekräftar brist på korsreaktivitet mellan antikroppen och celler/cellulära komponenter. Om specifik färgning inträffar i den negativa kontrollvävnaden skall resultatet med patientprovet betraktas som ogiltigt. Icke-specifik färgning, om sådan förekommer, har vanligen ett diffust utseende. Sporadisk färgning av bindvävnad kan också observeras i snitt från överdrivet formalinfixerade vävnader. Använd intakta celler för tolkningen av färgningsresultat. Nekrotiska eller degenererade celler färgar ofta icke-specifikt. 18 Patientprover bör undersökas sist. Positiv färgningsintensitet bör fastställas inom ramen för all icke-specifik bakgrundsfärgning med det negativa kontrollreagenset. Tolkning av uttryck av c-kit/ CD117-protein måste göras inom ramen för tumörens allmänna morfologi och kliniska sammanhang. GIST-fall beskrivs som tre morfologiska kategorier: spindelcell (70 %), epitelioida (20 %) eller blandade typer. 22 Oavsett morfologin uttrycker huvuddelen av GIST c-kit-protein i en signifikant proportion av tumörcellerna. Homogen immunfärgning med c-kit pharmdx ses i första hand i cytoplasman, med eller utan ett golgi/paranukleärt mönster (prickmönster) och i cellmembranen, med antingen fullständig eller ofullständig perifer färgning. Vissa fall visar ett heterogent (en blandning av starkt eller svagt cytoplasmiskt och/eller membranöst) färgningsmönster. Färgning har också observerats i extracellulära utrymmena. Testresultat med c-kit pharmdx bör rapporteras som positiva eller negativa, med cytoplasmisk och membranfärgningen som den bedömningsbara strukturen (tabell 2). Positivitet för uttryck av c-kit-protein definieras som vilken som helst specifik cytoplasmisk och/eller membranfärgning i tumörcellerna Fokal positivitet eller färgning i mindre än 10 % av tumörcellerna bör tolkas med försiktighet. 23 Liksom med alla IHC-tester betyder ett negativt resultat att antigenen inte detekterades, inte att antigenen var frånvarande i de analyserade cellerna/vävnaderna. Man bör även notera att en liten andel GIST inte uttrycker c-kit-protein. Frånvaro av c-kit-proteinfärgning utesluter därför inte nödvändigtvis GIST-diagnos. Tabell 2: c-kit pharmdx färgningsresultat Rapport till behandlande läkare c-kit-proteinnegativ c-kit-proteinpositiv Definition Ingen färgning i tumörcellerna Positiv färgning definieras som all IHC-färgning av tumörcellscytoplasma och/eller membran över bakgrundsnivån. Färgningsintensitet: 1+, 2+ eller 3+ Använd om så är nödvändigt en panel av antikroppar för att underlätta identifikationen av falskt negativa reaktioner. När färgning är fokalt positiv bör ytterligare testning anses bekräfta GIST-diagnos. Genetisk testning såväl som färgningsmönstren, som specificeras i tabell 3, underlättar vid differentieringen mellan GIST och andra mesenkymala sarkom. Se Sammanfattning och förklaring och Begränsningar och prestandaegenskaper för specifik information angående immunreaktivitet. Tabell 3. Immunhistokemiskt schema för den differentiella diagnosen av spindelcelltumörer i GI-området. 5 ckit CD34 SMA Glattmuskelaktin S-100 Desmin GIST 95 % 60-70 % 30-40 % 5 % 2 % Glattmuskeltumör - 10-15 % + Sällsynt + Schwannom - Vanligen - + - Fibromatos Diskuterad* Sällsynt + - Sällsynt * De flesta, men inta alla författare, rapporterar att fibromatoser är negativa för c-kit. Beroende på inkuberingstiden och styrkan hos det använda hematoxylinet kommer kontrastfärgningen att ge en blek till mörk blåfärgning av cellkärnorna. Alltför stark kontrastfärgning kan kompromettera tolkningen av resultaten. (111767-003) 305757SE_001 s. 8/14

