Beställningsinformation COBAS AMPLICOR HIM 48 Tests P/N: HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 ART: US: 83369

COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 HIM FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING. Beställningsinformation COBAS AMPLICOR HIM 48 Tests P/N: 21118390 123 HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 ART: 11 1839 0 US: 83369 Avsedd användning COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 US: 83314 Testet COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, version 1.5 (v1.5) är ett in vitro-test för nukleinsyreamplifiering för kvantifiering av humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) RNA i human plasma på COBAS AMPLICOR Analyzer. Testet kan kvantifiera HIV-1 RNA inom ett intervall på 50 750 000 kopior/ml med hjälp av en kombination av två extraktionsförfaranden, standardextraktion och ultrasensitiv extraktion. Testet är avsett att användas i kombination med en klinisk bedömning och andra laboratoriemarkörer för sjukdomsförloppet för den kliniska hanteringen av HIV-1- infekterade patienter. Testet kan användas för att bedöma patientprognosen genom att mäta baseline HIV-1 RNA-nivån eller övervaka effekterna av antiretroviral behandling genom att mäta förändringar i plasma HIV-1 RNA-nivåer under den antiretrovirala behandlingen. HIV-1 RNA-nivåer som uppmätts med Polymerase Chain Reaction (PCR) används som en av surrogatmarkörerna i den accelererade FDA-godkända processen för proteashämmarna INVIRASE (sakvinavirmesylat), CRIXIVAN (indinavirsulfat), NORVIR (ritonavir) och FORTOVASE (sakvinavir); icke-nukleosid RT-hämmarna VIRAMUNE (nevirapin), SUSTIVA (efavirenz) och ZIAGEN (abakavir) samt för RT-hämmaren EPIVIR (lamivudin). COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 är inte avsett att användas som screeningtest för blod eller blodprodukter för förekomst av HIV-1 eller som ett diagnostiskt test för att bekräfta förekomst av HIV-1-infektion. P/N: 03788229 190 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 1/51

Sammanfattning och förklaring av testet Humant immunbristvirus (HIV) är etiologisk agens för förvärvat immunbristsyndrom (AIDS) 1-3. HIV-infektion kan överföras genom sexuell kontakt, exponering för infekterat blod eller blodprodukter, eller från en infekterad gravid kvinna till barnet 4. Inom tre till sex veckor efter exponering för HIV utvecklar infekterade personer vanligtvis ett akut syndrom som karakteriseras av influensaliknande symptom, tillsammans med höga nivåer av viremi i det perifera blodet 5-8. Hos de flesta infekterade personerna åtföljs detta av en HIV-specifik immunrespons och en minskning av plasmaviremi, vanligtvis fyra till sex veckor efter de första symptomen 9,10. Efter serokonversion går infekterade personer oftast in i en kliniskt stabil, asymptomatisk fas som kan vara under flera år 11-13. Den asymptomatiska perioden karakteriseras av en bestående låg nivå av plasmaviremi 14 och en gradvis minskning av CD4 + T-lymfocyter, vilket leder till svår immunbrist, flera opportunistiska infektioner, malignitet och dödsfall 15. Även om virusnivåerna i det perifera blodet är relativt låga under den asymptomatiska fasen av infektionen, verkar virusreplikering och rening vara dynamiska processer där stora delar av virusproduktionen och infektion av CD4 + -celler balanseras av lika stora delar virusrening, celldöd hos infekterade celler och förnyelse av CD4 + -celler, vilket resulterar i relativt stabila nivåer av både plasmaviremi och CD4 + -celler 16-18. Kvantitativa mätningar av HIV-viremi i det perifera blodet har visat att högre virusnivåer kan korrelera med ökad risk för klinisk progression av HIV-sjukdom, och att minskning i plasmavirusnivåer kan associeras med en ökad risk för klinisk progression 19-21. Virusnivåer i det perifera blodet kan kvantifieras genom mätning av HIV p24-antigen i serum, genom kvantitativ kultur av HIV från plasma eller genom direkt mätning av viralt RNA i plasma med hjälp av teknikerna nukleinsyraamplifiering eller signalamplifiering 22-26. p24-antigen är det huvudsakliga proteinet för HIV och finns i serum, antingen fritt eller bundet till anti-p24-antikropp. Fritt p24-antigen kan mätas med i handeln tillgängliga enzymimmunanalyser (EIA), men möjligheten att använda p24- antigen som en markör för viral load är begränsad, eftersom antigenet endast kan upptäckas hos 20 % av asymtomatiska patienter och 40 50 % av symptomatiska patienter. Förfaranden för att dissociera antigen-antikroppskomplex förbättrar sensitiviteten hos p24-antigentesterna, men virusproteinet förblir oupptäckt hos de flesta asymtomatiska patienter 22. Smittsam HIV i plasma kan odlas genom ympning i aktiverade perifera mononukleära blodceller (PBMC) från friska blodgivare. Kvantifiering erhålls genom att PBMC ympas med seriella spädning av plasmaprovet. Kvantitativ odling har begränsad användbarhet för monitorering av virusnivåer hos infekterade personer, eftersom endast en liten fraktion viruspartiklar är infektiösa in vitro. Infektiöst virus kan ofta inte påvisas hos asymtomatiska personer 22. HIV RNA i plasma kan kvantifieras genom metoder som använder amplifiering med nukleinsyra som till exempel Polymerase Chain Reaction (PCR) 27-29. Testet COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 använder PCR-teknik för att uppnå maximal känslighet och dynamiskt intervall för kvantitativ detektion av HIV-1 RNA i EDTA eller ACD anti-koagulerad plasma 24. 2/51 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

HIV-1 MONITOR Testprincip Testet COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR v1.5 är baserat på fem grundläggande procedurer: extraktion, reverse transcription av target RNA för att generera komplimentärt DNA (cdna) 30, PCR-amplifiering 30 av target cdna med hjälp av HIV-1-specifik kompletterande prime, hybridisering av de amplifierade produkterna till oligonukleotidprober som är target-specifika samt detektion av probbundna amplifierade produkter genom kolorimetrisk bestämning. COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 möjliggör samtidig reverse transcription och PCR-amplifiering av HIV-1 och HIV-1 Quantitation Standard RNA. Master Mix-reagenset innehåller ett primerpar som är specifikt för både HIV-1 RNA och HIV-1 Quantitation Standard RNA och har utvecklats för att ge samma resultat av grupp M-subtyper av HIV-1. Egenskaperna för testet med grupp O-prover har inte fastställts. Kvantifiering av HIV-1 viralt RNA utförs med hjälp av HIV-1 Quantitation Standard. HIV-1 Quantitation Standard är ett icke smittbärande RNA-transkript som innehåller identiska primerbindningsplatser som HIV RNA target och en unik probbindningsregion som möjliggör kvantifieringstandard-amplicon att särskiljas från HIV-1-amplicon. HIV-1 Quantitation Standard är integrerad i varje enskilt prov vid ett känt kopieantal och går genom extraktion, reverse transcription, PCRamplifiering, hybridisering och detektionssteg tillsammans med HIV-1 target och amplifieras tillsammans med HIV-1 target. COBAS AMPLICOR Analyzer beräknar HIV-1 RNA-nivåerna i testproven genom att jämföra HIV-1-signalen med HIV-1 Quantitation Standard-signalen för varje prov. Quantitation Standard kompenserar för effekter av inhibition och kontroller för att amplifieringsprocessen ska få korrekt kvantifiering av HIV-1 RNA i varje prov. Extraktion COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 kan användas med någon av de två extraktionsprocedurerna standardextraktion eller ultrasensitiv extraktion. Vid standardextraktion isoleras HIV-1 RNA direkt från plasma genom lysering av viruspartiklar med ett kaotropiskt ämne, följt av utfällning av RNA med alkohol. Med ultrasensitiv extraktion koncentreras först HIV-1-viruspartiklar i plasma genom ultracentrifugering, följt av lysering av viruspartiklar med en kaotropisk agens och utfällning av HIV-1 RNA med alkohol. Ett känt antal kvantifieringsstandard-rna-molekyler introduceras i varje prov med lyseringsreagens. HIV-1 Quantitation Standard går genom extraktion, reverse transcription, amplifiering och detektionssteg och används för kvantifiering av HIV-1 RNA i testprovet. 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 3/51

