TheraScreen : K-RAS Mutation Kit För detektion av sju mutationer i K-RAS-genen

TheraScreen : K-RAS Mutation Kit För detektion av sju mutationer i K-RAS-genen För användning på Roche LightCycler 480 Real-Time PCR System (Instrument II) (Katalognr: 05015278001) och Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR System (artikelnummer: 4351105) Innehåller användarmanualen till LightCycler Adapt Software v1.1 från Roche Diagnostics (katalognr 05474914001) för TheraScreen : K-RAS Mutation Kit CE-IVD Bruksanvisning Produktkoder Kitstorlek DxS produktkod Roche Diagnostics beställningsnummer 20 reaktioner KR-21 05366216190 80 reaktioner KR-22 05366224190 Instruktionsversion: DU001g Reviderad: maj 2009 Förvaras vid 18 C till 25 C Page 1 of 37

Innehåll 1. Avsedd användning/användningsändamål...3 2. Sammanfattning och förklaring av testet...3 3. Tekniska principer...4 4. Reagens...6 5. VARNINGAR OCH SÄKERHETSÅTGÄRDER...7 6. Förvaring, stabilitet och transportvillkor...8 7. Instrument...9 8. Prover...9 9. K-RAS mutationsdetektionsprotokoll... 13 10. Begränsningar för testet... 25 11. Analyseffektens egenskaper... 26 12. Teknisk assistans... 34 13. Information om tillverkare och distributörer... 34 14. Datum för den senaste revideringen... 34 15. Referenser... 35 Meddelanden till köparen:... 37 Sida 2 av 37

VIKTIGT: Läs dessa instruktioner noggrant och bekanta dig med alla komponenter i K-RAS-kitet innan du använder det. 1. Avsedd användning/användningsändamål Avsedd användning DxS TheraScreen : K-RAS Mutation Kit (K-RAS-kitet) är ett in vitrodiagnostiskt test avsett för detektion av sju somatiska mutationer i K-RASonkogenen. Det ger en kvalitativ bedömning av mutationsstatusen. K-RASkitet ska användas av utbildad personal i en professionell laboratoriemiljö med DNA-prov som har extraherats från formalinfixerad och paraffininbäddad kolorektal vävnad. Användningsändamål Resultaten av K-RAS-kitet ska hjälpa läkarna att identifiera patienter med kolorektal cancer som kanske inte svarar på behandling med antiepidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR), t.ex. panitumumab eller cetuximab. K-RAS-kitet ska inte användas för att diagnostisera kolorektal cancer. Det är avsett som ett komplement till andra relevanta prognosfaktorer som används för att söka ut patienter som är lämpade för behandling med anti- EGFR-terapi, beroende på patientens mutationsstatus. Patientens mutationsstatus, liksom även andra sjukdomsfaktorer, kommer att bedömas av en läkare för att man ska kunna välja rätt behandling. Beslut om behandling för cancerpatienter får inte enbart baseras på K-RAS-mutationsstatus. 2. Sammanfattning och förklaring av testet K-RAS-kitet är en CE-märkt diagnosutrustning som uppfyller kraven i Europeiska unionens direktiv 98/79/EC om medicinsk utrustning för in vitrodiagnostik. Mutationer i K-RAS-onkogenen förekommer ofta i cancerformer hos människor. (1-4) Förekomsten av de här mutationerna korrelerar med bristande respons på vissa cancerterapier med EGFR-hämmare hos patienter med metastatisk kolorektal cancer (5-10)(14-21). Sju mutationer i K-RAS-genen kan detekteras i en bakgrund med vildtypgenomiskt DNA i en realtids-pcr-analys baserad på DxS Scorpions teknik. Metoden är mycket selektiv. Förutsatt att det finns tillräckligt med DNA-kopior är detektion av ca 1 % mutant i en bakgrund med vildtypgenomiskt DNA möjlig. K-RAS-kitet kommer att upptäcka sju K-RAS-mutationer i kodonerna 12 and 13 i K-RAS-onkogenen, så som det visas i tabell 1. Sida 3 av 37

Tabell 1: K-RAS-mutationer detekterade av DxS-kitet COSMIC-ID har hämtats från databasen Catalogue of Somatic Mutations in Cancer http://www.sanger.ac.uk/genetics/cgp/cosmic/ Mutation Basskifte Cosmic-ID Gly12Ala (GGT>GCT) 522 Gly12Asp (GGT>GAT) 521 Gly12Arg (GGT>CGT) 518 Gly12Cys (GGT>TGT) 516 Gly12Ser (GGT>AGT) 517 Gly12Val (GGT>GTT) 520 Gly13Asp (GGC>GAC) 532 3. Tekniska principer K-RAS-kitet kombinerar två tekniker, ARMS och Scorpions (11, 12, 13), för att detektera mutationer i realtids-pcr-analyser. ARMS Allel- eller mutationsspecifik amplifiering uppnås av ARMS. Taq DNApolymeras är extremt effektivt när det gäller att skilja på en matchning och en felmatchning vid 3 -änden av en PCR-primer. Specifikt muterade sekvenser kan amplifieras selektivt, även i prov där majoriteten av sekvenserna inte bär på mutationen på grund av: att primern är helt matchad. Amplifieringen fortsätter då med full effekt. att 3 -basen inte matchar. Då sker endast bakgrundsamplifiering på låg nivå. Scorpions Detektion av amplifiering utförs genom att använda Scorpions. Scorpions är bifunktionella molekyler med en PCR-primer som är kovalent bunden till en prob. Fluoroforen i den här proben samverkar med en quencher, även den integrerad i proben, som minskar fluorescensen. Under en PCR-reaktion när proben binds till ampliconen separeras fluoroforen och quenchern. Detta leder till en ökning av fluorescens från reaktionsröret. Dataanalys: Ct-metod Scorpions realtids-analyser använder det antal PCR-cykler som krävs för att detektera en fluorescenssignal över en bakgrundssignal, som ett mått på de målmolekyler som förekommer i början av reaktionen. Den punkt där signalen upptäcks över bakgrundsfluorescensen kallas "cykeltröskelvärde" (Cycle threshold, Ct). Provets Ct-värden beräknas som skillnaden mellan mutationsanalysens Ct och kontrollanalysens Ct från samma prov. Prov klassas som mutationspositiva om de ger ett Ct-värde lägre än 1 % Ct -värdet för den analysen. Sida 4 av 37

