LABORATION I ANALYTISK KEMI (KEGBAA, BLGAK0) 4. VÄTSKEKROMATOGRAFI Laborationen syftar till att introducera vätskekromatografi med vilken koffeinhalten i olika prover bestämms 1
Inledning HPLC-tekniken tillåter att svårflyktiga eller termiskt instabila organiska ämnen, som ej kan separeras med GC, bestäms. Det är framför allt inom områden som biologi och medicin som HPLC-tekniken har fått sin största användning och HPLC är idag förmodligen den viktigaste enskilda separationstekniken inom dessa områden. Dessutom är det värt att notera att ca 90-95% av samtliga vätskekromatografiska separationer som utförs idag görs i reversed phase -system. Exempel på vanliga analyser i dessa system är bestämning av aminosyror, vitaminer och pesticider, och kvalitetskontroll av livsmedel och läkemedel. Koffein finns både i läkemedel och i en mängd olika livsmedel. Det är därför viktigt att kunna bestämma koffeinhalten i både fasta och flytande prover, vilket görs rutinmässigt med vätskekromatografi inom både livsmedels- och läkemedelsindustrin. Det kan vara svårt att definiera vad den egentliga koffeinhalten är. Om vi tar te som exempel, så kan koffeinhalten anges som den totala mängden i tepåsen eller i den färdiga koppen. Dessutom beror det på hur länge man låter tepåsen dra i koppen. Den här laborationen syftar till att introducera HPLC och en typisk applikation: kvanifiering av en organisk, vattenlöslig molekyl. Instrumentering En vätskekromatograf består av ett antal huvudkomponenter (se figur nedan): En eller flera pumpar för transport av den mobila fasen Injektor med en provslinga (loop) för injicering av prov i den mobila fasen Kolonn Detektor Till instrumentet kan man också koppla en provväxlare som automatiskt injicerar ett stort antal prover utan tillsyn. Det som skiljer olika instrumentuppsättningar åt är främst kolonnen och detektorn. Kolonnen, som vanligtvis är ett rör av rostfritt stål, är normalt fylld med porösa partiklar med diameter 2
på 3; 5 eller 10 µm. Genom att partiklarna är små och tätt packade uppstår ett högt tryck när den mobila fasen pumpas genom kolonnen. Vanliga tryckfall över en kolonn är under normala separationsbetingelser 50-250 bar. För att systemet skall fungera ställs därför höga krav på kolonnmaterial, ledningar, injektor och pumpar. Dessa måste också vara motståndskraftiga mot de lösningsmedel som används i systemet, d.v.s. organiska lösningsmedel och aggressiva buffertar. Stationär fas, Det vanligaste materialet för den stationära fasen är porösa kiseldioxidpartiklar. De stora fördelarna med kiselbaserade material är att de både ger en hög separationseffektivitet och tål höga tryck. Deras användning begränsas dock att de endast är stabila inom ph-intervallet 2-8. Partiklarna som packats i en reversed-phase -kolonn har en yta som modifierats med alkylkedjor. Kedjelängden är vanligtvis 8 eller 18 kolatomer och dessa kolonner benämns därför C8 respektive C18 kolonner. Mobil fas. En HPLC separation optimeras främst genom att man varierar den mobila fasens sammansättning. I ett reversed phase -system är det framför allt halterna av polära organiska lösningsmedel som kan ändras. Härigenom kan provkomponenterna fördelas olika mellan den stationära och den mobila fasen, vilket brukar uttryckas som att provkomponenterna får olika affinitet för den stationära fasens hydrofoba yta, och är naturligtvis en förutsättning för att olika ämnen skall kunna separeras. Skillnaderna i affinitet leder till att provkomponenterna vandrar genom kolonnen med olika hastighet d.v.s. att de får olika retentionstid. Det organiska lösningsmedlet är vanligtvis metanol eller acetonitril. För opolära organiska provkomponenter gäller att ju högre halt av organiskt lösningsmedel som används, desto mindre blir affiniteten till den stationära fasen och därmed erhålls kortare elueringstider. Detektor. I ett vätskekromatografisystem kan ett flertal olika detektionsprinciper tillämpas. RIdetektorn (RI = refractive index, brytningsindex) är en generell detektor för alla typer av ämnen. Mätning av absorbans i UV/VIS-området är den mest använda detektionstekniken, men den kräver att de analyserade ämnena absorberar ljus i UV/VIS området. Främst ämnen som innehåller konjugerade dubbelbindningssystem (aromatiska kolväten m.fl.) En högre grad av generalitet i detektionen kan erhållas om mätning sker vid låga UV-våglängder (185-215), men detta begränsar vilka lösningsmedel som kan användas. Detektorutslaget är proportionellt mot koncentrationen i eluatet (den mobila fasen med lösta provkomponenter som lämnar kolonnen). Då det sker en utspädning i kolonnen måste systemet kalibreras innan användning, vilket görs genom att kända halter av analyten injiceras. Definitioner Inom kromatografi definierar man retentionsfaktorn enligt: där t r är retentionstiden och t 0 är systemets uppehållstid. Som ett mått på hur bra två toppar är separerade så kan separationsfaktorn användas: (1) (2) 3