Reverse Transcription och PCR-amplifiering Val av target Urvalet av target RNA-sekvens för HIV-1 beror på identifieringen av regioner inom HIV-1-genomen som visar maximal konsekvens. Dessutom är korrekt urval av primers och prob mycket viktigt för att testet ska kunna detektera HIV-1- genotypen. COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 använder primers SK145 och SKCC1B för att definiera en sekvens av 155 nukleotider inom den konserverade regionen för HIV-1 gag gen 31. gag-regionen kodar för de gruppspecifika antigenerna eller kärnproteinerna på virionet. HIV-1 gag-gener är generellt ca 1500 nukleotider I längd och placerade vid de ungefärliga positionerna 789 2290 i HIV-genomen. Nukleotidsekvensen för primers har optimerats för att ge samma amplifiering för grupp M-subtyper av HIV-1. Reverse Transcription Reverse transcription- och PCR-amplifieringsreaktionerna utförs med det värmebeständiga rekombinanta enzymet Thermus thermophilus DNA-polymeras (rtth pol). Vid förekomst av mangan och under korrekta buffertförhållanden har rtth pol både reverse transkriptas och DNA-polymerasaktivitet 30. Detta gör att såväl reverse transcription som PCR-amplifiering kan ske i samma reaktionsblandning. Bearbetade prover tillsätts till amplifieringsblandningen i amplifieringsrör (A-rör) i vilka såväl reverse transcription som PCR-amplifiering sker. Nedströms- eller antisensprimern (SKCC1B) och uppströms- eller sensprimern (SK145) biotinyleras vid 5'-ändarna. Reaktionsblandningen värms så att nedströmsprimern kan binda specifikt till HIV-1 target RNA och till HIV-1 Quantitation Standard RNA. Vid förekomst av Mn 2+ och överskott av deoxynukleosidtrifosfater (dntps), inklusive deoxyadenosin-, deoxyguanosin-, deoxycytidin-, deoxyuridinoch deoxythymidintrifosfater, förlänger rtth pol den bundna primern och bildar en DNA-sträng (cdna) som är komplementär till RNA target. Amplifiering av target Efter reverse transcription av HIV-1 target RNA och HIV-1 Quantitation Standard RNA så värms reaktionsblandningen för att denaturera RNA:cDNA-hybriden och exponera målsekvenserna för primern. När blandningen svalnar binder uppströmsprimern (SK145) specifikt till cdna-strängen, rtth pol förlänger primern och en andra DNA-sträng syntetiseras. Detta avslutar den första PCRcykeln och ger en dubbelsträngad DNA-kopia av målregionen på HIV-1 RNA och HIV-1 Quantitation Standard RNA. Reaktionsblandningen värms igen så att den bildade dubbelsträngade DNA-kedjan separeras och primer-målsekvenserna exponeras. När blandningen svalnar binder SK145- och SKCC1B-primer till target DNA. rtth pol förlänger i närvaro av Mn 2+ och överskotts-dntp bundna primers längs målmallarna och producerar en 155-baspars, dubbelsträngad DNAmolekyl som kallas en amplicon. COBAS AMPLICOR Analyzer upprepar automatiskt detta förfarande ett angivet antal cykler, varvid varje cykel effektivt fördubblar mängden amplicon-dna. Amplifiering förekommer endast i regionen för HIV-1-genomen mellan primers. Hela HIV-1-genomen amplifieras inte. 4/51 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

HIV-1 MONITOR Selektiv amplifiering Selektiv amplifiering av target-nukleinsyra från kliniska prover kan göras med testet COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 genom att använda AmpErase-enzym (uracil-n-glycosylase) och deoxinuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet identifierar och katalyserar nedbrytning av DNA-strängar som innehåller deoxiuridin 32, men inte DNA som innehåller deoxitymidin. Deoxiuridin finns inte i naturligt förekommande DNA, men finns alltid i amplicon på grund av användningen av deoxiuridintrifosfat som en av dntps i Master Mix-reagens. Därför innehåller endast amplicon deoxiuridin. Deoxyuridin gör kontaminerande amplicon känsligt för nedbrytning av AmpErase-enzym före amplifiering av target DNA. AmpErase-enzym, som ingår i Master Mix-reagenset, katalyserar klyvning av deoxyuridin-innehållande DNA vid deoxyuridinresterna genom att öppna deoxyriboskedjan vid C1-positionen. Vid uppvärmningen i det första värmecykelsteget vid alkaliskt ph på Master Mix brister amplicon-dna-kedjan i deoxyuridinpositionen, varvid DNA-kedjan blir icke-amplifierbar. AmpEraseenzym är inaktivt vid temperaturer över 55 ºC, d.v.s. genom värmecykelstegen och förstör därför inte target amplicon. Efter amplifiering denatureras eventuell återstående enzym genom tillsats av denatureringslösning, vilket förhindrar nedbrytning av target amplicon. AmpErase-enzymet i COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 har visat sig inaktivera minst 10 3 kopior av deoxiuridininnehållande HIV-1 amplicon per PCR. Hybridiseringsreaktion Efter PCR-amplifiering tillsätter COBAS AMPLICOR Analyzer automatiskt denatureringslösning till A-rören för kemisk denaturering av HIV-1-amplicon och HIV-1 Quantitation Standard-amplicon och bildande av enkelsträngat DNA. För kvantitativa resultat över ett stort dynamiskt intervall späder COBAS AMPLICOR Analyzer denaturerad amplicon i detektionskopparna (D-koppar). En suspension av magnetpartiklar täckta med en oligonukleotidprob som är specifik för antingen HIV-1-amplicon (SK102) eller HIV-1 Quantitation Standard-amplicon (CP35) tillsätts till var och en av fyra spädningar av HIV-1-amplicon respektive till var och en av två spädningar av HIV-1 Quantitation Standard-amplicon. Biotinmärkt amplicon hybridiseras till den målspecifika oligonukleotidproben som är bunden till magnetpartiklarna. Varje kvantitativ bestämning kräver fyra oberoende mätningar av reagensabsorbans med hjälp av HIV-1 probsuspension och två absorbansmätningar med HIV-1 Quantitation Standard probsuspension. Detektionsreaktion Efter hybridiseringsreaktionen tvättar COBAS AMPLICOR Analyzer magnetpartiklarna i D-kopparna så att obundet material avlägsnas och tillsätter sedan avidin-hrp. Avidin-HRP binder till biotinmärkt amplicon som hybridiseras till målspecifika oligonukleotidprober vilka är bundna till magnetpartiklarna. COBAS AMPLICOR Analyzer avlägsnar obundet konjugat genom tvättning av magnetpartiklarna och tillsätter sedan en substratlösning som innehåller väteperoxid och 3,3',5,5'-tetrametylbensidin (TMB) till varje D-kopp. I närvaro av väteperoxid katalyserar partikelbundet HRP oxidation av TMB så att ett färgat komplex bildas, vars absorbans mäts av COBAS AMPLICOR Analyzer vid en våglängd på 660 nm. 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 5/51