Över det här värdet kan provet antingen innehålla mindre än 1 % mutation (bortom gränsen för analyserna) eller vara mutationsnegativt. Om ARMS-primers används kan ineffektiv priming ske, vilket ger ett väldigt sent bakgrunds-ct från DNA som inte innehåller mutation. Alla Ct-värden som är beräknade genom bakgrundsamplifiering kommer att vara större än 1 % Ct-värdena och provet kommer att klassas som mutationsnegativt. K-RAS-kitet är CE-märkt för in vitro-diagnostisk användning, antingen på Roche Diagnostics LightCycler 480 Real-Time PCR System (Instrument II) (LightCycler 480 Instrument) 96 brunnar, Roche-artikelnummer: 05015278001 eller Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR System, artikelnummer 4351105 (ABI7500). För LightCycler 480 Instrument måste K-RAS-kitet användas I kombination med LightCycler Adapt Software v1.1 för TheraScreen K-RAS Mutation Kit CE-IVD (LightCycler Adapt Software). Programmet har utvecklats för att automatisera fastställningen av ett positivt eller negativt amplifieringsdiagram och beräknar en passande tröskel som man kan få Ct-värden ifrån. De används för att beräkna Ct-provvärdena som jämförs med 1 % gränsvärdena. Programmet rapporterar ett positivt eller negativt mutationsresultat och avlägsnar all form av subjektivitet från analysen och tolkningen av data för K-RAS-kitet. Format för K-RAS-kitet Åtta analyser ingår i K-RAS-kitet. En kontrollanalys. Sju mutationsanalyser. Samtliga reaktionsmixar innehåller en exogen kontrollanalys (internkontroll) märkt med HEX (som ska detekteras av JOE-detektorn på ABI7500). Den kontrollerar förekomsten av hämmare som kan leda till att ett falskt negativt resultat uppstår. Kontrollanalys Kontrollanalysen, märkt med FAM, används för att bedöma den totala mängden DNA i ett prov. Kontrollanalysen amplifierar ett område av exon 4 i K-RAS-genen. Primrarna och proberna har utformats på så vis att de undviker kända K-RAS-polymorfismer. Mutationsanalyser Varje mutationsanalys, märkt med FAM, innehåller en Scorpion- samt en ARMS-primer för urskiljning mellan vildtyps-dna och mutant-dna som detekteras med en realtids-pcr-analys. Sida 5 av 37

4. Reagens K-RAS-kitet innehåller tillräckligt mycket reagens för att det ska gå att utföra kvalitetsbedömning av prover och genomföra K-RAS-analyser för upp till 20 eller 80 reaktioner, beroende på kitets storlek. Kitstorlek DxS produktkod Roche Diagnostics beställningsnummer 20 reaktioner KR-21 05366216190 80 reaktioner KR-22 05366224190 Antalet prover som kan testas beror på provbatchstorleken. Tabell 2: Innehåll i K-RAS-kitet 20 Reagens som medföljer reaktioner 80 reaktioner Rör Volum Volum Kontrollreaktionsmix 1300 µl 5200 µl 1 12ALA reaktionsmix 650 µl 2600 µl 2 12ASP reaktionsmix 650 µl 2600 µl 3 12ARG reaktionsmix 650 µl 2600 µl 4 12CYS reaktionsmix 650 µl 2600 µl 5 12SER reaktionsmix 650 µl 2600 µl 6 12VAL reaktionsmix 650 µl 2600 µl 7 13ASP reaktionsmix 650 µl 2600 µl 8 Mixad standard 300 µl 1000 µl 9 Taq DNA polymeras 60 µl 240 µl 10 Utrustning och reagens som inte ingår i K-RAS-kitet Användaren kommer att behöva följande utrustning och förbrukningsartiklar: LightCycler 480 Instrument eller ABI7500 Real-time PCR Machine, kapabla till cykling enligt definitionen i avsnitt 9; K-RAS mutationsdetektionsprotokoll. LightCycler Adapt Software v1.1 från Roche Diagnostics (katalognr 05474914001). 0,2 ml DNAse-fria PCR-plattor (LightCycler 480 Instrument Multiwell Plate 96, katalognummer 04729692 001, eller ABI MicroAmp Optical 96-well reaction Plate, artikelnummer 4306737, med MicroAmp Optical Adhesive Film, artikelnummer 4311971). Sterila rör för beredning av huvudmixar. Pipetter avsedda för beredning av PCR-mix. Pipetter avsedda för fördelning av DNA-strängar. Sterilt, nukleasfritt H 2 O. Sida 6 av 37

