Projektlaborationer VT-2016 Nedan finns korta sammanfattningar av de 16 olika projekten du kan välja bland om du väljer att göra Projektlaborationen. Bo Åkerström, Infektionsmedicin Projektlaboration, Cellbiologi, T1, Läkarlinjen Bo Åkerström och Martin Cederlund, avd. för infektionsmedicin, BMC B14 Cellcykel-reglering och antioxidationsförsvar SYFTE: Laborationen går ut på att mäta mrna- och proteinnivå av de cellcykelreglerande generna p21 och p53, och antioxidationsgenerna A1M och HO-1, i leverceller som utsätts för oxidativ stress från omgivningen. BAKGRUND: Oxidativ stress, dvs tillstånd med förhöjda mängder av oxiderande ämnen, t.ex. fria radikaler, orsakar kemiska förändringar i cellen, bl.a. på membraner och DNA. De starkt oxiderande järnatomerna i hemoglobinets heme-grupp är en av de vanligaste källorna till oxidativ stress. Skadliga mängder av heme bildas vid blödningssjukdomar och hemolytiska tillstånd. Skador från oxidativ stress aktiverar system som leder till cell-cykel arrest och reparation av skadorna. Cellerna försvarar sig också mot oxidativ stress genom att syntetisera antioxidationsproteiner. p53 och p21 är två proteiner som reglerar cell-cykel arrest, och A1M (alfa-1-mikroglobulin) och HO-1 (heme oxygenas-1) är två antioxidationsproteiner. METODER: Cellodling, PCR, SDS-PAGE och Western blotting Laborationen pågår ca 3 dagar Madeleine Durbeej-Hjalt, Muskelbiologi Muskeldystrofi och träning Muskeldystrofi är ett samlingsnamn på en grupp sjukdomar som leder till att musklerna gradvis bryts ned och ersätts med fett och bindväv. Vi studerar en allvarlig form som leder till för tidig död; kongenital (medfödd) muskeldystrofi med lamininbrist. Sjukdomen är i regel ärftlig, och det finns för närvarande ingen botande behandling trots att den bakomliggande genetiska orsaken är känd. Vi använder oss av olika musmodeller för att kartlägga sjukdomsmekanismer och utvärdera nya behandlingsmetoder. I laboratoriet har vi fått mycket positiva resultat både genom att ersätta den felaktiga genen med en korrekt (s.k. genterapi) och med farmakologisk behandling. I projektlaborationen kommer ni att undersöka om möss som till synes har botats från kongenital muskeldystrofi också skyddas mot träningsinducerade muskelskador. Djurförsök ingår i laborationen. Den pågår under 2 dagar Anna Hultgårdh, Kärlväggsbiologi.
Ateroskleros Den vänstra bilden visar insidan på ett friskt kärl och den högra visar ett kärl där ett aterosklerotiskt plack har bildats. Det finns bra och dåliga plack. Ett dåligt plack kan orsaka hjärtinfarkt och stroke, vilka är bland de vanligaste orsakerna till död och invaliditet i västvärlden idag. Vår forskargrupp studerar orsaker till att vissa plack blir dåliga. Under projektlaborationen får studenterna ta fram mikroskopiska preparat på friska kärl och på kärl med plack från mus. Med hjälp av immunohistologiska tekniker får de sedan identifiera specifika strukturer i placken. Hur kan de olika strukturerna påverka utvecklingen av bra och dåliga plack? Laborationen utförs under 2 dagar Tomas Leanderson, Immunologi Analys av immunsystemets celler Syfte Övergripande målsättningen är att få inblick i metoder som används i immunologisk och cellbiologisk forskning. Genomförande Vi använder lymfoida organ från laboratoriemus. Med olika flourescensmetoder kommer vi att mäta antal och organisation av immunsystemets olika celltyper i lösning såväl som i vävnad. Laborationen utförs under 2 dagar Edgar Pera, Stamcellscentrum We will offer a research project, in which the mouse is introduced as a genetic model to study the role of Vitamin A metabolism during pancreas development with high relevance to type-1 diabetes. The 5-day lab rotation offers hands-on experience in molecular biology, embryological and histological methods. The students will
apply plasmid DNA restriction digest, immunofluorescence analysis, and hematoxylin & eosin staining. Jenny J Persson, Exakt projektplan meddelas senare Projektet kommer att handla om bakterieinfektioner. I försöken studeras makrofager, som är viktiga celler i det medfödda försvaret mot bakterier. Dessa celler odlas och infekteras i cellkultur. Makrofagernas förmåga att reagera på bakteriemutanter studeras med hjälp av olika analysmetoder. Laborationen utförs under ca 2,5 dagar Karin Stenkula, Glukostransport och proteintrafficking I laborationen används cellbiologiska tekniker för att analysera primära fettceller från isolerade från fettväv (isolerade från Sprauge-Dawley råtta). Celler kommer sedan transfekteras med plasmid för att uttrycka GLUT4-GFP. Dag 2 kommer ägnas åt analys med total internal reflection flourescence (TIRF) mikroskopi. Cellerna kommer monteras i kammare och de dynamiska förflyttningarna av GLUT4 innehållande vesikler (GSV) kommer följas över tid (ca 2 min time-lapse). Genom att