HIV-1 RNA-kvantifiering Total HIV-1 A AF Total QS A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 kvantifierar HIV-1 viralt RNA genom att utnyttja en andra målsekvens (HIV-1 Quantitation Standard) som tillsätts till testprovet i känd koncentration. HIV-1 Quantitation Standard är en icke smittbärande, 233 nukleotid in vitro transkriberad RNA-molekyl med primerbindningsregioner som är identiska med HIV-1-målsekvensens. HIV-1 Quantitation Standard innehåller SK145 och SKCC1B primerbindningsställen och genererar en amplifieringsprodukt av samma längd (155 baser) och baskomposition som HIV-1 target RNA. Probbindningsregionen hos HIV-1 Quantitation Standard-amplicon har modifierats så att HIV 1 Quantitation Standard-amplicon kan särskiljas från HIV-1 target-amplicon. Inom analysens linjära intervall är absorbansen vid 660 nm (A 660 ) för varje D-kopp proportionellt till mängden HIV-1-amplicon eller HIV-1 Quantitation Standard-amplicon i D-koppen. COBAS AMPLICOR Analyzer beräknar total HIV-1-absorbans och total HIV-1 Quantitation Standard-absorbans genom att multiplicera absorbansen för D-kopp med amplicon-spädningsfaktorn för D-kopp och väljer sedan den D-kopp som har maximal total absorbans. Beräknad total absorbans är proportionell till den mängd HIV-1 RNA eller HIV-1 Quantitation Standard RNA som förekommer i varje reverse transcription-/pcramplifieringsreaktion. Mängden HIV-1 RNA i varje prov beräknas sedan ur förhållandet mellan total HIV-1-absorbans och total HIV-1 Quantitation Standardabsorbans samt input-antalet HIV-1 Quantitation Standard RNA-molekyler med användning av följande ekvation: [ ] x Input HIV-1 QS-kopior/PCR x provvolymfaktor = HIV-1 RNA-kopior/ml Varvid: Total HIV-1 A = beräknad total absorbans för HIV-1-amplicon Total QS A = beräknad total absorbans för Quantitation Standardamplicon Input HIV-1 QS kopior/pcr = antalet kopior av Quantitation Standard i varje reaktion. Detta antal är lotspecifikt Provvolymfaktor = faktor för omvandling av kopior/pcr till kopior/ml AF = justeringsfaktor för standardisering av COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR v1.5-testresultat till AMPLICOR HIV-1 MONITOR v1.5-testresultat (justeringsfaktor = 1,11). Provvolymfaktor = 40 (för standardextraktion) Provvolymfaktor = 4 (för ultrasensitiv extraktion) 6/51 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

HIV-1 MONITOR Reagenser COBAS AMPLICOR HIM 48 test P/N: 21118390 123 HIV-1 MONITOR Test, ART: 11 1839 0 version 1.5 US: 83369 Extraktionsreagenser HIM PREP HIV-1 LYS (HIV-1 MONITOR lyseringsreagens) Tris-HCl-buffert 68 % guanidintiocyanat 3 % ditiotreitol < 1 % glykogen + Xn 68 % (viktprocent) guanidintiocyanat 4 x 9,0 ml Hälsoskadlig HIV-1 QS, v1.5 4 x 0,1 ml (HIV-1 MONITOR kvantifieringsstandard, version 1.5) < 0,001 % icke smittbärande in vitro transkriberad RNA (mikrobiell) innehållande HIV-1 primerbindningsekvenser och en unik probbindningsregion < 0,005 % poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05 % natriumazid HIV-1 DIL (HIV-1 MONITOR spädningsmedel) Tris-HCl-buffert < 0,005 % poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05 % natriumazid 4 x 4,8 ml Kontrollreagenser HIM CTL NHP 4 x 1,6 ml [Negativ plasma (human)] Human plasma, icke-reaktiv enligt FDA-licensierade test för antikropp mot HCV, antikropp mot HIV-1/2, HIV p24 antigen och HBsAg. Inget HIV-1 RNA, HCV RNA eller HBV DNA detekterat enligt PCR i poolade blodgivarenheter. Ingen HBV kärnantikropp detekterad i poolade blodgivarenheter enligt ett FDA-licensierat test. 0,1 % ProClin 300 konserveringsmedel HIV-1 ( ) C [HIV-1 ( )-kontroll] < 0,005 % poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05 % natriumazid 4 x 0,05 ml 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 7/51

HIV-1 L(+)C [HIV-1 MONITOR låg (+)-kontroll] < 0,001 % icke smittbärande in vitro transkriberad RNA (mikrobiell) innehållande HIV-1-sekvenser < 0,005 % poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05 % natriumazid HIV-1 H(+)C [HIV-1 MONITOR hög (+)-kontroll] < 0,001 % icke smittbärande in vitro transkriberad RNA (mikrobiell) innehållande HIV-1-sekvenser < 0,005 % poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05 % natriumazid Amplifieringsreagenser HIM AMP 4 x 0,05 ml 4 x 0,05 ml HIV-1 MMX, v1.5 4 x 0,7 ml (HIV-1 MONITOR huvudblandning, version 1.5) Bicine-buffert Glycerol < 0,01 % rtth DNA polymeras (rtth pol, mikrobiell) Kaliumacetat < 0,07 % datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,001 % SKCC1B och SK145 primers biotinylerade < 0,01 % AmpErase-enyzm (uracil-n-glykosylas, mikrobiell) 0,05 % natriumazid HIV-1 Mn 2+, v1.5 (HIV-1 MONITOR manganlösning, version 1.5) < 2 % mangan Ättiksyra Amarant-färgämne 0,05 % natriumazid 4 x 0,1 ml Specifika detektionsreagenser HIM DK AD3 (Amplicon spädningsreagens) EDTA 0,8 % natriumhydroxid + Xi 0,8 % (viktprocent) natriumhydroxid 2 x 75 test Irriterande IM PS1, v1.5 2 x 100 test (HIV-1 MONITOR probsuspension 1, version 1.5) MES-buffert < 0,01 % suspension av Dynabeads (paramagnetiska partiklar) täckta med HIV-1 Quantitation Standard-specifik oligonukleotid infångningsprob SK102 0,09 % natriumazid 8/51 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