5. VARNINGAR OCH SÄKERHETSÅTGÄRDER För in vitro-diagnostisk användning. K-RAS-kitet ska inte användas för att söka efter eller diagnostisera någon form av cancer, inklusive kolorektal cancer. Det är avsett som ett komplement till andra prognosfaktorer som används för att söka ut patienter som inte skulle gynnas av cancerbehandling med anti-egfr. Behandling av cancerpatienter ska inte enbart baseras på K-RASgenmutationsstatus. En läkare ska bedöma patientens mutationsstatus tillsammans med andra sjukdomsfaktorer. Innehållet i K-RAS-kitet kan frysas/tinas upp till 8 gånger utan att analyseffekten avtar. K-RAS-kitreagens FÅR INTE frysas/tinas fler än 8 gånger. Observera att tumörproverna inte är homogena och att data från ett tumörprov kanske inte stämmer överens med andra sektioner från samma tumör. Tumörprover kan även innehålla tumörfri vävnad. DNA från tumörfri vävnad förväntas inte innehålla K-RAS-mutationer som detekteras av K-RAS-kitet Alla analyser i K-RAS-kitet ger korta PCR-produkter. K-RAS-kitet fungerar emellertid inte på mycket fragmenterat DNA. DNA-bedömningar bör baseras på PCR och kan variera i kvantifiering beroende på avläsningar av optisk densitet. Extra kontrollreaktionsmix medföljer för bedömning av kvalitet och kvantitet av DNA i prov innan K-RAS-kitet körs. K-RAS-kitets reagens har spätts ut optimalt. Ytterligare utspädning av reagens rekommenderas inte, eftersom det leder till en sämre effekt. Att använda mindre än 25 µl reaktionsvolym rekommenderas inte, eftersom risken för falskt negativa resultat då ökar. Alla reagens i K-RAS-kitet har utformats särskilt för att användas med de angivna testerna. För att bästa effekt ska kunna garanteras får K-RAS-kitets reagens inte bytas ut mot något annat. För garanterad optimal aktivitet och effekt ska Scorpion-primers (liksom alla fluorescentmärkta molekyler) skyddas mot ljus så att de inte drabbas av fotoblekning. Var extra försiktig och undvik att PCR-reaktionerna kontamineras av syntetiskt kontrollmaterial. Du bör använda separata, speciellt tilldelade pipetter när du framställer reaktionsmixar och tillsätter DNA-strängar. Beredning och fördelning av reaktionsmixar ska utföras i ett område avskiljt från området där strängar tillsätts. Rören får aldrig öppnas efter en PCR-reaktion. Sida 7 av 37

Varje analys som ingår i K-RAS-kitet har sin egen karakteristik. Beräkningen av resultatet måste göras med rätt analysparametrar som referens (se avsnittet Rapport/Tolkning av data). Mutations-Ct-värden på 38 eller mer måste räknas som negativa eller under kitets gränser. Analysen innehåller en exogen kontrollreaktion (internkontroll) förutom den aktuella reaktionen (se avsnittet Tekniska principer). Om båda analyserna har misslyckats måste dessa data kasseras, eftersom det kan förekomma hämmare som kan leda till falskt negativa resultat. Utspädning av provet kan minska effekten hos hämmarna men leder även till utspädning av DNA. Generella säkerhetsåtgärder bör vidtas i laboratoriet, t.ex. (men inte enbart) följande: a) Pipettera inte med munnen b) Rök, ät och drick inte i områden där prov eller kitreagens hanteras c) Tvätta händerna efter att testet har utförts Använd enbart det Taq-polymeras (Taq) som ingår i kitet. Ersätt det inte med Taq från andra kit av samma eller annan typ, eller med Taq från andra leverantörer. För att minimera antalet frysnings-/upptiningscykler bör du inte tina hela kitet varje gång. Tina istället bara de reagens som krävs för varje separat körning. Säkerhetsinformation Varning: Alla kemikalier och allt biologiskt material bör betraktas som potentiellt farliga. Prover är potentiellt smittsamma och måste därför hanteras med största försiktighet. K-RAS-kitet bör enbart användas av personer som har utbildning i motsvarande laboratorietekniker. När du jobbar med komponenterna i det här K-RAS-kitet ska du alltid ha på dig en lämplig labbrock, engångshandskar och säkerhetsglasögon. Efter användning ska K-RASkitets komponenter kasseras som kliniskt avfall. 6. Förvaring, stabilitet och transportvillkor Förvaring Allt innehåll i K-RAS-kitet bör omedelbart efter att det har mottagits förvaras mörkt i 18 C till 25 C, i en frys med konstant temperatur. Undvik att frysa/tina upp innehållet av K-RAS-kitet i onödan. Sida 8 av 37

Stabilitet Använd inte K-RAS-kitet efter det angivna utgångsdatumet. Innehållet i K-RAS-kitet är stabilt fram till utgångsdatumet om det förvaras under de rekommenderade förvaringsvillkoren och i originalförpackningen. Innehållet i K-RAS-kitet kan frysas/tinas upp till 8 gånger utan att analyseffekten avtar. K-RAS-kitreagens FÅR INTE frysas/tinas fler än 8 gånger. Leveransvillkor Innehållet i K-RAS-kitet levereras på torris och bör vara fruset vid ankomst. Kontakta ditt lokala Roche Diagnostics-kontor i följande fall: K-RAS-kitet är inte fruset vid ankomst, den yttre förpackningen har öppnats under transporten eller det saknas en bipacksedel, en bruksanvisning eller ett reagens i leveransen. Se avsnitt 12, Teknisk assistans, för kontaktuppgifter. 7. Instrument Se instrumentets bruksanvisning för kompletta instruktioner för installationen och användning av realtids-pcr-instrumentet. 8. Prover Provmaterialet måste vara mänskligt, genomiskt DNA taget från formalinfixerade och paraffininbäddade kolorektala tumörprover. Provtagning och förberedelse 1. Provtransport Standardmässig patologisk metod för att garantera provets kvalitet. 2. Rekommenderad process för provextraktion: Vid DNA-extraktion, använd Qiagen QIAamp DNA FFPE tissue kit (katalognummer 56404). Följande tillägg till Qiagen-protokollet måste användas: FFPE-sektioner måste samlas på objektglas. Överflödigt paraffin måste skrapas bort från vävnadssektionerna med en ny, steril skalpell. Skrapa ner vävnadsmaterial i microcentrifugrör med hjälp av en ny skalpell för varje prov som ska extraheras. Nedbrytning av proteinas K måste pågå tills den är helt avslutad. Detta kan ta upp till 48 timmar. Proverna måste elueras i 200 µl ATE-buffert från Qiagenextraktionskitet. Samtliga alternativa metoder av provberedning måste godkännas av slutanvändaren. 3. Förvaring av extraherat DNA: Förvara vid 20 C innan analys. Sida 9 av 37