jämföra GLUT4 dynamik i basala och insulin stimulerade celler illustreras förflyttning av GLUT4 från intracellulära delar till plasma membranet där GLUT4 diffunderar ut i plasma membranet och därmed kan facilitera glukostransport från blodet in i cellen. Laborationen illustrerar en högteknologisk mikroskopimetod för att studera metabola processer i levande celler, där man kan studera molekylära mekanismer på subcellulär nivå. Teorin kring detta, förutom själva förfarandet vid laborationen, kretsar kring signaltransduktion (insulin->insulin receptor->intracellulär signalering->glut4 translokering->glukosupptag). Man kan även beröra diabetes, insulinresistens, betydelse av fettväv för metabol kontroll. Laborationen pågår under ca 2 dagar. Lena M Svensson, Immunologi Leukocyte Migration Lab (Lena M Svensson) Cell migration is a universal process central to tissue formation during embryonic development, wound healing and coordination of immune and inflammatory responses. For a robust and functional immune system, immune cells need to acquire the capacity to migrate in response to environmental cues such as infection or tissue damage. For example, migration of naïve T lymphocytes into lymphoid organs, where they may encounter cognate antigen for the first time, is essential for their subsequent activation, differentiation and elaboration of effector functions. On the other hand, if migratory responses are compromised or over-exuberant, this could lead to failure to resolve infections on one hand, or autoimmune disease on the other. Aim of the project: Testing patient samples if they have a genetic disease called Leukocyte Adhesion Deficiency III (LADIII). Intergrins play a crucial role in cell adhesion and
migration and therefor of great importance to be regulated, which is highlighted in this inherited syndrome known as LADIII (Svensson Nature Medicine 2009). These patients express normal amount of integrins, but they fail to be able to signal. Do to this defect in signalling the patients immune cells are not able to migrate and therefore the patients have an impaired immune defence and will die within months, if not receive a bone marrow transfection. The students will analyse immune cells of 3 patients to determine if these have the disease or not and compare that to healthy subjects. This involves investigating the ability of lymphocytes to migrate and their expression pattern of specific surface molecules (Integrins). The methodology includes cell culture, cell staining and analysis with Flow cytometry and time-lapse microscopy. Laborationen pågår under 2 dagar Knut Kotarsky, Immunologi Isolation, characterization and activation of T cells. Mucosal Immunology group. Importance of retinoic acid signaling during priming of CD8αβ T cells for the early expansion of these cells. Labhandledare Knut Kotarsky, Immunologi BMC D14 Följdsjukdomar orsakade av Vitamin A brist är fortfarande väldigt vanliga i stora delar av Afrika och Asien, men finns även i Sverige i samband med leverfunktionsstörningar, tarmsjukdomar som minskar upptaget av A vitamin och bristfälligt näringsupptag av Vitamin A. Vitamin A brist i människor resulterar i sämre kontroll av virusinfektioner, med svårare komplikationer och ökad dödlighet som följd. Även i djurmodeller har detta bekräftats. Ökad mängd av vitamin A under virusinfektioner hjälper i viss mån till att förkorta och förbättra sjukdomsförloppet. De molekylära/ cellulära orsakarna är inte helt klarlagda ännu. CD4 T hjälparceller har studerats av några forskargrupper. Vi håller på att kartlägga hur retinolsyra (som bildas av Vitamin A) påverkar cytotoxiska CD8 T celler. Dessa celler är ansvariga för att avdöda virusinfekterade celler och cancerceller. Våra nuvarande resultat visar att cytotoxiska CD8 T celler behöver retinolsyra (RA) medan de utbildas av dendritiska celler i våra lymfkörtlar. CD8 celler som bildas utan tillgång till retinolsyra uttrycker mindre av de molekyler som behövs för att utföra deras slutgiltiga funktion: avdöda virus-infekterade celler. Då vi mätte deras cytotoxiska respons, avslöjades det att de avdödar målceller sämre än kontrollcellerna. Vi har också sett att CD8 T celler som saknar RA-signalering expanderar mer efter antigenstimulering. I denna laboration kommer vi att isolera CD8 T celler från mjälte och lymfnoder från kontrollmöss och möss där CD8 T celler har en blockering i retinolsyra signaleringen. T celler kommer att aktiveras in vitro och odlas i cellkultur. Sedan tas prover av kultursupernatanten som så småningom kommer att analyseras av förekomsten av cytokiner (IL-2 och INFgamma). Cellerna kommer att färgas med antikroppar och analyseras med hjälp av flödescytometri. Planerad tid i labbet: ca 3 labdagar + 3 möten (introduction, data-analys för FACS och cytokiner, sammanfattande möte).