HIV-1 MONITOR IM4, v1.5 (HIV-1 MONITOR probsuspension 2, version 1.5) Natriumfosfatbuffert < 0,2 % detergent 24,9 % natriumtiocyanat IQ PS1, v1.5 (HIV-1 MONITOR kvantifieringsstandard, probsuspension 1, version 1.5) MES-buffert < 0,01 % suspension av Dynabeads (paramagnetiska partiklar) täckta med HIV-1 Quantitation Standardspecifik oligonukleotid infångningsprob CP35 0,09 % natriumazid IQ4, v1.5 (HIV-1 MONITOR kvantifieringsstandard, probsuspension 2, version 1.5) Natriumfosfatbuffert < 0,2 % detergent 24,9 % natriumtiocyanat 2 x 100 test 1 x 100 test 1 x 100 test Generiska detektionsreagenser DK DN4 (Denatureringslösning) 1,6 % natriumhydroxid EDTA Tymolblått + Xi 1,6 % (viktprocent) natriumhydroxid 1 x 100 test Irriterande CN4 (Avidin-HRP) Tris-HCl-buffert < 0,001 % Avidin-HRP Bovint serumalbumin (mammalie) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1 % fenol 1 % ProClin 150 konserveringsmedel SB3 (Substrat A) Citratlösning 0,01 % väteperoxid 0,1 % ProClin 150 konserveringsmedel 3 x 100 test 5 x 75 test 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 9/51

SB (Substrat B) 0,1 % 3,3',5,5'-tetrametylbensidin (TMB) 40 % dimetylformamid (DMF) T 40 % (viktprocent) dimetylformamid (DMF) 5 x 5 ml Giftig R: 61 20/21 36 Kan ge fosterskador. Farligt vid inandning och hudkontakt. Irriterar ögonen. S: 53 45 Undvik exponering Begär specialinstruktioner före användning. Vid olycksfall, illamående eller annan påverkan, kontakta omedelbart läkare. Visa om möjligt etiketten. COBAS AMPLICOR WB 500 test P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR Tvättbuffert US: 83314 WB (10X-tvättkoncentrat) < 2 % fosfatbuffert < 9 % natriumklorid EDTA < 2 % detergent 0,5 % ProClin 300 konserveringsmedel 2 x 250 test Varningar och säkerhetsåtgärder För in vitro-diagnostisk användning. Detta test är endast avsett att användas med human plasma som samlats i EDTA- eller ACD-antikoagulantia. Heparin har visat sig hämma PCR och får inte användas med detta förfarande. Pipettera inte med munnen. Ät, drick eller rök inte i laboratorium. Använd engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar prover och kitets reagenser. Tvätta händerna noga efter hantering av prover och kitets reagenser. Undvik mikrobiell och ribonukleassmitta av reagenserna när portioner tas från reagensflaskor. Användning av sterila engångspipetter och RNase-fria pipettspetsar rekommenderas. Sammanför inte reagenser från olika lot eller från olika flaskor i samma lot. Forsla undan oanvända reagenser och avfall enligt gällande nationella, regionala och lokala föreskrifter. Använd inte ett kit efter utgångsdatum. 10/51 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

HIV-1 MONITOR Kontakta närmaste Roche-kontor om du vill erhålla informationsblad om materialsäkerhet (MSDS). Arbetsgången på laboratoriet ska börja i pre-amplifieringsområdet och fortsätta mot post-amplifieringsområdet (amplifiering/detektion). Pre-amplifieringsarbetena ska börja med reagensberedning och fortsätta till extraktion. Förbrukningsmaterial och utrustning ska speciellt tilldelas varje pre-amplifieringsarbete och får inte användas för andra arbeten eller flyttas mellan områden. Handskar ska användas i alla områden. Byt handskar innan ett område lämnas. Utrustning och förbrukningsmaterial som används för reagensberedning får inte användas för extraktion eller för pipettering eller bearbetning av amplifierat DNA eller andra källor för target DNA. Förbrukningsmaterial och utrustning för post-amplifiering ska alltid stanna kvar i postamplifieringsområdet. Prover ska behandlas som smittbärande i enlighet med säkra laboratorierutiner som exempelvis de rutiner som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 33 och i CLSI-dokument M29-A3 34. Rengör och desinficera noga alla arbetsytor med nyberedd lösning bestående av 0,5 % natriumhypoklorit i avjoniserat eller destillerat vatten. Obs! Vanliga hushållsblekmedel innehåller normalt 5,25 % natriumhypoklorit. En utspädning 1:10 med hushållsblekmedel ger en lösning med 0,5 % natriumhypoklorit. VARNING: Detta kit innehåller en komponent (NHP) som härstammar från humant blod. Källmaterialet har testats med FDA-godkända tester och befunnits ickereaktivt för antikropp mot HCV, antikropp mot HIV-1/2, HIV p24 antigen och hepatit B ytantigen (HBsAg). Dessutom har poolade blodgivarenheter testats. Inget HIV-1 RNA, HCV RNA eller HBV DNA detekterades med PCR och ingen HBV kärnantikropp detekterades med ett FDA-licensierat test. Det finns inga testmetoder som ger fullständig säkerhet för att produkter från humant blod inte kan överföra smitta. Allt material av humant ursprung ska därför anses som potentiellt smittsamt. NHP ska behandlas som smittbärande i enlighet med säkra laboratorierutiner som exempelvis de rutiner som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 33 och i CLSI-dokument M29-A3 34. Rengör och desinficera noga alla arbetsytor med 0,5 % natriumhypoklorit i avjoniserat eller destillerat vatten. HIV-1 QS, v1.5; HIV-1 DIL; HIV-1 MMX, v1.5; HIV-1 Mn 2+, v1.5; HIV-1 ( ) C; HIV-1 L(+)C; HIV-1 H(+)C; IM PS1, v1.5 och IQ PS1, v1.5 innehåller natriumazid. Natriumazid kan reagera med bly- eller kopparrör och bilda mycket explosiva metallazider. Förhindra aziduppbyggnad genom att spola med mycket vatten om lösningar som innehåller natriumazid hälls ut i avloppet. Använd skyddsglasögon, laboratorierock och engångshandskar vid hantering av HIV-1 LYS; HIV-1 MMX, v1.5; DN4; AD3; IM4, v1.5; IQ4, v1.5; CN4; SB3; SB och Working Substrate (blandad SB3 och SB reagens). Undvik att dessa material kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med stora mängder vatten vid eventuell kontakt. Brännskador kan annars uppstå. Vid spill av dessa reagenser, späd med vatten innan spillet torkas upp. Undvik att SB eller Working Substrate kommer i kontakt med hud eller slemhinnor. Vid kontakt med huden, tvätta genast med stora mängder vatten. SB och Working Substrate innehåller dimetylformamid som har rapporterats vara giftigt i höga orala doser och kan ge fosterskador. Undvik hudkontakt, inandning av rök och förtäring. Vid kontakt med huden, tvätta noga med tvål och vatten och kontakta omedelbart läkare. 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 11/51