Protokoll för provbedömning En extra kontrollanalysmix medföljer i K-RAS-kitet och måste användas för att bedöma den totala mängden DNA i ett prov. Kontrollanalysen amplifierar ett område av exon 4 i K-RAS-genen. Prover ska förberedas med endast kontrollanalysen med den mixade standarden som positiv kontroll och vatten som kontroll utan strängar. Observera att för att uppnå optimal användning av reagens i K-RAS-kitet måste proverna indelas i batchar. Alla experimentkörningar måste innehålla kontroller. Om prov testas individuellt krävs mer reagens, vilket leder till att färre prover kan testas med K-RAS-kitet. Protokoll för provbedömning förberedelse av platta 1. Tina kontrollreaktionsmixen och den mixade standarden från K-RASkitet i rumstemperatur. Blanda varje lösning genom att vända varje rör 10 gånger efter tining för att undvika lokala saltkoncentrationer. Bered tillräckligt med mixar för DNA-proven, en mixad standard-reaktion och en kontrollreaktion utan strängar, samt ytterligare 2 reaktioner. 2. För att skapa huvudmixen, använd mängden reagens per reaktion enligt tabell 3. Tabell 3: Huvudmixvolymer för kontrollanalys Analys Huvudmix Reaktionsmix Taq (µl)x1 (µl)x1 Kontrollanalys 19,8 0,2 3. Vortexa INTE Taq eller någon annan reaktionsmix som innehåller Taq, eftersom det kan leda till att enzymet inaktiveras. 4. Kontrollera att Taq har rumstemperatur innan det används. Snurra flaskan för att säkerställa att all Taq har samlats på botten av flaskan och pipettera sedan genom att placera pipettspetsen precis under ytan på Taq för att minimera risken för att spetsen täcks med överflödigt Taq. 5. Blanda huvudmixen genom att pipettera försiktigt upp och ned. 6. Tillsätt omedelbart 20 µl av kontrollhuvudmixen i varje reaktionsbrunn. 7. Tillsätt omedelbart 5 µl prov, mixad standard eller vatten (för kontrollerna utan strängar) i reaktionsbrunnarna. 8. Plattan måste beredas med den mixade standarden tillsatt i brunn A1 och kontroll utan strängar (vatten) tillsatt i A2. Alla andra brunnar som används måste innehålla proven. 9. Förslut och snurra PCR-plattan en kort stund för att samla reagensen på botten av brunnarna. 10. Läs instruktionerna om förberedning av instrumentet för den aktuella plattformen. Sida 10 av 37

Protokoll för provbedömning Bruksanvisning för LightCycler 480 Instrument 1. Placera omedelbart plattan i LightCycler 480 Instrument. 2. Klicka på programikonen för LightCycler 480 Software på skrivbordet till arbetsstationen som är ansluten till instrumentet. Logga in i programmet och välj "New Experiment from Template" i översiktsfönstret. Välj "K-RAS LC480II Run Template" i "run templates"-listan. Strängen kommer att ha följande parameterar: 1. Detektionsformat är "DxS IVD Assays". 2. Reaktionsvolym är 25. 3. Ett inledande uppehåll vid 95 C i 4 minuter. 4. En 2-stegsamplifiering för 45 cykler med en denaturering vid 95 C i 30 sekunder och hybridisering vid 60 C i 1 minut. Mätningen av fluorescens är en enskild mätning vid 60 C-steget. 3. Välj fliken "Sample Editor" och sedan under "Step 1: Select Workflow" markerar du kryssrutan "Abs Quant". Kontrollera att båda filtren (465-510 nm och 533-580 nm) är markerade under "Select Filter Combinations". Ange provnamnen under Step 2 och Step 3. Quantification Sample Type ska vara angiven som "unknown". Replikatkolumnen ska lämnas tom. 4. Välj knappen "Experiment" och klicka på knappen "Start Run" för att spara experimentet och starta cyklingen. 5. När körningen är avslutad, markera "Analysis"-knappen och välj "Abs Quant/2nd Derivative Max" från fönstret "Create New Analysis". Acceptera standarderna i fönstret "Create New Analysis". Kontrollera att "Filter Comb"-knappen står på "465-510" och klicka på "Calculate"- knappen. Ct-värdena visas i "Samples"-tabellen. 6. Klicka på "Filter Comb"-knappen och byt filtren till 533-580 nm. Klicka på "Calculate"-knappen för att erhålla Ct-värdena för den exogena kontrollen från "Samples"-tabellen. Protokoll för provbedömning förberedning av ABI7500 Instrument 1. Placera omedelbart plattan i ABI7500 Instrument. 2. Markera ikonen för 7500 System Software på skrivbordet till arbetsstationen som är ansluten till instrumentet. Öppna en ny körfil från menyn File i 7500 Sequence Detection Software version 1.4. 3. Välj "Standard Curve (Absolute Quantification)" under "Assay". Välj "Standard 7500" under "Run Mode". Sida 11 av 37