Begränsningar Allmänna begränsningar Immunhistokemi (IHC) är en diagnostisk process i flera steg som kräver specialutbildning vid val av lämpliga reagenser, vävnadsval, fixering, bearbetning, beredning av IHC-preparaten och tolkning av färgningsresultaten. Vävnadsfärgning är beroende av hantering och bearbetning av vävnaden före färgning. Inkorrekt fixering, frysning, upptining, tvättning, torkning, värmning, snittning eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan ge artefakter, antikroppsinfångning eller falskt negativa resultat. Inkonsekventa resultat kan bero på variationer i fixerings- och inbäddningsmetoder eller på konstitutiva oregelbundenheter inom vävnaden. Den kliniska tolkningen av positiv färgning, eller frånvaron av densamma, måste utvärderas inom ramen för den kliniska anamnesen, morfologin och andra histopatologiska kriterier. Den kliniska tolkningen av all färgning, eller frånvaro av färgning, måste kompletteras med morfologiska undersökningar och korrekta kontroller, såväl som andra diagnostiska tester. En kvalificerad patolog som är förtrogen med antikropparna, reagenserna och metoderna som används måste ta ansvar för tolkningen av det färgade preparatet. Färgning måste utföras i ett auktoriserat laboratorium under övervakning av en patolog som ansvarar för att granska de färgade objektglasen och tillförsäkra att positiva och negativa kontroller är korrekta. Denna produkt är inte avsedd för användning i flödescytometri. Prestandaegenskaper har inte fastställts för flödescytometri. Vävnader från personer infekterade med hepatit B-virus och med hepatit B-ytantigen (HBsAg) kan uppvisa ickespecifik färgning med pepparrotsperoxidas. 24 Reagenser kan uppvisa oväntade reaktioner i tidigare otestade vävnader. Sannolikheten för oväntade reaktioner även i testade vävnadsgrupper kan inte fullständigt elimineras på grund av biologisk variation av antigenuttryck i tumörer eller andra patologiska vävnader. 20 Rapportera dokumenterade oväntade reaktioner till Dakos lokala avdelning för teknisk support. Produktspecifika begränsningar En liten andel GIST uttrycker inte c-kit-protein. Frånvaro av c-kit-färgning utesluter därför inte GIST-diagnos. Falskt positiva resultat kan observeras på grund av icke-immunologisk bindning av proteiner eller substratreaktionsprodukter. De kan också orsakas av pseudoperoxidasaktivitet (erytrocyter) och endogen peroxidasaktivitet (cytokrom C). 19 För optimala och reproducerbara resultat kräver c-kit-proteinet målåtervinning när vävnaderna är rutinfixerade (neutralbuffrat formalin) och paraffininbäddade. Dako rekommenderar användning av c-kit pharmdx på en Dako Autostainer eller Autostainer Plus. Användning av c-kit pharmdx på alternativa, automatiska plattformar har inte validerats och kan ge felaktiga resultat. Färgade kontrollcellinjer bör endast användas för validering av färgningskörningen och bör inte användas för att poängsätta färgningsreaktionen i vävnadssnitt. Prover konserverade med följande rutinbehandling i neutralbuffrat formalin är lämpliga för testning med c-kit pharmdx. Vävnader, som fixerats i alternativa fixativ, har inte validerats. Prestanda Egenskaper Specificitet C-kit-antikroppreagenset har testats med avseende på reaktivitet mot cellinjer som uttrycker c-kit-protein. I Western blotting av ett lysat av den småcelliga lungkarcinomcellinjen SY, som överuttrycker c-kit mrna, markerar antikroppen ett band på 145 kd motsvarande c-kit-proteinet. Det märkta bandet är tämligen brett, från 120 till 155 kd. Ytterligare ett band på 100 kd märktes också. 25 I ytterligare studier, där en andra anti-c-kitantikropp applicerades, märktes ett 100 kd-protein på samma sätt. Denna märkning upphörde när antikroppreagenset inkuberades med den syntetiska c-kit-peptidantigenen som används för immunisering. 26 I ytterligare studier testades c-kit-antikroppsreagenset med användning av Western blotting för korsreaktivitet med proteiner som delar strukturell homolgi, såsom trombocythärledd tillväxtfaktorreceptor (PDGFRa), makrofagkolonistimulerande faktorreceptor (c-fms) och FMS-liknande tyrosinkinas 3 (FLT-3). Ingen korsreaktivitet observerades med dessa homologa proteiner. Vidare reagerade inte Dakos antikroppsreagens i Western blotting med ett lysat av adenokarcinomcellinjen HS som inte uttrycker c-kit-proteinet. 