Förvaring och hantering Se till att inte HIV-1 LYS, som innehåller guanidintiocyanat eller IM4, v1.5 och IQ4, v1.5 som innehåller natriumtiocyanat, kommer i kontakt med natriumhypokloritlösning (blekmedel). Dessa blandningar kan bilda en mycket giftig gas. Rör med skruvkork ska användas vid prov- och kontrollextraktion för att hindra stänk och möjlig överföring av smitta mellan prov. Rör med snäpplock får inte användas. Frys inte reagenser. Förvara HIV-1 LYS, HIV-1 QS, v1.5 och HIV-1 DIL i 2 8 C. I oöppnad förpackning är dessa reagenser hållbara till angivet utgångsdatum. När förpackningen öppnats ska en eventuellt oanvänd del av innehållet kasseras. Det bildas en fällning i HIV-1 LYS vid förvaring i 2 8 C. Före användning ska fällningen lösas upp genom att HIV-1 LYS värms till 25 37 C. Värm HIV-1 LYS i högst 30 minuter och blanda sedan noga tills kristallerna har lösts upp. Före användning ska varje flaska HIV-1 LYS undersökas mot en vit bakgrund. Titta efter förekomst av en gul färg eller tecken på läckage. Använd inte en flaska om innehållet verkar gult eller det finns tecken på läckage. Kontakta din Roche-representant för utbyte. När förpackningen öppnats ska en eventuellt oanvänd del av innehållet kasseras. Working Lysis Reagent (beredd genom tillsats av HIV-1 QS, v1.5 till HIV-1 LYS) ska förvaras i rumstemperatur och användas inom 4 timmar efter beredning. Förvara HIV-1 MMX, v1.5 och HIV-1 Mn 2+, v1.5 i 2 8 ºC. Dessa reagenser är hållbara till det angivna utgångsdatumet. När förpackningen öppnats måste eventuellt oanvänd del av innehållet kasseras. Working Master Mix (beredning genom tillägg av HIV-1 Mn 2+, v1.5 till HIV-1 MMX, v1.5) ska förvaras i 2 8 ºC och är hållbar i 4 timmar i 2 8 ºC. Förvara NHP, HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C och HIV-1 H(+)C i 2 8 ºC. Dessa reagenser är hållbara till det angivna utgångsdatumet. När förpackningen öppnats ska en eventuellt oanvänd del av innehållet kasseras. Förvara AD3 i 2 25 ºC. När AD3 laddats på COBAS AMPLICOR Analyzer är AD3 hållbar i 30 dagar i 2 8 C, dock längst till angivet utgångsdatum. AD3 kan användas för högst 4 instrumentcykler (24 timmar per cykel) och ska förvaras i 2 8 C mellan instrumentcykler. Förvara IM PS1, v1.5 och IM4, v1.5 i 2 8 C. Dessa reagenser är hållbara till det angivna utgångsdatumet. Efter att IM PS1, v1.5 och IM4, v1.5 har blandats, är Working Reagent hållbart i 14 dagar i 2 8 C. Working Reagent kan användas till högst 2 instrumentcykler (24 timmar per cykel) och ska förvaras i 2 8 C mellan instrumentcykler. Förvara IQ PS1, v1.5 och IQ4, v1.5 i 2 8 C. Dessa reagenser är hållbara till det angivna utgångsdatumet. Efter att IQ PS1, v1.5 och IQ4, v1.5 har blandats, är Working Reagent hållbart i 30 dagar i 2 8 C. Working Reagent kan användas till högst 4 instrumentcykler (24 timmar per cykel) och ska förvaras i 2 8 C mellan instrumentcykler. 12/51 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

HIV-1 MONITOR Material som medföljer Förvara DN4 i 2 25 C. DN4 är hållbart till angivet utgångsdatum. Efter att förpackningen öppnats är DN4 hållbart i 30 dagar i 2 8 C, dock längst till angivet utgångsdatum. DN4 kan användas för högst 4 instrumentcykler (24 timmar per cykel) och ska förvaras i 2 8 C mellan instrumentcykler. Förvara CN4 i 2 8 ºC. CN4 är hållbart till angivet utgångsdatum. Efter att förpackningen öppnats är CN4-reagens hållbart i 30 dagar i 2 8 C, dock längst till angivet utgångsdatum. CN4 kan användas för högst 4 instrumentcykler (24 timmar per cykel) och ska förvaras i 2 8 C mellan instrumentcykler. Förvara SB3 och SB i 2 8 C. I oöppnad förpackning är dessa reagenser hållbara till angivet utgångsdatum. Working Substrate ska beredas varje dag genom blandning av SB3 med SB. Working Substrate är hållbart i 16 timmar i COBAS AMPLICOR Analyzer. Utsätt inte SB3, SB eller Working Substrate för metaller, oxideringsmedel eller direkt ljus. Förvara WB i 2 30 C. WB är hållbart till angivet utgångsdatum. Undersök WB före spädning och värm vid behov i 30 37 C så att eventuell fällning löses upp. Working Wash Buffer (1X) som beretts genom spädning 1:10 av WB med destillerat eller avjoniserat vatten ska förvaras i 2 25 C i COBAS AMPLICOR tvättbuffertbehållare och är hållbar i 2 veckor från beredningdatum. Förvara delvis använda detektionsreagenser i 2 8 C mellan instrumentkörningarna. Kontrollera utgångsdatum för Working Reagents innan de laddas i COBAS AMPLICOR Analyzer. COBAS AMPLICOR HIM P/N: 21118390 123 HIV-1 MONITOR Test, ART: 11 1839 0 version 1.5 US: 83369 Extraktionsreagenser HIM PREP HIV-1 LYS (HIV-1 MONITOR lyseringsreagens) HIV-1 QS, v1.5 (HIV-1 MONITOR kvantifieringsstandard, version 1.5) HIV-1 DIL (HIV-1 MONITOR spädningsmedel) Kontrollreagenser HIM CTL NHP [Negativ plasma (human)] HIV-1 ( ) C [HIV-1 ( )-kontroll] HIV-1 L(+)C [HIV-1 MONITOR låg (+)-kontroll] HIV-1 H(+)C [HIV-1 MONITOR hög (+)-kontroll] 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 13/51

Amplifieringsreagenser HIM AMP HIV-1 MMX, v1.5 (HIV-1 MONITOR huvudblandning, version 1.5) HIV-1 Mn 2+, v1.5 (HIV-1 MONITOR manganlösning, version 1.5) Specifika detektionsreagenser HIM DK AD3 (Amplicon spädningsreagens) IM PS1, v1.5 (HIV-1 MONITOR probsuspension 1, version 1.5) IM4, v1.5 (HIV-1 MONITOR probsuspension 2, version 1.5) IQ PS1, v1.5 (HIV-1 MONITOR kvantifieringsstandard, probsuspension 1, version 1.5) IQ4, v1.5 (HIV-1 MONITOR kvantifieringsstandard, probsuspension 2, version 1.5) Generiska detektionsreagenser DK DN4 (Denatureringslösning) CN4 (Avidin-HRP) SB3 (Substrat A) SB (Substrat B) COBAS AMPLICOR WB P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR Tvättbuffert US: 83314 WB (10X-tvättkoncentrat) Material som behövs men som inte medföljer Pre-amplifiering reagensberedningsområde - COBAS AMPLICOR A-ring utrustad med 12 A-tubes - COBAS AMPLICOR A-ringhållare - Eppendorf Multipette pipett med 1,25 ml Eppendorf Combitip behållare (steril, styckförpackad) - Pipetter (kapacitet 50 µl och 100 µl)* med RNase-fria spetsar och aerosolbarriär eller positiv förskjutning - Engångshandskar, puderfria 14/51 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