4. Gå till detektorns konfigurationsfönster genom att klicka på "Next"- knappen. Lägg till en FAM- och en JOE-detektor med quenchers som är inställda på "none" i detektorlistan. Om de här detektorerna inte redan existerar ska du klicka på knappen "New Detectors" och skapa en FAM- och en JOE-detektor med quenchern inställd på "none". 5. Ställ in "Passive Reference" på "None" och klicka på "Next"-knappen. 6. Markera hela plattan och markera kryssrutorna för FAM- och JOEdetektorerna för att försäkra dig om att båda färgerna övervakas i båda brunnarna. Klicka på "Finish"-knappen. 7. Ställ in cyklingen enligt tabell 4 under fliken "Instrument". Tabell 4: Cyklingsvillkor för ABI7500 Temperatur Tid Cykler Datainsamling Steg 1 95 o C 4 min 1 Steg 2 95 o C 30 sek 60 o C 1 min 40 FAM, JOE 8. Klicka på "Start"-knappen för att spara experimentet och starta cyklingen. 9. När körningen har slutförts måste du kontrollera att den passiva referensen är inställd på "none" i brunninspektionsfönstret. Välj alla de brunnar som används på fliken Amplification Plot och välj JOE-färgen i den nedrullningsbara detektormenyn. 10. Kontrollera JOE-signalen från varje prov och jämför med JOE-signalen i NTC-brunnen. Observera alla prov som har en senare amplifieringskurva eller misslyckad amplifiering för den exogena kontrollen i jämförelse med NTC. 11. Välj alla de brunnar som används på fliken Amplification Plot och välj FAM-färgen i den nedrullningsbara detektormenyn. Använd den automatiska baseline-inställningen och manuell Ct och ställ sedan in tröskeln manuellt i mitten av den exponentiella fasen genom att använda loggskalan för Y-axeln som beskrivs i användarhandboken för ABI7500. 12. Klicka på "Analyse"-knappen för att erhålla Ct-värden. Sida 12 av 37

Tolkning av provbedömning Fastställ Ct-värdena för NTC för att garantera att det inte finns någon smitta som ger en positiv amplifiering i FAM-kanalen (Ct mindre än 40) eller en misslyckad exogen kontrollreaktion i HEX-kanalen (inget Ct), vilket indikerar problem med förberedelserna. Den mixade standarden bör ge ett kontrollanalys-ct (FAM-kanal) på 26-29 på ABI7500 och 29 på LightCycler 480 Instrument. Om någon av de här 2 körningskontrollerna har misslyckats bör dessa data inte användas. Kontrollanalys-Ct 29-35: Gör försiktiga tolkningar, eftersom mutationer med väldigt låg nivå inte kan upptäckas. Kontrollanalys-Ct 35-38: Bara några få amplifierbara DNA-kopior förekommer i sådana prov och mutationer kommer troligen bara att upptäckas om de flesta kopiorna är muterade. Kontrollanalys-Ct 38: Ignorera provet eftersom det innehåller minimalt med DNA och K-RAS-kitet inte kan upptäcka mutationer. Observera att om ett prov ger ett sent kontrollanalys-ct-värde måste prov- CT-värdet för den exogena kontrollen jämföras med den exogena kontrollen för NTC. Om den exogena kontrollen för provet är försenad eller negativ i jämförelse med NTC kan en hämmare förekomma. Det är möjligt att minska effekten av en hämmare genom att spä ut provet, även om detta också leder till utspädning av DNA. Utspädning av prov: Ett kontroll-ct på < 24 skulle överbelasta mutationsanalyserna. Prov med ett kontroll-ct på < 24 måste spädas ut. Observera för LightCycler 480 Instrument att Ct-värden som har uppnåtts genom den andra derivatmetoden kan skilja sig något från de som har uppnåtts med LightCycler Adapt Software. Vi rekommenderar att koncentrerade prov späds ut för att hamna inom > 24- till < 29-intervallet (Ct-värden baserade på 7500 Sequence Detection Software eller LightCycler 480 Instrument Software), baserat på att utspädning med ½ kommer att öka Ct med 1. 9. K-RAS mutationsdetektionsprotokoll Läs dessa instruktioner noggrant och bekanta dig med alla komponenter i K-RAS-kitet innan du använder det. För att använda K-RAS-kitet effektivt måste prov grupperas i en batchstorlek på 10 (för att fylla en platta med 96 brunnar). Mindre batchstorlekar innebär att färre prover kan testas med K-RAS-kitet. Förberedelse för experiment med LightCycler 480 Instrument För varje DNA-prov måste kontroll- och mutationsanalyserna analyseras på samma PCR-körning för att undvika variationer mellan körningarna. 1. Tina reaktionsmixarna och mixad standard från K-RAS-kitet i rumstemperatur. Blanda varje lösning genom att vända varje rör 10 gånger efter tining för att undvika lokala saltkoncentrationer. Sida 13 av 37