25 Jämförande undersökningar Immunfärgning med användning av c-kit pharmdx -analysen utfördes på formalinfixerad, paraffininbäddade sarkom och multivävnadsanalyser (MTA) innehållande ett urval av sarkom som innefattade positivt och negativt c-kit-protein-uttryck. Vävnaderna testades med användning av c-kit pharmdx -analysen efter användning av två rekommenderade metoder med värmeinducerad epitopåtervinning (HIER). I korthet användes som värmekällor vattenbad (95 99 C) i 20 minuter och tryckkokare ( 121 C) i 5 minuter, där båda följdes av 20 minuter s nedkylning. De återstående stegen av färgningsproceduren var identiska. Dessa analyser jämfördes med en samtidigt körd simulering av Novartis kliniskt prövningsprotokoll (NCTP) som tidigare använts för att välja ut patienter för den kliniska studien som erhållit FDA-godkännande för användningen av Gleevec/Glivec med diagnostiserade GIST-patienter. NCTP använde en 2X högre koncentration av Dako primär polyklonal antikropp mot c-kit (A4502) (samma reagens som användes i c-kit pharmdx) och ingen HIER. Resultaten från (111767-003) 305757SE_001 s. 9/14

den samtidiga jämförelsen av NCTP och c-kit pharmdx -analysen med användning av tryckkokare som värmekälla anges i tabell 4 och liknande resultat (total samstämmighet 98,7 %) sågs när ett vattenbad användes som värmekälla. Procentandel positiva och negativa samstämmigheter var liknande för de två jämförelserna. Tabell 4. 2x2 tabell med c-kit pharmdx -protokoll med testresultat med användning av tryckkokare jämfört med NCTP testresultat c-kit pharmdx, testresultat med tryckkokare TR Positiv n (%) Samstämmigt NCTP Analysresultat Negativ n (%) (111767-003) 305757SE_001 s. 10/14 Totalt Positiv 188 (60,8) 3 (0,9) 191 Negativ 1 (0,3) 117 (37,9) 118 Totalt 189 120 309 Procent positiv samstämmighet= 188/(188 +1); = 0,995 x 100 = 99,5 % (95 % exakt CI: 97,1 % - 100 %) Procent negativ samstämmighet= 117/(117+3); 0,975 x 100 = 97,5 % (95 % exakt CI: 92,9 % - 99,5 %) Total samstämmighet= (188+117)/309; 0,987 x 100 = 98,7 % (95 % exakt CI: 96,7 % - 99,7 %) En underuppsättning av dessa prover (35 fall) utgjorde vävnader från patienter som medverkade i Novartis kliniska prövning med Gleevec. Av dessa patienter behandlades 21 med Gleevec (58,3 %). När samma prover omtestades med simulerat NCTP och c-kit pharmdx befanns 20 vara positiva med alla tre procedurerna, medan 1 prov befanns vara negativt. Bland de 147 patienter som behandlades med Gleevec i Novartis Gleevec kliniska prövningen rapporterades att 54 % hade en partiell respons och 28 % hade stabil sjukdom. 7 För en underuppsättning på 259 prover, som visas i tabell 4, bestämdes testresultaten med c-kitet vid den tidpunkt då proverna infördes i MTA. Trettiofem av dessa fall rekryterades i Gleevec kliniska prövningar (n=35) och återstoden testades i samma laboratorier som deltagit i Gleevec-prövningarna. Resultat från 179 prover (totalt mindre än 259 p.g.a. provförlust eller brist på tumör i MTA) visas i tabell 5 nedan. Dessa prover visade en total samstämmighet med den ursprungliga c-kit-statusen på 94,9 % (95 % exakt Cl: 90,7 % 97,7 %). Tabell 5. 2x2 tabell med testresultat med användning av tryckkokare jämfört med ursprungliga testresultat Testresultat med tryckkokare Ursprunglig c-kit vävnadsstatus Positiv Negativ Totalt n n n (%) Positiv 136 3 139 (78 %) Negativ 6 34 40 (22 %) Totalt 142 37 179 Procent positiv samstämmighet= 136 / (136+6); = 0,957 x 100 = 95,7 % (95 % exakt CI: 91,0 % - 98,4 %) Procent negativ samstämmighet= 34/ (34+3); = 0,919 x 100 = 91,9 % (95 % exakt CI: 78,1 % - 98,3 %) Total samstämmighet=(136+34)/ (179); = 0,949 x 100 = 94,9 % (95 % exakt CI: 90,7 % - 97,7 %) Reproducerbarhet Reproducerbarhet mellan körningar (manuell färgning) Reproducerbarheten mellan körningar testades vid två laboratorier med två tekniker i varje laboratorium under 3 dagar med 5 olika prover (4 positiva, 1 negativt i varje lab). I de 30 vävnader som testades varierade