I laborationen används lymfoida organ isolerade från möss. Marcus Svensson Frej, Eosinofilers biologi Lokalisering av eosinofiler i tarmvävnad och lymfoida organ under homeostas och inflammation Bakgrund: Eosinofiler är en relativt ovanlig celltyp i det medfödda immunförsvaret; eosinofiler utgör under homeostas ca 1-3% av immunceller i blodet. Eosinofiler lokaliserar också till olika vävnader, inklusive tarmens slemhinna, under homeostas. Under vissa immunresponser och inflammatoriska processer sker en anrikning av eosinofiler i den drabbade vävnaden. Historiskt sett förknippas eosinofiler ofta med infektioner med multicellulära parasiter, men eosinofilanrikning sker också under andra typer av inflammatoriska processer, t ex kroniska inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD).Vår forskning syftar till att försöka klarlägga eosinofilers funktion såväl under inflammation som under homeostas, med ett speciellt fokus på eosinofiler i tarmens slemhinna och dess dränerande lymfkörtlar, de mesenteriska lymfkörtlarna (MLN). Vi har bl a visat att eosinofiler, utöver att anrikas i inflammerad tarmvävnad, också kan detekteras i de mesenteriska lymfkörtlarna under parasitinfektion. Eftersom lymfkörtlarna är det organ där adaptiva immunresponser startas är vår hypotes att eosinofiler kan delta i regleringen av de adaptiva immunreaktionerna. Projektlabben: Frågeställning:I projektlabben kommer vi att undersöka var eosinofiler lokaliserar inom de organ där de anrikas (tarm och MLN). Vi kommer att jämföra tarm och lymfkörtelvävnad från parasitinfekterade möss med motsvarande vävnad från oinfekterade kontrollmöss, och bestämma var eosinofiler lokaliserar inom vävnaden i förhållande till andra immunceller i dessa vävnader (CD11b+ celler för tarmen; CD4+ T celler och CD19+ B celler för lymfkörteln). Metod:Tekniken vi ska använda är immunofluorescensmikroskopi. Här använder vi specifika antikroppar som binder till ytreceptorer unika för olika celltyper (CD4, CD19, CD11b, SiglecF för eosinofiler). Antikropparna inkuberas med tunna vävnadssnitt från den aktuella vävnaden, och kan på så sätt märka in de celler vi är intresserade av. Eftersom antikropparna är konjugerade till fluoroscerande antikroppar kan de sedan detekteras med ett fluorescensmikroskop. Laborationen pågår under två dagar Udo Häcker, Utvecklingsbiologi i invertebrater Reglering av intestinala stamceller i fruktflugan Drosophila.