Bered tillräckliga mixar för DNA-proven, mixad standardkontrollerna och kontrollerna utan strängar, plus 2 reaktioner per blandning extra enligt tabell 5. Tabell 5: Volymer för K-RAS-huvudmix Analys Reaktionsmix (µl)x1 Huvudmixar Reaktionsmix (µl) Taq (µl)x1 per platta (x14) Taq (µl) per platta (x14) Kontrollanalys 19,8 0,2 277,2 2,8 Mutationsanalys 19,8 0,2 277,2 2,8 2. Vortexa INTE Taq eller någon annan reaktionsmix som innehåller Taq, eftersom det kan leda till att enzymet inaktiveras. 3. Kontrollera att Taq har rumstemperatur innan det används. Snurra på flaskan för att säkerställa att all Taq har samlats på botten, och pipettera sedan genom att placera pipettspetsen precis under ytan på Taq för att minimera risken för att spetsen täcks med överflödigt Taq. 4. Mixa huvudmixarna genom att försiktigt pipettera upp och ned. 5. Tillsätt omedelbart 20 µl av huvudmixarna i reaktionsbrunnarna. 6. Tillsätt omedelbart 5 µl prov, mixad standard eller vatten (för kontrollerna utan strängar) i reaktionsbrunnarna. Varje DNA-prov måste testas med både kontrollen och alla mutationsanalyser. Förberedelsen av plattan anges i tabell 6. Tabell 6: Plattlayout för K-RAS-kitet Layout för 96 brunnar Analys 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Kontroll B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP Mixad standard NTC Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 Prov 6 Prov 7 Prov 8 Prov 9 Prov 10 Mixad standard NTC Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 Prov 6 Prov 7 Prov 8 Prov 9 Prov 10 Mixad standard NTC Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 Prov 6 Prov 7 Prov 8 Prov 9 Prov 10 Mixad standard NTC Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 Prov 6 Prov 7 Prov 8 Prov 9 Prov 10 Mixad standard NTC Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 Prov 6 Prov 7 Prov 8 Prov 9 Prov 10 Mixad standard NTC Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 Prov 6 Prov 7 Prov 8 Prov 9 Prov 10 Mixad standard NTC Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 Prov 6 Prov 7 Prov 8 Prov 9 Prov 10 Mixad standard NTC Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 Prov 6 Prov 7 Prov 8 Prov 9 Prov 10 Sida 14 av 37

7. Förslut och snurra PCR-plattan en kort stund för att samla reagensen på botten av brunnarna. 8. Placera omedelbart plattan i LightCycler 480 Instrument. Förberedelse av LightCycler 480 Instrument 1. Klicka på programikonen för LightCycler 480 Instrument på skrivbordet till arbetsstationen som är ansluten till instrumentet. Logga in i programmet och välj "New Experiment from Template" på översiktssidan. 2. Välj "K-RAS LC480II Run Template" i listan Run Templates (mer information finns i avsnittet om provbedömning med LightCycler 480 Instrument). 3. Välj fliken "Sample Editor" och sedan under "Step 1: Select Workflow" markerar du kryssrutan "Abs Quant". Kontrollera att båda filtren (465-510 nm och 533-580 nm) är markerade under "Select Filter Combinations". Ange provnamnen under Step 2 och Step 3. I kolumn 1 måste provnamnet vara Mixed Standard. I kolumn 2 måste provnamnet vara NTC. I kolumnerna 3-12 ska provnamnen skrivas in. Namnen måste vara identiska för alla brunnar i 1 kolumn. Quantification Sample Type ska vara angiven som "unknown". Replikatkolumnen ska lämnas tom eftersom replikat inte tas med i beräkningen av LightCycler Adapt Software. 4. Välj knappen "Experiment" och klicka på knappen "Start Run" för att spara experimentet och starta cyklingen. Provanalys med LightCycler 480 Instrument 1. När körningen på LightCycler 480 Instrument har avslutats exporterar du experimentet (.ixo-fil) via navigatorfönstret till en lämplig plats som går att komma åt med LightCycler Adapt Software. 2. VIKTIGT: LightCycler Adapt Software är validerat för användning på en dator som är definierad som en enkel kontrollenhet (arbetsstation) som tillhandahålls av Roche Diagnostics för användning med ett LightCycler 480 Instrument II. Valideringen för LightCycler Adapt Software gäller för närvarande endast för kontrollenheten som en "fristående" dator (dvs. inte del av ett nätverk). Användning av en annan dator är inte tillåten eftersom programmet då kanske inte fungerar som det ska. 3. Öppna LightCycler Adapt Software genom att klicka på ikonen för LightCycler Adapt Software på arbetsstationens skrivbord och fylla i fältet med användarnamnet. Detta namn kommer att stå som författare till rapporten. 4. Använd bläddringsknappen i huvudfönstret för att markera en enskild körningsfil på LightCycler 480 Instrument (om du vill ta bort en markering måste programmet först stängas och sedan öppnas igen). Sida 15 av 37

