IFM/Kemi Linköpings Universitet Augusti 2007/LGM Lägesspecifik Mutagenes av proteiner
Lägesspecifik mutagenes Introduktion In vitro lägesspecifik mutagenes är en ovärderlig teknik för att t.ex. studera samband mellan proteiners struktur och funktion eller modifiering av vektorer för kloningsändamål Under det senaste årtiondet har det kommit ett antal effektiva och pålitliga metoder för att åstadkommma lägesspecifika mutationer i DNA genom att använda syntetiska oligonukleotider. Under denna kurs ska vi använda oss av en relativt ny metod som kallas quik-change site-directed mutagenesis kit och saluförs av Stratagene. Den främsta fördelen med denna metod är att den inte kräver enkelsträngat DNA (ss- DNA) detta medför eliminering av subkloningssteg i M13 baserade bakteriofager för att erhålla enkelsträngat DNA (ss-dna). Dessutom kräver denna metod inga specialiserade vektorer eller unika restriktionssites utan man kan i princip använda vilken dubbelsträngad plasmid som helst. Denna metod bygger på att man använder sig av enzymet Pfu Turbo TM DNA polymeras II som är ett värmetåligt DNA polymeras som replikerar bägge DNA strängarna med stor noggrannhet utan att undantränga mutant oligonukleotiderna. Vid mutagenesen används en dubbelsträngad plasmid som vektor med en gen som ska modifieras. Med hjälp av två syntetiska oligonukleotid primers, vardera komplementär till en av DNA strängarna av vektorn med basbyte för den önskade mutationen så förlängs DNA strängarna under temperaturcykler (PCR) med hjälp Pfu Turbo DNA polymeras II. (Fig. 1). Förlängningen av DNA strängarna ger ett nickat DNA som efter avslutad temperaturcykel behandlas med enzymet Dpn I endonukleas. Enzymet Dpn I endonukleas är specifikt för metylerat och hemimetylerat DNA och används för att bryta ned original DNA strängen och selektera för den mutant innehållande DNA strängen. Nästan all DNA isolerad från E. Coli är metylerat och därmed tillgänglig för nedbrytning med DpnI.
Läges-specifik mutagenes Material: Dubbelsträngad plasmid (~10 ng) Mutagenes primer (forward) Mutagenes primer (reverse) Kontrollplasmid, pwhitescript (4.5 kb, 10 ng/ul) Kontroll primer (forward) Kontrollprimer (reverse) 10x Reaktionsbuffert Pfu Turbo DNA polymeras DpnI restriktions enzym dntp mix Sterilt vatten Autoklaverade PCR-rör Utförande: I ett PCR-rör tillsätts följande lösningar: Prov: 2.5 µl 10x reaktionsbuffert 1 µl (10ng) dubbelsträngad plasmid 1 µl Mutagenes primer (forward) 1 µl Mutagenes primer (Reverse) 0.5 µl dntp mix Sterilt vatten till totalvolymen 25µl Tillsätt sedan 0.5µl Pfu Turbo DNA Polymeras (2.5U/µl) Blanda genom att snabbcentrifugera 10 sekunder. Kontroll: (utförs av någon/några labgrupper utöver prov1) 2.5µl 10x reaktionsbuffert 1µl (10ng) pwhitescript (kontrollplasmid)
0.6 µl kontroll primer (forward) 0.6µl Kontroll primer (reverse) 0.5µl dntp mix Sterilt vatten till 25µl Tillsätt sedan 0.5µl Pfu Turbo DNA Polymeras (2.5U/µl) Blanda genom att snabbcentrifugera 10 sekunder. 1) Överför PCR rören till en PCR apparat och programmera in följande cykel: 95 C (30 sekunder) 55 C (1 minut) 68 C (6 minuter) Denna cykel repeteras 16 gånger OBS! Temperaturerna och tiderna är ungefärliga och beror på vilken vektor som används (Labassistenten avgör vilken temperatur som ska användas) 2) Efter avslutad PCR cykel SPARA 5µl för analys på agarosgel 3) Tillsätt 0.5µl DpnI restriktionsenzym till varje rör, blanda genom snabbcentrifugering. Inkubera rören 1 timme vid 37 C. 4) Proven är nu redo att tranformeras och återstoden av proverna fryses ned i -20 C. Lästips: Mutagenes: Gene Cloning and DNA analysis(4 th edition)sid: 236-241 Promegas Protocols and application guide sid.165-166. 171-172, 369 Stratagene Quikchange Site-Directed Mutagenesis Kit, Instruction manual
Transformation av plasmid efter läges-specifik mutagenes Material: Agarplattor med Kanamycin alternativt Ampicillin NZY + Broth (alternativt LB-medium) IPTG X-Gal Prov1 efter läges-specifik mutagenes Kontroll efter läges-specifik mutagenes Transformationskontroll, puc18 Epicurian Coli XL1-Blue supercompetent cells Utförande: 1) Tina de superkompetenta XL1-blue cellerna portionerade i 20µl:s portioner i fyra rör. 2) Till varje 20µl:s portion av superkompetenta celler tillsätts 1µl av prov1, kontroll eller transformationskontroll. 3) Blanda försiktigt med pipetspetsen och inkubera på is 30 minuter. 4) Värmechocka cellerna genom att placera rören i värmeblock 45 sekunder vid 42 C, placera sedan rören på is i 2 minuter. 5) Tillsätt 100µl av förvärmt (42 C.) NZY + Broth odlingsmedium (eller LB-medium) och inkubera transformationsreaktionen 1 timme i 37 C. 6) Sprid 100 µl av transformationsreaktionen för prov1 på agar-kanamycin plattor. OBS för kontroll och puc18 transformationskontroll behandlas agarplattor enligt följande Tillsätt 20µl 10% (w/v) X-gal och 20µl 100mM IPTG till 100µl NZY + Broth odlingsmedium (eller LB-medium) och sprid på agarplattan och låt torka 37 C 30 minuter innan transformering. 7) Dagen efter transformation (ca 16 timmar) kontrolleras transformationsgraden. Räkna antalet kolonier på de olika agarplattorna.