I detta projekt kommer du att arbeta med flugor som bär en mutation i dystroglycan (Dg) genen, som kodar för en extracellulär matrix receptor. Dystroglycan är en del av dystrofin - associerat protein komplex (DAPC ), som krävs för muskelcellernas integritet och neuronal utveckling hos ryggradsdjur. Mutationer i många av de DAPC gener är associerade med muskeldystrofi och ett brett spektrum av avvikelser i hjärnans utveckling. Dessutom spelar dystroglycan en viktig roll i epitelceller och i förmågan av epiteliala tumörer att metastasera. I vårt labb använder vi Drosophila modellsystemet för att undersöka vilken roll dystroglycan har i regleringen av epiteliala stamceller, särskilt stamceller som finns i flugans tarm. Dessa stamceller kan visualiseras med hjälp av reporter transgener som har integrerats i flygans genom. Du kommer att använda dig av två olika transgena flygstammar : " Delta - lacz " flugor som uttrycker β - galaktosidas i stamceller och " escargot > GFP " flugor som uttrycker GFP i stamceller och enteroblaster. Dina arbetsuppgifter kommer att vara att a) isolera genomisk DNA från Dg mutanta flugor och kartlägga den molekylära defekten i Dg allelen med hjälp av PCR och agarosgelelektrofores, b) Utför en Dg-färgning för att lokalisera Dg i tarmen, c) Utför en β - galaktosidas färgning på Delta - lacz - uttryckande tarmar för att visualisera stamceller och d) Utsätta flugor som innehåller en Delta > lacz eller esg > GFP reporter till cell stress med hjälp av DSS (Dextran sulfate sodium), dissekera deras tarm och analysera effekten på stamceller och enteroblaster. Laborationen pågår sammantaget under 3 heldagar Stefan Baumgartner, Utvecklingsbiologi i invertebrater Sedan 20 år tillbaka har man kunnat läsa i läroböcker att den första bevisade gradienten i embryot hos bananflugan Drosophila uppstår genom att Bicoid-proteinet syntetiseras vid den främre polen, för att därefter diffundera till den bakre delen av det preblastodermala ägget. Denna dogm av en Nobelpristagare vederlags nu av vårt labb i 2009. Den morfogenetiska gradienten bildas helt enkelt av att det är bicoid-mrna som föreligger som gradient. En viktig fråga nu är naturligtvis hur denna mrna-gradient i sig själv uppkommer utifrån det bicoid-mrna som är lokaliserat till den anteriora polen i det obefruktade ägget. Vi föreslår en modell som inbegriper att bicoid-mrna frigör sig från den anteriora polen efter befruktningen och transporteras, med hjälp av Staufen-proteinet och kända proteinmotorer som dynein och kinesin, längs ett mikrotubuli-nätverk i ägget. Ni kommer isolera genomisk DNA och och använda DNA för att utföra ett PCR experiment samt in situ hybdrisering för att upptäcka uttrycksmönstret av bicoid genen. Laborationen pågår sammantaget under 3 heldagar Eva Degerman/Eva Ohlson, Signaltransduktion Studier av insulinsignalering i fettväv med hjälp av westernblot analysmetodutveckling Bakgrund. Insulinstimulering av fettceller leder via olika signaleringsvägar till ökat glukosupptag och upplagring av fett i form av triglycerider. Dessutom leder
insulinstimulering till hämning av lipolys. Oftast använder man sig av isolerade fettceller då man studerar insulineffekterna. I vissa fall är det av betydelse att kunna simulera vävnadsbitar, framförallt då man är intresserad av extracellulärmatrix betydelse för signaltransduktionen. Vid isolering av celler tar man ju ut cellerna från sin normala omgivning vilket säkert påverkar signaleringen. Dock är det av olika anledningar svårt att få celler i vävnadsbitar att svara på hormoner. Mål. Att delta i forskargruppens initiala försök att sätta upp metod för att studera cellsignalering i vävnadsbitar. Metod. Fettväv från råtta klipps i mindre bitar och stimuleras med och utan insulin i inkubationskärl. Efter stimulering homogeniseras vävnaden i buffert med proteas och fosfatashämmare. För analys av insulinsignaleringssvar undersöks bl.a fosforyleringsgraden av PKB, ett nyckelenzym i insulinsignaleringskedjan. Metoden är SDS-PAGE följt av western blotting där man i slutsteget med hjälp av antikroppar kan undersöka specifika proteiner och fosfoproteiner. Laborationen pågår under ca 2,5 heldagar Maria Thereza Perez, Oftalmologi Energikris vid näthinnesjukdomar Den tunna näthinnan (eller retinan) i bakre delen av ögat klarar den enastående uppgiften att skapa en bild som innehåller information om bl.a. form, färg och rörelse genom att omvandla ljus till elektriska och kemiska signaler. Kraftig eller bestående instabilitet i t.ex. blodförsörjning till näthinnan eller annan sjukdom kan leda till näthinnecelldöd. Till skillnad från näthinnor hos många lägre ryggradsdjur saknar den mänskliga näthinnan förmågan att regenerera. Detta medför att de ljuskänsliga syncellerna (d.v.s. fotoreceptorerna) eller gangliecellerna går förlorade vid en rad sjukdomar som vid glaukom (grönstarr), diabetes, Retinitis Pigmentosa (RP), näthinneavlossning, och åldersrelaterade makuladegeneration (gula fläcken-sjukan). Näthinnecelldöd leder till synnedsättning och eventuellt blindhet och vid RP, som orsakas av mutationerna i fotoreceptorspecifika gener och drabbar ~1 på 3500 personer, kan nedsättning i vissa fall vara märkbar redan vid mycket tidig ålder. Fotoreceptorernas metabola krav är synnerligen höga, eftersom de måste anpassa sig till ständiga förändringar i ljusnivåer