5. Välj en rapporttyp (pdf eller csv). Om csv väljs skapas även en pdfversion automatiskt. 6. Välj "Analyse" för att skapa resultatrapporten. Rapporten sparas automatiskt i mappen som innehåller körningsfilen och ges samma namn som körningsfilen. 7. Rapporten visas automatiskt. 8. Det rapporteringsbara resultatet visas i kolumnen "Mutation Status" i "Sample Result Table" Tolkning av LightCycler Adapt Software-rapporter 1. LightCycler Adapt Software-rapporten innehåller allmän information om analysen. 1.1. Författaren till rapporten är den person som har kört programmet och skapat rapporten. 1.2. Datumet och tiden för analysen är givna. 2. Rapporten ger en analysöversikt med specificering av körningsfilnamnet samt algoritmdefinitionsfilen och algoritmsekvensen. Algoritmvärdena är fasta och kan inte ändras. 3. I resultatsektionen anges det fullständiga namnet och sökvägen till körningen på LightCycler 480 Instrument plus följande information: 3.1. Serienumret till LightCycler 480 Instrument. 3.2. Instrument Name det ID som ges till LightCycler 480 Instrument i LightCycler 480 Instrument Software. 3.3. Run Date datum och tid för körningen på LightCycler 480 Instrument. 3.4. Run Operator namnet på den person som var inloggad i LightCycler 480 Instrument Software när experimentet kördes. 3.5. Experiment Name filnamnet för körningen. 3.6. Software Version version av det program som används på LightCycler 480 Instrument. 3.7. Lot Number hämtas från fältet "Lot No" i fönstret för experimentförberedelse i LightCycler 480 Instrument Software. 4. Plattlayouten anges med provnamn som tas från provredigeringsfönstret i LightCycler 480 Instrument Software. 5. Ett "Run Summary Result" ges om körningen får statusen Valid eller Invalid. Detta är beroende av körningskontrollerna i kolumnerna 1 och 2. 6. Körningskontroller 6.1. LightCycler Adapt Software beräknar automatiskt Ct-värdet för den mixade standarden med formeln Mutation Ct-kontroll Ct = Ct 6.2. LightCycler Adapt Software jämför värdena med de förväntade värdena som ges i tabell 7. Sida 16 av 37

Tabell 7: LightCycler Adapt Software, förväntade Ct-värden Analys Mixad standard Ct 12ALA -0,61 12ASP -0,61 12ARG 0,34 12CYS -0,79 12SER -0,13 12VAL 0,1 13ASP -0,74 6.3. Ct- och Ct-värdena rapporteras. 6.4. Följande flaggor/varningar rapporteras för körningskontrollerna i kolumn 1 och 2: Tabell 8: LightCycler Adapt Software flaggor/varningar för körningskontroller Flagga/varning CT_OUT_OF_RANGE EXO_FAIL DELTA_CT_OUT_OF_RANGE EXO_CONTROL_INVALID TARGET_CHANNEL_INVALID Betydelse FAM Ct för kontrollanalys är utanför intervallet För mixad standard är Ct-värdet för den exogena kontrollen < 30 eller negativt om FAM-resultatet är negativt Mutations- Ct-värdena är utanför det inställda intervallet. Den exogena kontrollreaktionen har misslyckats i en NTC FAM-reaktionen har ett positivt Ct-värde i en NTC 6.4.1. Betydelserna för flaggor/varningar anges detaljerat nedan: 6.4.1.1. CT_OUT_OF_RANGE Kontrollanalysen för den mixade standarden måste ha ett Ct-värde på 26,60 ± 2. Om analysen är utanför det här intervallet visas denna flagga/varning för alla brunnar med mixad standard eftersom Ct-värdena inte beräknas och den mixade standarden är ogiltig. Detta indikerar att kontrollanalysen inte fungerar korrekt. 6.4.1.2. EXO_FAIL Denna flagga/varning visas om den exogena kontrollanalysen i någon av brunnarna med mixad standard är under 30 eftersom det kan indikera att PCR-kontaminering förekommer i mixen. Om den exogena kontrollanalysen misslyckas när en FAMreaktion misslyckas i någon av brunnarna med mixad standard visas också flaggan/varningen EXO_FAIL. Detta indikerar att det finns ett problem med analysen, vilket kan leda till falskt negativa resultat. Den mixade standarden är redan ogiltigförklarad på grund av FAMmisslyckandet. Sida 17 av 37

6.4.1.3. DELTA_CT_OUT_OF_RANGE Om Ct-värdena för mixad standard ligger inom ±2,00 av värdena som anges i tabell 7 kommer programmet att rapportera giltig status. Om Ct är utanför det förväntade intervallet blir statusen ogiltig och den här flaggan/varningen kommer att visas. Detta indikerar ett problem med en analys som kan leda till felaktiga resultat. 6.4.1.4. EXO_CONTROL_INVALID I brunnarna med kontroll utan strängar måste den exogena kontrollanalysen ge ett positivt resultat i alla 8 brunnarna (Ct < 41). Om ett negativt resultat erhålls visas denna flagga/varning och en ogiltig status indikeras. Detta indikerar ett problem med analysen som kan leda till felaktiga resultat. 6.4.1.5. TARGET_CHANNEL_INVALID I de 8 brunnarna med kontroll utan strängar måste FAM-resultatet vara negativt (Ct > 38). All amplifiering indikerar kontaminering. Ett positivt resultat gör att denna flagga/varning visas och ogiltigförklarar kontrollen utan strängar. 6.5. Om statusen är ogiltig för någon av brunnarna med mixad standard eller brunnarna med kontroll utan strängar kommer Run Summary Result att vara "Run Invalid". I "Sample Result Table" kommer provnamn och kontroll-ct-värden att rapporteras, men mutationsstatusen kommer att rapporteras som "invalid". Den mixade standarden indikerar att alla analyser fungerar korrekt. Om detta visar sig inte vara fallet kan en falskt positiv eller falskt negativ mutation rapporteras. Kontrollen utan strängar indikerar att huvudmixarna inte är kontaminerade och att den exogena kontrollen fungerar som den ska. 6.6. Om LightCycler Adapt Software skulle visa ett felmeddelande söker du information i Teknisk assistans, avsnitt 12. 7. Provresultat 7.1. I "Sample Result Table" rapporteras provnamn från programmet till LightCycler 480 Instrument och Ct-värden för kontrollanalysen. 7.2. LightCycler 480 Adapt Software beräknar Ct-värdena och avgör om ett prov är mutationspositivt eller -negativt baserat på 1 % cutoff-värdena i tabell 9. Tabell 9: LightCycler Adapt Software 1 % cutoff-värden Analys 1 % delta Ct 12ALA 6,25 12ASP 7,72 12ARG 6,83 12CYS 6,95 12SER 8,95 12VAL 6,5 13ASP 9,09 Sida 18 av 37