HIV-1 MONITOR Pre-amplifiering prov- och kontrollextraktionsområde - 2,0 ml rör med skruvkork, sterila, (Sarstedt 72.694.006 eller motsvarande)** - 1,5 ml rör med skruvkork, sterila, (Sarstedt 72.692.105 eller motsvarande)** - Rörrack (Sarstedt 93.1428 eller motsvarande) - 95-procentig etanol, för molekylärbiologi eller histologi (används nyspädd till 70 % med destillerat eller avjoniserat vatten) - Isopropylalkohol, reagenskvalitet - Sterila transferpipetter med fin spets, RNase-fria - Sterila serologiska engångspipetter av polystyren (5 ml, 10 ml och 25 ml) - Pipetter (kapacitet 12,5 µl, 25 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl, 500 µl, 600 µl, 800 µl och 1000 µl)* med RNase-fria spetsar och aerosolbarriär eller positiv förskjutning - Mikrocentrifug (max. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M eller motsvarande - Kyld ultracentrifug och rotor med fast vinkel (45 grader, kapacitet för minst 24 st. 1,5 ml rör) med en RCF på 23 600 x g (Heraeus 17RS med rotor HFA 22.1, Biofuge 28RS, eller motsvarande) - Vortexblandare - Engångshandskar, puderfria Post-amplifiering amplifierings-/detektionsområde - COBAS AMPLICOR Analyzer och skrivare - Användarhandbok för COBAS AMPLICOR Analyzer Tillval: Programmet AMPLILINK inklusive: Datastation för programmet AMPLILINK, med skrivare Användarhandbok till programmet AMPLILINK version 2.4-serien för användning med analysinstrumentet COBAS AMPLICOR (för användning med programmet AMPLILINK, v2.41) eller applikationshandbok till programmet AMPLILINK version 3.2-serien för användning med instrumentet COBAS AmpliPrep, analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 och analysinstrumentet COBAS AMPLICOR (för användning med programmet AMPLILINK v3.2-serien) - Rack för D-koppar - Destillerat eller avjoniserat vatten - 5 ml serologiska pipetter - Vortexblandare - Engångshandskar, puderfria * Pipetterna ska ha en noggrannhet inom 3 % av angiven volym. RNase-fria spetsar med aerosolbarriär eller positiv förskjutning ska användas då så anges för att hindra överföring av smitta mellan prov och amplicon. ** Rör med skruvkork ska användas för prov- och kontrollextraktion för att hindra stänk och möjlig överföring av smitta mellan prov och kontroller. Rör med snäpplock får inte användas. 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 15/51

Provtagning, transport och förvaring av prover Obs! Provtagning Hantera alla prover som potentiellt smittbärande. COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 är endast avsett att användas tillsammans med plasmaprover. Blod ska tas i sterila rör med EDTA (lila propp) eller ACD (gul propp) som antikoagulant. Prover som antikoagulerats med heparin är inte lämpliga för detta test. Förvara helblod i 2 25 C i högst 6 timmar. Användning av prover som antikoagulerats med ACD ger testresultat som är omkring 15 % lägre än testresultat från prover med EDTA, vilket beror på spädningseffekten av 1,5 ml ACD i blodprovsröret. Figur 1 visar effekten av antikoagulanterna ACD och EDTA på HIV-1 RNA-resultat från plasmaprover. Figur 1 Jämförelse mellan antikoagulanterna ACD och EDTA* * De data som visas i Figur 1 har tagits fram med hjälp av testet AMPLICOR HIV-1 MONITOR med standardextraktion. Separera plasma från helblod inom 6 timmar efter provtagning genom centrifugering i 800 1 600 x g i 20 minuter i rumstemperatur. Överför plasman till ett sterilt polypropylenrör. Transport av prover Förvaring av prover Vid transport av helblod eller plasma ska gällande bestämmelser för etiologiska agens följas 35. Helblod ska transporteras i 2 25 C och bearbetas inom 6 timmar efter provtagning. Plasma kan transporteras i 2 8 C eller frusen i 20 till 80 C. Plasmaprover kan förvaras i rumstemperatur i upp till 1 dag, i 2 8 C i upp till 5 dagar eller frusna i 20 till 80 C. Prover bör förvaras i portioner om 600 700 µl i sterila 2,0 ml polypropylenrör med skruvkork (till exempel Sarstedt 72.694.006). Plasmaprover kan frysas och tinas upp till tre gånger. Figur 2 visar data från dessa frys-tiningsstudier. 16/51 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

HIV-1 MONITOR Figur 2 Genomsnittliga HIV-1-resultat från tre pooler HIV-1-positiv plasma efter 2, 3 och 4 frys-tiningscykler* Bruksanvisning Obs! * De data som visas i Figur 2 har tagits fram med hjälp av testet AMPLICOR HIV-1 MONITOR med standardextraktion. Detaljerad information om användning, utskrift av resultat och tolkning av flaggor och kommentarer finns i (1) användarhandboken till analysinstrumentet COBAS AMPLICOR och (2) vid användning av programmet AMPLILINK, v2.41, i användarhandboken till programmet AMPLILINK version 2.4-serien för användning med analysinstrumentet COBAS AMPLICOR eller, vid användning av programmet AMPLILINK v3.2-serien, i applikationshandboken till programmet AMPLILINK version 3.2-serien för användning med instrumentet COBAS AmpliPrep, analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 och analysinstrumentet COBAS AMPLICOR. Obs! Obs! Obs! Obs! Omgångsstorlek Samtliga reagenser ska ha rumstemperatur före användning. Inspektera alla reagenser visuellt innan testet påbörjas så att reagensvolymen är tillräcklig. Plasmaprover ska ha rumstemperatur före användning. Använd pipetter med spets med aerosolbarriär eller positiv förskjutning om så anges. Var ytterst noga med att säkerställa selektiv amplifiering. Rör med skruvkork ska användas vid prov- och kontrollextraktion för att hindra stänk och möjlig överföring av smitta mellan prov. Rör med snäpplock får inte användas. Testet COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v 1.5 ska endast köras i Basic-läge. Varje kit innehåller reagens för fyra omgångar med 12 tester, vilka kan utföras separat eller som två körningar med 24 tester vardera. Maximalt antal prover per testomgång är 24 (21 prover + 3 kontroller). Minst ett replikat vardera av AMPLICOR HIV-1 ( ) Control, AMPLICOR HIV-1 MONITOR Low (+) Control och AMPLICOR HIV-1 MONITOR High (+) Control ska ingå i varje testomgång (se avsnittet Kvalitetskontroll ). Extraktions- och amplifieringsreagenserna är förpackade i engångsflaskor för 12 tester. Reagenserna utnyttjas bäst om prover och kontroller bearbetas i grupper som är multiplar av 12. 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 17/51