8) Plocka över 12 kolonier i rutmönster för fortsatt plasmidpreparation och DNA sekvensning 9) Alla agar plattor sparas i kylrummet inplastade i parafilm. Lästips: Kompetenta celler och transformering Gene Cloning sid. 88-91 Promegas, Protocols and application guide sid. 45-46, 51, 174
Preparation av plasmid och analys på agarosgelelektrofores Material: 25 ml Odlingskolvar LB-medium kanamycin (stamlösning) QIAprep spin miniprep Kit Autoklaverade eppendorfrör Sterilt Vatten 10x TBE buffert 6x Laddningsbuffert Molekylviktsstandard Agaros Utförande Preparation av plasmid För preparationen av plasmid kommer ett färdigt kit att användas (QIAprep spin miniprep Kit). Detta kit bygger på att plasmid DNA:t renas på ett filter. Dagen innan plasmidpreparationen iordningställs 3 st odlingskolvar innehållande 10ml odlingsmedium och Kanamycin. Från den numrerade LB-kan plattan tas en koloni och ympas till odlingskolv med samma numrering. OBS! VIKTIGT ATT HÅLLA ORDNING PÅ NUMRERINGEN!! Odlingskolvarna får växa Ö/N i 37 C med skak. 1) Varje grupp fyller fyra 1,5 ml eppendorfrör med övernattskulturen av E. coli med den plasmid som ni ska preparera. Alla volymer nedan är per eppendorfrör. 2) Centrifugera i bordscentrifug 2 min (13000 rpm ~17900g). ALLTID denna hastighet!3) Sug av all supernatant med pasteurpipett alternativt dekantera.
3) Resuspendera pelleten i TOTALT 250µl (62.5 µl i varje epp.rör) i buffert P1 och slå ihop de fyra rören till ett rör. 4) Tillsätt 250 µl buffert P2, blanda genom att vända röret upp och ner tills all lösning blivit blå. 5) Tillsätt 350 µl buffert N3 blanda genom att vända röret upp och ner tills all blå färg försvunnit. Kromosomalt DNA har nu fallit ut som en gråvit sörja. Plasmiden finns i den genomskinliga vätskefasen. 6) Centrifugera i bordscentrifug i 10 min (13 000 rpm, ~17900 x g) 7) Tillsätt supernatanten till en QIAprep spin column. Var noga med att märka kolonnen. 8) Centrifugera 30-60 sek (13 000 rpm, ~17900 x g) kasta bort eluatet. 9) Tvätta QIAprep spin column genom att tillsätta 750 µl buffert PE 10) Centrifugera 30-60 sek (13 000 rpm, ~17900 x g) kasta bort eluatet. 11) Centrifugera ytterligare 1 min (13 000 rpm, ~17900 x g) för att få bort all buffert. Kasta bort eluatet. 12) Montera QIAprep spin column på ett epp. Rör. 13) Tillsätt 50 µl sterilt H 2 O och centrifugera 1 min (13 000 rpm, ~17900 x g). 14) Provet är nu i eppendorfröret. Märk epp.röret noga med datum, mutant (och nr) och initialer. Ex: 050825 HCAII Tyr40Gln:1 LV Provet är nu klart för analys på agarosgel (5 µl går åt resten fryses in i -20 C). Gjutning av agarosgel: 1) I en 250 ml flaska tillsätts 1.0g agaros och 10ml 10x TBE buffert och spädes med vatten till totalvolymen 100ml.
2) Värm agarosgelen tills den är helt flytande, i ett vattenbad eller i mikrovågsugn. Låt blandningen svalna en stund (till ca 60oC) och gjut agarosgelen. Låt gelen svalna i minst 30 minuter (eller tills ni är klara att separera proverna). Elektroforetisk separation av plasmiderna: 1) Blanda 4 µl laddningsbuffert med 5µl plasmid och 11µl H 2 O 2) Blanda också 1µl molekylviktsstandard med 4 µl laddningsbuffert och 15µl vatten 3) Lägg agarosgelen i elektroforesapparaten och fyll på med 1x TBE buffert, så att det täcker gelen. 4) Applicera sakta och försiktigt proverna i provbrunnarna med en automatpipett (de ska sjunka ned i botten på brunnen). 5) Separera DNA fragmenten genom att lägga på en spänning motsvarande ca.10 V/cm. Kom i håg att DNA är negativt laddat. 6) När den blåa markören har nått ca 2/3 ner på gelen avbryts elektroforesen och DNA fragmenten infärgas med etidiumbromid. Etidiumbromid som interkalerat med DNA kan ses genom att gelen belyses med 300-360 nm ljus på en transluminator. Skydda ögonen genom att använda skyddsglasögon. 7) Fotografera av gelen och uppskatta mängden plasmid ni har erhållit Lästips: Plasmidpreparation Gene Cloning sid. 36-45 Promegas, protocols and application guide sid 74-90 Elektrofores Gene Cloning sid 68-70 Promegas, protocols and application guide sid.9-10, 84, 88-89, 107-108, 143