7.3. Om ett mutations- Ct-värde för ett prov är nedanför det motsvarande 1 % Ct cutoff-värdet rapporteras provet som mutationspositivt. LightCycler Adapt Software rapporterar vilken mutation som förekommer men rapporterar endast en enskild mutation. Om det finns 2 positiva Ct-värden rapporteras det minsta värdet. Det antas att det andra värdet har tillkommit genom korsreaktivitet för en mutationsprimer som binder och utför priming från en annan mutation. I sällsynta fall när en dubbel mutation förekommer blir det kliniska beslutet identiskt med det fall när en enskild mutation förekommer. 7.4. Om Ct-provvärdena är större än 1% Ct-värdena rapporteras provet som mutationsnegativt (kan innehålla en mutation men i så fall på en nivå som är nedanför gränserna i kitet). 7.5. Flaggor/varningar 7.5.1. LightCycler Adapt Software rapporterar ett antal flaggor/ varningar för proverna i "Sample Result Table" enligt beskrivningen i tabell 10. Tabell 10: LightCycler Adapt Software, provflaggor/-varningar Flagga/varning Betydelse REP_DILUTION Kontroll-Ct är mindre än 24 CONF_LEVEL Kontroll-Ct är större än 28,9 och ingen mutation rapporteras LIMITED Kontroll-Ct är större än 35 EXO_FAIL Den exogena kontrollanalysen har misslyckats om FAM-reaktionen också har misslyckats i en mutationsreaktion, eller om det exogena kontroll-ct-värdet är mindre än 30. FAIL Programmet kan inte klassificera en kurva som positiv eller negativ 7.5.2. Betydelserna för flaggor/varningar anges detaljerat nedan: 7.5.2.1. REP_DILUTION Kontroll-Ct < 24. Analyserna har validerats till en DNA-nivå som ger ett kontroll-ct-värde på 24 eller högre. Om ett prov ger ett lägre Ct-värde för kontrollanalysen ska det spädas för att säkerställa att det hamnar inom det giltiga arbetsintervallet. 7.5.2.2. CONF_LEVEL Kontroll-Ct > 28,9. En CONF_LEVELflagga/-varning visas för ett negativt prov med ett kontroll-ct-värde > 28,9. Mutations-Ct-värden klassas som negativa eller utanför kitgränserna när de är större än eller lika med 38. Det är nödvändigt att ha ett kontroll- Ct-värde på 28,9 eller lägre för att tillhandahålla tillräckligt mycket DNA för att kunna detektera 1 % mutation, med 1 % cutoff-värdena och ett Ct cutoff-värde på 38 som förutsättning. Om kontroll-ct-värdet är större än 28,9 och en mutation detekteras visas den positiva mutationen men denna flagga/varning visas inte eftersom provet innehåller en definitiv mutation. Sida 19 av 37

Dock, om kontroll-ct-värdet är över 28,9 och provet visar sig vara mutationsnegativt visas denna flagga/varning för att varna om att mutationer med låg nivå kan ha förbisetts. När kontroll-ct-värdet blir högre än 28,9 minskar sensitiviteten för mutationsdetektionen. 7.5.2.3. LIMITED-Control Ct > 35. Detta indikerar att det finns mycket lite amplifierbart DNA tillgängligt, vilket gör att endast mutationer som förekommer med ett högt procentvärde kan detekteras. Om en positiv mutation ger ett Ct-värde < 38 i LIMITED-prover får mutationen ändå statusen giltig och kommer att rapporteras. Förekomsten av mutationer med låg nivå i ett prov med ett negativt resultat och flaggan/varningen LIMITED kan inte ignoreras. 7.5.2.4. EXO_FAIL Programmet kontrollerar amplifiering av den exogena kontrollanalysen för att fastställa eventuell förekomst av en hämmare, vilket kan leda till ett falskt negativt resultat. Följande metod används: a. Den exogena kontrollreaktionen bedöms endast i mutationsreaktionsbrunnarna, inte i kontrollanalysbrunnen, med undantag för den mixade standarden och NTC-kolumnerna (se punkt 6) eller om det finns ett Ct-värde för exogen kontroll < 30. b. Om det finns en positiv mutationsklassificering men den exogena kontrollanalysen har misslyckats i den mutationspositiva brunnen visas inte flaggan/ varningen EXO_FAIL eftersom det kan finnas konkurrerande hämning från FAM-reaktionen. Mutationsstatusen är giltig. c. Om det finns en positiv mutationsklassificering för ett prov i en mutationsbrunn och en misslyckad exogen kontrollanalys i en annan mutationsbrunn för samma prov kommer mutationen i den första brunnen att fastställas och resultatet är giltigt. En EXO_FAILflagga/-varning kommer dock att visas. Detta indikerar att det finns ett problem med analysen i brunnen med den misslyckade exogena kontrollanalysen och att en mutation kan ha förbisetts i den här brunnen. Det är möjligt att mutationen som fastställdes är korsreaktiv mellan analyserna snarare än den sanna mutationen, vilken har förbisetts. Dock fortsätter mutationsstatusen i analysen som rapporterar fastställning av positiv mutation att vara giltig eftersom det förekommer en tydlig mutation, och det kliniska beslutet förblir detsamma oavsett vilken mutation som förekommer. Sida 20 av 37