Obs! Arbetsflöde Reagensberedning Testet COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v 1.5 ska endast köras i Basic-läge. COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test v1.5 kan slutföras på en dag eller delas upp på två dagar. Följ anvisningarna i avsnitten Reagensberedning, Prov- och kontrollextraktion samt Reverse transcription, amplifiering och detektion i tur och ordning, om testet ska slutföras på en arbetsdag. Testet kan slutföras under 2 dagar genom att starta prov- och kontrollextraktion dag 1, följt av reagensberedning och reverse transcription, amplifiering och detektion dag 2. Om prov- och kontrollextraktion ska utföras dag 1 och reverse transcription, amplifiering och detektion dag 2, så utför antingen standardextraktion av prov och kontroll (steg A.1 till A.14) eller ultrasensitiv extraktion av prov och kontroll (steg B.1 till B.19) och förvara de behandlade proverna enligt anvisningarna i steg A.14 eller B.19. Börja dag 2 med reagensberedning, tina sedan de behandlade proverna och kontrollerna i rumstemperatur, och fortsätt med standardextraktion av prov och kontroll, steg A.15, eller ultrasensitiv extraktion av prov och kontroll, steg B.20, till reverse transcription, amplifiering och detektion. Utförd i: Pre-amplifiering reagensberedningsområdet 1. Fastställ det antal A-ringar som behövs för testning av patientprov och kontroller. Placera A-ringarna i A-ringhållaren. 2. Bered Working Master Mix genom att tillsätta 100 µl HIV-1 Mn 2+, v1.5 till en flaska HIV-1 MMX, v1.5. Det är inte nödvändigt att mäta volymen Master Mix. Tillsätt 100 µl HIV-1 Mn 2+, v1.5 till hela flaskan HIV-1 MMX, v1.5. Sätt tillbaka korken på röret och blanda väl genom att vända röret 10-15 gånger. Vortexa inte Working Master Mix. Det rosa färgämnet i HIV-1 Mn 2+, v1.5 används för visuell bekräftelse på att HIV-1 Mn 2+, v1.5 har tillsatts till Master Mix. Kassera resterande HIV-1 Mn 2+, v1.5. Working Master Mix ska förvaras i 2 8 C och användas inom 4 timmar efter beredning. 3. Tillsätt 50 µl Working Master Mix till varje A-rör med hjälp av en repetitionspipett eller en pipett med spets som har aerosolbarriär eller positiv förskjutning. Stäng inte skydden på A-rören ännu. Kassera oanvänd Working Master Mix. 4. Placera A-ringarna med Working Master Mix i en återförslutbar plastpåse och förslut påsen ordentligt. Flytta A-ringarna till pre-amplifiering provextraktionsområdet. Förvara A-ring (ar) med Working Master Mix i 2 8 C i pre-amplifiering provextraktionsområdet tills prov- och kontrollextraktionen är klar. Working Master Mix är hållbar i 4 timmar i 2 8 C i A-rör inneslutna i plastpåse. Prov- och kontrollextraktion Obs! Obs! Obs! Utförd i: Pre-amplifiering prov- och kontrollområdet Om tidigare extraherade prover och kontroller ska amplifieras, ska först stegen i avsnittet Reagensberedning utföras. Tina behandlade prover och kontroller i rumstemperatur och fortsätt med Standardextraktion av prov och kontroll, steg A.15 eller Ultrasensitiv extraktion av prov och kontroll, steg B.20. En fällning bildas i HIV-1 LYS vid förvaring i 2 8 C. Värm vid 25 37 C och blanda noga så att det utfällda materialet löses upp före användning. Före användning ska varje flaska HIV-1 LYS undersökas mot en vit bakgrund. Titta efter förekomst av en gul färg eller tecken på läckage. Använd inte en flaska om innehållet verkar gult eller det finns tecken på läckage. Kontakta din Rocherepresentant för utbyte. 18/51 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

HIV-1 MONITOR Standardextraktion av prov och kontroll A.1. A.2. A.3. Bered 70-procentig etanol. Till 12 tester blandas 11,0 ml 95-procentig etanol och 4,0 ml avjoniserat eller destillerat vatten. Märk ett 2,0 ml rör med skruvkork till varje patientprov och märk tre ytterligare rör med HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C respektive HIV-1 H(+)C. Bered Standard Working Lysis Reagent. Vortexa HIV-1 QS, v1.5 i minst 10 sekunder före användning. Till varje grupp om 12 prover och kontroller tillsätts 100 µl HIV-1 QS, v1.5 till en flaska HIV-1 LYS. Blanda väl. Det är inte nödvändigt att mäta volymen HIV-1 LYS. Det rosa färgämnet i HIV-1 QS, v1.5 används för visuell bekräftelse på att HIV-1 QS, v1.5 har tillsatts till HIV-1 LYS. Kassera återstående HIV-1 QS, v1.5. Standard Working Lysis Reagent är hållbart i 4 timmar i rumstemperatur. Obs! Om frusna prover används, tinas proverna i rumstemperatur och vortexas i 3 5 sekunder. Centrifugera provröret något så att provet samlas i botten av röret. Var noga med att inte förorena handskarna vid hantering av prover. A.4. A.5. A.6. A.7. A.8. A.9. Tillsätt 600 µl Standard Working Lysis Reagent till vart och ett av de märkta rören och sätt på kork. Kontrollera att Working Lysis Reagent är rosa för att bekräfta att HIV-1 QS, v1.5 tillsattes HIV-1 LYS. Bered standardkontroller på följande sätt: - Vortexa NHP, HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C och HIV-1 H(+)C i 3 5 sekunder. - Tillsätt 200 µl NHP till vart och ett av de tre kontrollrören. Sätt kork på rören och vortexa i 3 5 sekunder. - Tillsätt 50 µl HIV-1 ( ) C till det rör som är märkt HIV-1 ( ) C och innehåller Standard Working Lysis Reagent och NHP. Sätt kork på röret och vortexa i 3 5 sekunder. - Tillsätt 50 µl HIV-1 L(+)C till det rör som är märkt HIV-1 L(+)C och innehåller Standard Working Lysis Reagent och NHP. Sätt kork på röret och vortexa i 3 5 sekunder. - Tillsätt 50 µl HIV-1 H(+)C till det rör som är märkt HIV-1 H(+)C och innehåller Standard Working Lysis Reagent och NHP. Sätt kork på röret och vortexa i 3 5 sekunder. Tillsätt 200 µl av varje patientprov till de märkta rören med Standard Working Lysis Reagent. Sätt kork på rören och vortexa i 3 5 sekunder. Inkubera prov- och kontrollrören i 10 minuter i rumstemperatur. Ta bort korken på varje prov- och kontrollrör, tillsätt 800 µl 100-procentig isopropylalkohol (rumstempererad), sätt tillbaka korken och vortexa kraftigt i 3 5 sekunder. Endast ett rör får vara öppet åt gången. Gör ett riktningsmärke på varje rör och placera rören i mikrocentrifugen med riktningsmärkena vända utåt så att pelleten kommer att stämma överens med riktningsmärkena. Centrifugera prover och kontroller på högsta hastighet (12 500 16 000 x g) i 15 minuter i rumstemperatur. 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 19/51

