Receptorfarmakologi Purinerga receptorer och Trombocyter Utförd av: Johanna Nylund Hanna Svahlstedt Linnea Stenlund Yousif Saeed
Bakgrund Många läkemedel utövar sin effekt genom att de binder in till receptorer på olika cellytor dit naturliga ligander såsom neurotransmittorer, hormoner och lokalt verkande mediatorer vanligtvis binder in. Detta kommer sedan att generera eller inhibera en signalkaskad inne i cellen. En ligand kan antingen vara en agonist, som stimulerar receptorn, eller en antagonist, som saknar effekt men ockuperar receptorn så att ingen annan ligand kan binda in. Trombocyter har olika receptorer och vid aktivering av dessa kan aggregation ske. Receptorerna är purinerga och delas upp i två huvudgrupper; P2Y- och P2X-receptorer. Ämnet ADP kan aktivera dessa receptorer men olika receptorer kan ge olika intracellulära effekter vilket kommer påverka trombocyterna på olika sätt vid aggregation. I laborationen undersöks två subtyper av purinerga receptorer; P2Y12 och P2Y1. Syftet är att se vilken av dessa två receptorer som har som har störst betydelse vid aggregation av trombocyter. Metodologi För att mäta trombocyternas aggregation användes en aggregometer. En aggregometer är ett mätinstrument som kontinuerligt mäter ljustransmissionen genom preparatet. Helblod från en donator centrifugerades så att erytrocyter, leukocyter och trombocyter kunde skiljas åt (trombocyterna hamnade högst upp i röret). Den trombocytrika plasman, PRP, togs ut för användning. Efter det centrifugerades det återstående blodet igen, med
Aggregation % Basgrupp 10 högre kraft, för att få ut en plasma med mycket låg nivå av trombocyter, PPP, som användes som referensvärde. Den trombocytrika och den trombocytfattiga plasman överfördes till varsin analyskyvett, om 5 ml vardera, som sedan placerades i aggregometern för kalibrering. Aggregationen är efter kalibreringen proportionell mot ljusabsorptionen i procent. Därefter tillsattes ADP, från en spädningsserie, kumulativt till den trombocytrika plasman med slutkoncentrationsintervallerna 0,03 0,1 0,3 1 3 10 30 μm. Aggregation mättes kontinuerligt Därefter undersöktes en singeldos av ADP, den koncentration som används är den som gav ett bra utslag i den kumulativa serien dvs 3 μm. Denna koncentration gav dock ingen effekt vilket gjorde att kocentrationen 30 μm användes i ett nytt försök. Sedan undersöktes även två antagonister; Cangrelor och MRS2179. De tillsattes i olika rör med trombocytrik plasma. Slutkoncentraionerna för Cangrelor var 0,1 och 5 μm i ett jämförande test. Slutkoncentrationen för MRS2179 var 20 μm. Även ADP tillsattes till varje kyvett med den koncentration som gav bra aggregation utan antagonist, dvs 30 μm. Båda antagonisternas inverkan mättes i aggregometern. Resultat Diagram 1: Dos-responskurva 60 50 40 30 20 10 0 0,01 0,1 1 10 100 ADP Koncentration Diagram 1: Avläsning av aggregation vid olika koncentrationer ADP kumulativt tillsatt i till 5 ml PRP. EC50-värde avläses till 18 μm, men eftersom kurvan inte planar ut tillräckligt i slutet av grafen, bortkastas detta värde. Detta för att inte få ett missvisande värde.
Aggregation % Basgrupp 10 Diagram 2: Cangrelor 70 60 Aggregation % 50 40 30 20 10 0 ADP 0.1 μm 5 μm2 Diagram 2: Jämförelse mellan två olika koncentrationer av Cangrelor och ADP tillsatt. Diagram 3: MRS2179 70 60 50 40 30 ADP 20 μm 20 10 0 Diagram 3: Jämförelse mellan tillsatt ADP och MRS2179.