från mörker till ljus. Överlevnaden av fotoreceptorer bygger således under fysiologiska förhållanden på tillgång till (och adekvat) utnyttjandet av energisubstrat. Under patologiska tillstånd, är fotoreceptorernas överlevnad även beroende av deras förmåga att utlösa, eller åtminstone reagera på, kroppsegna skyddande mekanismer. Vi har nyligen visat att även om molekyler med neuroprotektiva egenskaper produceras mycket tidigt i alla sjukdomstillstånd som påverkar fotoreceptorer, kan dessa celler inte alltid utnyttja dem. Detta kan bero på att kvarvarande fotoreceptorer försöker upprätthålla sin normala signalering, åtminstone initialt, trots en pågående degeneration. Det i sin tur leder sannolikt till en ännu större påfrestning och större energiförbrukning, vilket kan eventuellt bidra till att påskynda cellernas död, åtminstone i vissa fall. En energikris kan inträffa även i diabetes när blodsockernivå plötsligt är normaliserade efter många år av hyperglykemi och en försämring av retinopati har observerats hos vissa patienter efter insättande av glykemisk kontroll. Syftet med studierna är att testa substanser som minskar den funktionella belastningen i näthinnan under kritiska perioder (i början vid RP och under
normalisering av glykemiska nivåer i diabetes). Dina arbetsuppgifter kommer att vara: 1) att lokalisera (med hjälp av immunohistokemi) markörer för mitokondriell dysfunktion i näthinnor från normala möss och möss med RP; 2) att dissekera näthinnor; 3) att dissociera retinala celler för odling. Laborationen pågår under ca 2,5 heldagar Dan Holmberg, Autoimmunitet, Sektionen för Immunologi Study the inflammation of the endocrine pancreas during diabetes. Background The pancreas is the site of insulin production. Insulin is produced by β- cells within the endocrine pancreas (in islets of Langerhans), and released to the blood circulation. Insulin is required to control blood-glucose homeostasis and without sufficient insulin production, we will become diabetic. In our research group, we study inflammation of the pancreas during autoimmune diabetes. For this purpose we use an animal model of the human autoimmune disease type-1-diabetes. The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops inflammation of the endocrine pancreas. The inflammation of the endocrine pancreas is called insulitis. The recruitment of auto-reactive leukocytes (mainly T-cells) causes destruction of the insulin producing cells within the islets of Langerhans, and with increasing age, NOD mice will become diabetic. The diabetes incidence of NOD mice is 70-80% for females and 20-30% for male mice. Aim To understand the cellular and molecular details of the autoimmune process of diabetes in the NOD pancreas. We aim to follow the progression of insulitis over time. Method We isolate pancreases from NOD mice at different ages and analyze the progression of insulitis. The tissue is processed for immunohistochemistry by sectioning thin slices of the pancreas tissue and staining these sections for several markers inflammation as well as remaining pancreas function. Laboartionen pågår under ca 2 heldagar Jitka Petrlova, medfödd immunitet, Avd för Infektionsmedicin Structural and functional studies of host defense molecules Aims To investigate structural and functional properties of heparin cofactor. Background Host defense peptides (HDPs) play important role in a first line of defense agents invading microorganisms in blood and at the epithelial surfaces. Recent studies have shown that cationic and amphipathic HDPs of innate immune system are multifunctional and the effects are anti-microbial, anti-inflammatory, immune modulating, chemotaxis and angiogenesis. Our research on novel aspects of the innate immune response activated during infection and wounding, has demonstrated that proteolytic cascades involving the complement and coagulation systems generate several novel bioactive HDP with antimicrobial and immunomodulatory activities. The serine proteinase inhibitors (serpins) have evolved into a family of structurally related molecules with diverse functions in human biology. Heparin
cofactor II (HCII), which is present in human blood, inhibits proteases of the coagulation cascade. We have shown that proteolytically activated HCII forms are detected during wounding, and in association with bacteria. Protease-induced uncovering of cryptic epitopes in HCII transforms the molecule into a host defense factor, representing a previously unknown regulatory mechanism in HCII biology and innate immunity. Specific goals: This project will be focused on a production and purification of recombinant HCII by bacterial system (E.coli). The recombinant proteins will be tested for anti-microbial and anti-endotoxin activity by various assays, methods and cell model systems. Significance As presented in this plan, our studies on new host defense systems such as HCII and apoe isoforms, along with definition of actions and various biological roles in vivo, are of high medical and physiological relevance. The findings are instrumental for our understaing of the biological roles of host defense molecules, and important for the development of novel preventive measures for infections. If interested in this project, contact: Jitka Petrlova (jitka.petrlova@med.lu.se) Laborationen pågår ca två heldagar.