färgningsintensiteten med inte mer än +/- 1 färgningsintensitetsgrad med följande undantag: vid plats 1 och 3 varierade ett objektglas (båda) med två intensitetsgrader. Detta var ett resultat av vänadsupplösning vid plats 1. Total utmärkt reproducerbarhet (100 %) noterades för positiva kontra negativa resultat. Reproducerbarhet mellan laboratorier (manuell och automatiserad färgning med Dako Autostainer) Immunhistokemisk färgning av 30 randomiserade och maskerade prover med olika uttrycksnivåer av c-kit (10 negativa och 20 positiva) testades vid tre geografiskt åtskilda laboratorier. Färsksnittade preparat skickades till alla testlaboratorier för manuell och automatiserad färgning och bedömning av en patolog. På två platser var positiv/negativ bestämning av uttryck av c-kit-protein perfekt (100 %) inom och mellan laboratorierna i både manuella och automatiska testprocedurer. Vid plats 2 befanns duplikata objektglas av två vävnader, som före studien utformats att vara negativa, egentligen vara positiva. Uppföljningsanalys avslöjade att ett litet område (ca 20 % av tumörcellerna) färgade positivt. Denna del av tumören sågs inte i proverna som testades vid de andra laboratorierna. Reproducerbarhet mellan körningar (manuell färgning) Vid var och en av undersökningsplatserna inkluderades 5 objektglas av samma positiva prov i den uppsättning av 30 prover som färgades manuellt. Färgningsintensiteten och procent tumörfärgning fastställdes. Vävnadsresultatet förblev positivt vid varje undersökningsplats och färgningsintensiteten förblev inom +/- 1 intensitetsgradvariation.

Immunreaktivitet En sammanfattning av immunreaktiviteten hos c-kit pharmdx på den rekommenderade panelen av normala vävnader visas i tabell 6. Alla vävnader var formalinfixerade och paraffininbäddade. De medföljande instruktionerna och reagenserna som rekommenderas i detta produktblad användes för att utföra testning av 30 normala vävnader på DAKO Autostainer Tabell 6: Utvärdering av normal vävnadsfärgning med c-kit pharmdx * Vävnadstyp (antal testade) Binjure (3) Benmärg (3) Bröst (3) Hjärna/cerebellum (3) Hjärna/cerebrum (3) Cervix (3) Tjocktarm (3) Matstrupe (3) Hjärta (3) Njure (3) Lever (3) Lunga (3) Mesotelceller (3) Äggstock (3) Bukspottkörtel (3) Bisköldkörtel (3) Perifer nerv (3) Hypofys (3) Prostata (3) Spottkörtel (3) Skelettmuskel (3) Hud (3) Tunntarm (3) Mjälte (3) Mage (3) Testikel (3) Tymus (3) Sköldkörtel (3) Tonsill (3) Livmoder (3) Färgningsmönster Sällsynta mastceller (2+): cytoplasma Epitelceller (3+): membran och cytoplasma Myoepitelceller: (1+): cytoplasma Purkinjecellutskott (1+): cytoplasma Submukösa mastceller (2+) och lamina propria (2+): cytoplasma Submukösa mastceller (2+): cytoplasma Tubulärt epitel (2+): cytoplasma Mastceller och makrofager (2+): cytoplasma Sällsynta stora duktepitelceller (3+): Mastceller (2+): cytoplasma Mastceller i mjukvävnad (2+): cytoplasma Mastceller (2+): cytoplasma Basala epidermala melanocyter (1+): cytoplasma Glandulära myoepitelceller (1+): cytoplasma Nervceller (1+): cytoplasma Mastceller (2+): cytoplasma Mastceller (2+): cytoplasma Mastceller i lamina propria (2+): cytoplasma *Majoriteten av de testade vävnaderna hade positiv färgning av fibroblaster i stromal vävnad (1+, fibröst) såväl som mastceller och makrofager. Endogen peroxidas-inducerad färgning av eosinofiler har observerats undantagsvis. Egna studier med användning av c-kit pharmdx påvisade uttryck av c-kit-protein i flera olika normala celler. Dessa celler innefattar duktala och myoepitelceller i bröst, purkinje-cellprocesser, lamina propria-celler i tjocktarm, tubulärt epitel i njure, melanocyter och hudmyoepitelceller, interstitiella cajalceller i tunntarm samt mastceller. Den cytoplasmiska reaktiviteten i granulocyter orsakades av endogen peroxidasaktivitet och var synlig med negativt kontrollreagens. (111767-003) 305757SE_001 s. 11/14