A.10. Använd en ny engångstransferpipett med fin spets för varje rör och avlägsna försiktigt supernatanten från varje rör och kassera spetsen. Var noga med att inte rubba pelleten (som eventuellt inte syns). Ta bort så mycket vätska som möjligt utan att röra pelleten. Sug upp supernatanten långsamt och låt vätskan rinna av helt från rörets sidor. Använd inte vakuumaspiration. A.11. Tillsätt 1,0 ml 70-procentig etanol (rumstempererad) till varje rör, återförslut och vortexa i 3 5 sekunder. A.12. Placera rören i en mikrocentrifug med riktningsmärkena vända utåt och centrifugera rören i 5 minuter på högsta hastighet (12 500 16 000 x g) i rumstemperatur. A.13. Använd en ny engångstransferpipett med fin spets för varje rör och ta försiktigt bort supernatanten utan att röra pelleten. Pelleten ska vara klart synlig i detta steg. Ta bort så mycket av supernatanten som möjligt. Etanolrester kan hämma amplifieringen. A.14. Tillsätt 400 µl HIV-1 DIL till varje rör. Sätt tillbaka korken på röret. Vortexa kraftigt ca 10 sekunder för att resuspendera extraherat RNA. Visst olösligt material kan finnas kvar. Amplifiera de behandlade proverna och kontrollerna inom 2 timmar efter beredning. Om amplifiering inte kan startas inom 2 timmar efter beredning kan proverna förvaras frusna vid 20 ºC eller kallare i upp till en vecka med endast en frys-tining. Mer än en frys-tiningscykel kan resultera i förlust av kopieantal. Obs! Om behandlade prover och kontroller har förvarats frusna före amplifiering ska de tinas i rumstemperatur och vortexas i 5 sekunder. Fortsätt därefter med steg A.15. A.15. Tillsätt 50 µl av varje behandlat prov och kontroll till respektive A-rör med Working Master Mix med hjälp av pipett med spets med aerosolbarriär eller positiv förskjutning. Använd en ny spets för varje prov och kontroll. Var noga med att inte överföra eventuellt utfällt material som inte återgått till lösning. Sätt lock på A-rören. A.16. Anteckna positionerna för kontroller och prover i A-ringarna. Amplifieringen ska startas inom 45 minuter efter att de behandlade proverna och kontrollerna tillsatts till A-rören med Working Master Mix. Flytta de behandlade proverna och kontrollerna i A-ringarna till amplifierings-/detektionsområdet. Återstoden av de behandlade proverna kan frysas och förvaras vid 20 C eller kallare i upp till en vecka med högst en frys-tining. Mer än en frys-tiningscykel kan resultera i förlust av kopieantal. Ultrasensitiv extraktion av prov och kontroll B.1. B.2. B.3. B.4. Förkyl ultracentrifug och rotor till 2 8 C enligt beskrivningen i bruksanvisningen till ultracentrifugen. Bered 70-procentig etanol. Till 12 tester blandas 11,0 ml 95-procentig etanol och 4,0 ml avjoniserat eller destillerat vatten. Märk ett 1,5 ml rör med skruvkork till varje patientprov och märk tre ytterligare rör med HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C respektive HIV-1 H(+)C. Bered UltraSensitive Working Lysis Reagent. Vortexa HIV-1 QS, v1.5 i minst 10 sekunder före användning. Till varje grupp om 12 prover och kontroller tillsätts 25 µl HIV-1 QS, v1.5 till en flaska HIV-1 LYS. Blanda väl. Det är inte nödvändigt att mäta volymen HIV-1 LYS. Det rosa färgämnet i HIV-1 QS, v1.5 används för visuell bekräftelse på att HIV-1 QS, v1.5 har tillsatts till HIV-1 LYS. Kassera återstående HIV-1 QS, v1.5. UltraSensitive Working Lysis Reagent är hållbart i 4 timmar i rumstemperatur. 20/51 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

HIV-1 MONITOR Obs! Obs! Om frusna prover används, tinas proverna i rumstemperatur och vortexas i 3 5 sekunder. Centrifugera provröret något så att provet samlas i botten av röret. Var noga med att inte förorena handskarna vid hantering av prover. B.5. B.6. B.7. B.8. Tillsätt 500 µl av varje patientprov till de märkta rören. Tillsätt 500 µl NHP till vart och ett av de märkta kontrollrören. Gör ett riktningsmärke på varje rör och placera rören i ultracentrifugen med riktningsmärkena vända utåt så att pelleten kommer att stämma överens med riktningsmärkena. Centrifugera prover och kontroller i 23 600 x g i 60 minuter i 2 8 C. Använd en ny engångstransferpipett med fin spets för varje rör och avlägsna försiktigt supernatanten från varje rör och kassera den. Var noga med att inte röra pelleten (som eventuellt inte syns). Ta bort så mycket vätska som möjligt utan att röra pelleten. Sug upp supernatanten långsamt och låt vätskan rinna av helt från rörets sidor. Använd inte vakuumaspiration. Viruspelletar som erhållits från steg B.8 i den ultrasensitiva extraktionen är hållbara i upp till 6 timmar i rumstemperatur och minst 14 dagar i 20 ºC eller kallare. B.9. Tillsätt 600 µl Working Lysis Reagent till vart och ett av de märkta rören och sätt på kork. Kontrollera att Working Lysis Reagent är rosa för att bekräfta att HIV-1 QS, v1.5 tillsattes HIV-1 LYS. Vortexa röret i 3 5 sekunder för att resuspendera pelleten. B.10. Bered ultrasensitivkontroller på följande sätt: - Vortexa HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C och HIV-1 H(+)C i 3 5 sekunder. - Tillsätt 12,5 µl HIV-1 ( ) C till röret som är märkt HIV-1 ( ) C med UltraSensitive Working Lysis Reagent. Sätt kork på röret och vortexa i 3 5 sekunder. - Tillsätt 12,5 µl HIV-1 L(+)C till röret märkt HIV-1 L(+)C med UltraSensitive Working Lysis Reagent. Sätt kork på röret och vortexa i 3 5 sekunder. - Tillsätt 12,5 µl HIV-1 H(+)C till röret märkt HIV-1 H(+)C med UltraSensitive Working Lysis Reagent. Sätt kork på röret och vortexa i 3 5 sekunder. B.11. Inkubera prov- och kontrollrören i 10 minuter i rumstemperatur. B.12. Ta bort korken på varje prov- och kontrollrör, tillsätt 600 µl 100-procentig isopropylalkohol (rumstempererad), sätt tillbaka korken och vortexa kraftigt i 3 5 sekunder. Endast ett rör får vara öppet åt gången. B.13. Gör ett riktningsmärke på varje rör och placera rören i mikrocentrifugen med riktningsmärkena vända utåt så att pelleten kommer att stämma överens med riktningsmärkena. Centrifugera prover och kontroller på högsta hastighet (12 500 16 000 x g) i 15 minuter i rumstemperatur. B.14. Använd en ny engångstransferpipett med fin spets för varje rör och avlägsna försiktigt supernatanten från varje rör och kassera den. Var noga med att inte röra pelleten (som eventuellt inte syns). Ta bort så mycket vätska som möjligt utan att röra pelleten. Sug upp supernatanten långsamt och låt vätskan rinna av helt från rörets sidor. Använd inte vakuumaspiration. B.15. Tillsätt 1,0 ml 70-procentig etanol (rumstempererad) till varje rör, återförslut och vortexa i 3 5 sekunder. 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 21/51