Genomförande Material Stationär fas: ReproSil 100 C18, 100 x 4 mm, 5 µm Mobil fas: 40:60 v/v metanol/vatten med 30 mm myrsyra, ph 3,5 Flöde: Detektion: Injektionsvolym: 20 µl 1,0 ml/min UV/Vis vid 260 nm Starta upp systemet i samråd med labbhandledaren. Ställ in flödet och våglängden. Jämvikta systemet tills en stabil baslinje erhållits. Standardkurva Bered 50 ml av en 1000 mg/l stamlösning av koffein genom att väga upp en lämplig mängd koffein och överföra till en 50 ml mätkolv. Använd mobil fas som lösningsmedel och se till att allt koffein löser sig (använd ultraljudsbad för att lösa allt om det behövs). Filtrera ca 10 ml av stamlösningen med ett sprutfilter. Bered genom spädning av den filtrerade stamlösningen, 10 ml av standardlösningar som innehåller 0, 25, 50, 100 respektive 150 mg/l koffein. (Det är inte viktigt att stamlösningen blir exakt 1000 mg/l men den skall ha en noggrant bestämd koncentration i närheten av 1000 mg/l.) Börja att bestämma systemets uppehållstid, dvs. den tid det tar för ett ämne som inte fastnar på kolonnen att sköljas igenom. Detta görs genom att injicera uracil (finns färdig lösning). Fyll alltid loopen med minst 60 µl för att skölja ut eventuella rester från föregående prov. Gör sedan en injektion av varje standard. Börja med den lägsta och notera retentionstid, topphöjd och topparea för varje standard genom att integrera toppen. Brustablettprov Lös upp en Bamyl brustablett, väg den först, i 500 ml milliq vatten. När lösningen stått ca 15 min, filtrera några milliliter och injicera. Kör 10 minuter och spara sedan kromatogrammet. Identifiera vilken topp som är koffein och integrera denna. Bestäm sedan vilket ämne som ger den andra toppen genom att spika en del av det icke filtrerade Bamylprovet med lämpligt ämne och filtrera. Injicera det spikade provet. Byt nu mobil fas till en innehållande 30:70 v/v metanol/vatten med 30 mm myrsyra, ph 3,5. Jämvikta kolonnen i ca 15 min. Under tiden förbereds teproverna (se nedan). Injicera sedan det ursprungliga (ej spikade) provet igen. Beräkna mängden koffein i er brustablett med 95% konfidensintervall och jämför med förpackningen. Beräkna separationsfaktorn mellan koffein och det ämne ni bestämt för de två mobila faserna och jämför. 4
Teprov Koka upp 0,8 l vatten. Gör två likadana teprover men med två olika tepåsar. Gör ordning två bägare och var redo att ta tid från och med när tepåsarna läggs i. Mät noggrant upp 200 ml kokande vatten och överför till vardera bägare. Lägg en tepåse i vardera bägare och starta tidtagaruret. Såg upp ca 10 ml te efter 3, 5 och 10 min från vardera bägare. Rör om före varje upptagning så att en jämn koncentrations bildas i bägaren. Totalt fås 6 st teprover. Späd varje prov med mobil fas genom att ta 4 ml te och blanda med 6 ml mobil fas. Filtrera varje prov. Gör en injektion för varje prov. Använd 30:70 som mobil fas. Beräkna koffeinhalten för alla teprover och plotta koncentrationen mot tiden när provet togs upp. Uppskatta hur mycket koffein det finns i en tepåse och hur många procent man av den totala mängden man får i säg om man låter tepåsen dra i 3 min. Frågor 1. I labben identifieras topparna i kromatogrammen på två sätt. Vilka? Beskriv dem kort. 2. Om metanolhalten i den mobila fasen höjdes till 50%, vad skulle hända för Bamylprovet? 3. Förutom att ändra metanolhalten, hur kan man påverka separationsfaktorn? Nämn minst två sätt. 4. I två vetenskapliga publikationer så bestämdes koffeinhalten i te med HPLC som vi har gjort här. För Lipton Regular Black när tepåsen var i 5 min fick man 332 mg/l (Hicks, 1996) och 266 mg/l (Chin, 2008). Lipton anger på sin hemsida 55 mg per serving. Hur stämmer det med era resultat? Vad tror ni Lipton syftar på i sin innehållsdeklaration? Diskutera varför resultaten skiljer sig. Referenser Hicks et al. Food Research International, vol. 29, 325-330, 1996. Chin et al. Journal of Analytical Toxicology, vol. 32, 702-704, 2008. http://www.liptontea.com/product/detail/141444/black-tea-cup-size Appendix - Koffeinmolekyl 5