Felsökning Tabell 7: Felsökning Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 1. Ingen färgning av objektglasen. 2. Svag färgning av objektglas. 1a. Reagenserna har inte använts i korrekt ordning. 1b. Natriumazid i tvättbuffertbadet. 2a. Otillräckliga reagensinkubationstider 1a. Gå igenom appliceringen av reagenserna. 1b. Använd färsk, azidfri tvättbuffert. 2a. Gå igenom anvisningarna för färgningsproceduren. 3. Alltför kraftig bakgrundsfärgning av objektglas. 4. Vävnad lossnar från objektglasen. 5. Alltför stark specifik färgning 6. Svag färgning av cellinjen på kontrollpreparat 2+. 2b. Olämplig fixeringsmetod har använts. 2c. Otillräcklig målåtervinning med Target Retrieval Solution 3a. Paraffinet har inte avlägsnats fullständigt. 3b. Stärkelsetillsatser använda vid montering av objektglasen. 3c. Objektglasen har inte sköljts ordentligt. 3d. Snitten torkade under färgningsproceduren. 3e. Icke-specifik reagensbindning till vävnadssnitt. 2b. Kontrollera att patientvävnad inte överfixerats och att ett godkänt fixativ använts. 2c. Verifiera att vattenbadet eller tryckkokaren fungerar på rätt sätt och att målåtervinningsproceduren följdes. (Låga temperaturer och/eller felaktig tid orsakar svag färgning.) 3a. Använd färsk rengöringslösning och följ den procedur som beskrivs i avsnittet om avparaffinering och rehydrering. 3b. Undvik att använda några tillsatser för att få snitten att fastna på objektglasen. Många av dessa är immunreaktiva. 3c. Använd färska lösningar i buffertbad och tvättflaskor. 3d. Använd en fuktkammare för inkubationer på 30 minuter. 3e. Kontrollera att proverna är riktigt fixerade och/eller att ingen nekros förekommer. 4a. Fel slags objektglas används. 4a. Använd laddade (Fishers SuperFrost Plus) eller silaniserade objektglas, t.ex. Dakos Silanized Slides (kod S3003). 5a. Olämplig fixeringsmetod har använts. 5b. Reagensinkuberingstiderna alltför långa. 5c. Olämplig tvättlösning har använts. 5a. Se till att bara godkända fixativ och fixeringsmetoder används. 5b. Gå igenom anvisningarna för färgningsproceduren. 5c. Använd endast den tvättbuffert som rekommenderas för användning med kitet. 5d. Använd fuktkammare. 5d. Använd en fuktkammare för inkubationer på 30 minuter. 6a. Otillräcklig målåtervinning. 6a. Verifiera att målåtervinningsproceduren utfördes korrekt. 6b. Otillräckliga reagensinkubationstider 6c. Försämring av kontrollpreparat. 6b. Gå igenom anvisningarna för färgningsproceduren. 6c. Kontrollera kitets utgångsdatum och förvaringsförhållanden som finns angivna på förpackningens etikett. OBS: Se avsnittet om Felsökning i Dako Handbok: Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition 16, Atlas of Immunohistology 21 eller Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 18 Rapportera ovanlig färgning till Dakos avdelning för teknisk support. (111767-003) 305757SE_001 s. 12/14

Referenser 1. Heinrich, M., Corless, C., Duensing, A., McGreevey, L., Chen, C.J., Joseph, N., Singer, S., Griffith, D., Haley, A., Town, A., Demetri, G., Fletcher, C. and Fletcher, J. PDGFRA Activating Mutations in Gastrointestinal Stromal Tumors, Science 229: 708-710, 2003 2. Taniguchi, M., Nishida, T., Hirota, S.. Isozaki, K., Ito, T., Nomura, T., Matsuda, and Kitamura, Y. Effect of c-kit mutation on prognosis of gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res 59: 4297-300, 1999 3. Medeiros, F., Codess. C.L., Duensing, A., Homick, J.L., Oliveira, AM., Heinrich, MC., Fletcher, J.A., Fletcher, C.D. KIT-negative gastrointestinal stromal tumors: Proof of concept and therapeutic implications. Am J Surg Pathol. Jul 28(7): 889-894 2004 4. Bühring H-J, Ashman LK, Gattei V, Kniep B, Larregina A, Pinto A, et al. CR2.7 Stem-cell factor receptor (p145(c-kit)) summary report (CD117). Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, et al., editors. Leukocyte typing V. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 5 th International Workshop and Conference; 1993 Nov 3 7; Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press 1995; 1882 5. Smithey BE, Pappo AS, Hill DA. C-kit expression in pediatric tumors: a comparative immunohistochemical study. Am J Surg Pathol 2002; 26:486 6. Hornick JL and Fletcher CDM. Immunohistochemical staining for KIT (CD117) in soft tissue sarcomas is very limited in distribution. Am J Pathol 2002; 117:188. 7. Demetri GD, von Mehren M, Blanke CD, Van den Abbeele AD, Eisenberg B, Roberts PJ, Heinrich MC, Tuveson DA, Singer S, Janicek M, Fletcher JA, Silverman SG, Silberman SL, Capdeville R, Kiese B, Peng B, Dimitrijevic S, Druker BJ, Corless C, Fletcher CD, Joensuu H. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors. NEJM 2002; 347, 7:472. 8. Fletcher CDM, Berman J, Corless C, Gorstein F, Lasota J, Longley JB, Miettinen M, O Leary TJ, Remotti H, Rubin BP, Shmookler B, Sobin LH, and Weiss SW. Diagnosis of Gastrointestinal Stromal Tumors: A Consensus Approach. Human Pathology May 2002; 33:5 459 9. Dematteo RP, Heinrich MC, El-Rifai WM, Demetri G: Clinical management of gastrointestinal stromal tumors: before and after STI-571. Human Pathol 2002; 33:466. 10. Hasegawa T, Matsuno Y, Shimoda T, Hirohashi S: Gastrointestinal stromal tumor: Consistent CD117 immunostaining for diagnostic and prognostic classification based on tumor size and MIB-1 grade. Human Pathol 2002; 33:669. 11. Graadt van Roggen JF, Van Velthuysen MLF, Hogendoorn PCW. The histopathological differential diagnosis of gastrointestinal stromal tumors. J Clin Pathol 2001; 54:96. 12. Kindblom LG, Remotti HE, Aldenborg F, Meis-Kindblom JM. Gastrointestinal pacemaker cell tumor (GIPACT): gastrointestinal stromal tumors show phenotypic characteristics of the interstitial cells of Cajal. Am J of Pathol 1998; 152, 5:1259. 13. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR7163, February 28, 1992 14. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Co. 1980 15. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981 16. Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook: Immunochemical Staining Methods. 3rd Edition. Dako 2001. 17. CLIS (formerly National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS). Quality Assurance for Immunocytochemistry; Approved guideline. Villanova, PA 1999. Order code MM4-A 18. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 19. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special Report: quality control in Immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 20. Herman GE, Effont EA. The taming of Immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech Histochem 1991; 66:194 21. Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. Atlas of Immunohistotechnology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986; 16 22. Demtri GD, Benjamin R, Blanke CD, Choi H, Corless C, DeMatteo RP, Eisenberg BL, Fletcher CDM, Maki RG, Rubin BP, Van den Abbeele AD, and Margaret von Mehren. NCCN Task Force Report: Optimal Management of Patients with Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST) Expansion and Update of NCCN Clinical Practice Guideline. Journal of the National Comprehensive Cancer Network 2004, Volume 1: Supplement 1. 23. Berman J, O Leary TJ. Gastrointestinal Stromal Tumor Workshop. Human Pathology 2001; 32(6):578 24. Omata M, Liew CT, Ascavali M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemsitry. Amer J Clin Pathol 1980; 73:626 25. Tsura Y, Hiraki H, Watanabe K, Igarashi S, Shimamura K, Fukuda T, et al. Preferential localization of c-kit product in tissue mast cells, basal cells of skin, epithelial cells of breast, small cell lung carcinoma and seminoma/dysgerminoma in human: immunohistochemical study on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Virchows Arch 1994; 424:135 26. Yardern Y, Kuang W-J, Yang-Feng T, Coussens L, Munemitsu S, Dull TJ, et al. Human proto-oncogene c-kit: a new cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand. EMBO J 1987; 6:3341 (111767-003) 305757SE_001 s. 13/14

Edition 07/08 (111767-003) 305757SE_001 s. 14/14