Diskussion ADP agerar som en agonist för trombocyternas och stimulerar till en intracellulär kaskad som leder till en aktivering av trombocyten. Detta i form av en konformationsförändring som innebär bildning av utskott, negativ laddad och klibbig yta. Dessa nya egenskaper leder till aggregation av trombocyter. En aktiverad trombocyt kan i sin tur på egen hand aktivera ytterligare trombocyter, vilket ger en aktiveringskaskad. När trombocyterna har aggregerat hamnar de längst ner i kyvetten och mer ljus kan transmisseras genom kyvetten. Ökad ljustransmission i analyskyvetten tyder alltså på ökad aggregation. Diagram 1 Utifrån Diagram 1 ses att en kumulativ tillsättning av ADP ger en ökad aggregation. För att se hur effekten av en singeldos kan skilja sig från flera succesivt adderade doser gjordes två ytterligare försök med tillsättning av ADP. Första försöket med 3 μm tillsatt ADP gav ett dåligt resultat som ej gick att tolka, trots att motsvarande dos gav resultat i den additativa tillsättningen (Diagram 1). För att försäkra att det inte skett någon skada eller försämring av trombocytproverna så valdes den högsta koncentration i spädningsserien, 30 μm, att även den prövas. Vid den additativa tillsättningen gav 30 μm 56 % aggregation. Singeldos på 30 μm gav 65 % aggreagtion. Frågan är hur dessa skillnader i effekt kan uppstå? En möjlig orsak till detta är att i den kumulativa tillsättningen uppstod det en toleransutveckling till följd av ADP koncentrationerna som redan fanns i bodprovet. På så sätt har trombocyterna hunnit nedreglera sina receptorer då 30 μm-dosen ges, vilket ger mindre effekt än om man tillsätter hela slutkoncentration i en singeldos. Denna typ av toleransutveckling skulle kunna förklaras av att i sjukdomsfall med skadade kärl som leder till en konstant frisättning av ADP, och då ingen tolerans och receptornedreglering sker, så är risken för proppbildning stor. Diagram 2 Cangrelor är en kompetativ antagonist som binder till receptorn P2Y12. Vid tillsättning av två olika koncentrationer av Cangrelor blev det ingen aggregation alls. Detta tyder på att antagonisten har högre affinitet för receptorn än agonisten ADP. Diagram 3 På grund av att PRP i slutet av laborationstillfället tog slut snabbare än beräknat så uteslöts det planerade försöket av att testa tillsättning av MRS2179 med koncentration 1 μm. För att vara säkra på att MRS2179 skulle kunna ge effekt valdes därför att testa den högre koncentrationen på 20 På grund av att PRP i slutet av laborationstillfället tog slut snabbare än beräknat så uteslöts det planerade försöket av att testa tillsättning av MRS2179 med koncentration 1 μm. För att vara säkra på att MRS2179 skulle kunna ge effekt valdes därför att testa den högre slutkoncentrationen på 20 μm.
MRS2179 är en kompetativ antagonist som binder till receptorn P2Y1. Utifrån Diagram 3 ses att en koncentration på 20 μm MRS2179 gav 35 % aggregation. Utan antagonist gav 30 μm ADP 65 % aggregation. Detta ger oss två möjliga scenarion. Det första är att MRS2179s affinitet för sin receptor inte är tillräcklig hög för att konkurera ut ADP. Det andra möjliga scenariot är att receptorn P2Y1 inte leder till en lika effektiv intracellulär kaskad med aggregation som effekt. Med detta kan vi dra slutsatsen att: antingen är receptorn P2Y1 inte är lika viktig för aggregation som receptorn P2Y12, eller att Cangrelor har högre affinitet för sin receptor än ADP, jämfört med MRS2179. Felkällor Hantering och transport av donatorblod. Temperatur, vibrationer kan påverka. Beräkningar och utförande av spädningsserierna för ADP och antagonister. Fel volymvärden på grund av pipetthantering. Kontaminering av pipetter i kontakt med PRP som kan påverka aggregationen. Spår av receptfria läkemedel i donatorblod. Fingeravtryck på kyvetter skulle kunna påverka ljuskänslighet. Källor Eva Lindström, Andreas Eriksson Receptorfarmakologi Purinerga receptorer och Trombocyter Laborationsrapport Februari 2014