Branschintern Rapport nr 7030-1 2003-12-08 Betydelsen av pastöriseringsöverlevande bakterier för kvaliteten hos ost En litteraturstudie Anders Christiansson Svensk Mjölk Forskning Telefon 0771-191900. E-post fornamn.efternamn@svenskmjolk.se
Betydelsen av pastöriseringsöverlevande bakterier för kvaliteten hos ost En litteraturstudie Anders Christiansson Sammanfattning Med pastöriseringsöverlevande bakterier avses sådana som kan överleva lågpastörisering vid 72 C i 15 sekunder. De mest värmeresistenta bakterierna är sporbildarna av släktena Bacillus och Clostridium. Bland de icke sporbildande bakterierna är olika coryneforma bakterier som t.ex. Microbacterium lacticum mest värmetåliga. Därefter följer mikrokocker, Streptococcus thermophilus, samt enterokocker. Vissa Lactobacillus-arter överlever också i viss mån pastörisering. Pastöriseringsöverlevande bakterier med relevans för ost kan uppförökas i pastören och/eller genom tillväxt i osten. Den enda idag säkert kända och tydligt pastöriseringsöverlevande mikroorganismen som kan påverka ostkvaliteten är Streptococcus thermophilus och eventuellt även Bacillus licheniformis. Dessa kan förökas i pastören vid långa körtider (mer än 8-12 timmar) och kan hamna i höga halter i ystmjölken, med smak och texturfel i ost som resultat. Vid UF-koncentrering av ystmjölk och lång driftstid kan olika Bacillus-arter förökas med smakfel som följd i lagrad Cheddar-ost. Vissa laktobaciller kan delvis överleva pastörisering, men deras halter i leverantörmjölk är sannolikt oftast för låga för att ha betydelse. Vissa undersökningar antyder dock på att laktobaciller i viss mån skulle kunna uppförökas i pastör, med måttligt förhöjda halter i ystmjölken som följd. Laktobaciller anses oftast hamna i ystmjölk genom återkontamination, men ett tillskott genom uppförökning i pastören skulle kunna leda till en snabbare laktobacill-tillväxt i ost med kvalitetspåverkan som följd. 2
Inledning Pastöriseringsöverlevande bakterier i leverantörmjölk har på senare tid blivit ett problem vid tillverkning av mjölkpulver, beroende på att kraven på totalantalet bakterier i mjölkpulver ökats. Kunderna kräver idag ofta mindre än 10000 bakterier/g pulver, vilket motsvarar mindre än 1000 pastöriseringsöverlevande bakterier/ml i mjölken. De förhöjda halterna har identifierats som ett gårdsproblem, med anknytning till diskförhållanden på gårdarna (1). Det är känt sedan tidigare att den pastöriseringsöverlevande bakterien Streptococcus thermophilus kan ge upphov till kvalitetsfel hos ost, om den får tillfälle att föröka sig i pastörens regenerativ vid långa körtider (2). Mycket höga halter hamnar då i ystmjölken, vilket leder till onormal gasbildning och smakfel i ost. Däremot är effekten av andra pastöriseringsöverlevande bakterier leverantörmjölken i stort sett okänd. Denna litteraturstudie har gjorts för att belysa om sådana bakterier kan ha en betydelse för ostkvaliteten. Egenskaper hos pastöriseringsöverlevande bakterier Med pastöriseringsöverlevande bakterier menas sådana bakterier som överlever lågpastörisering vid 72 C i 15 sekunder. De mest värmeresistenta bakterierna är sporbildarna av släktena Bacillus och Clostridium. Bland de icke sporbildande bakterierna är olika coryneforma bakterier som t.ex. Microbacterium lacticum mest värmetåliga. Därefter följer mikrokocker, Streptococcus thermophilus, samt enterokocker (3). Vissa Lactobacillus-arter överlever i viss mån pastörisering (4). Medan de coryneforma bakterierna klarar temperaturer över 80 C så avdödas de mest värmeresistenta Lactobacillus-arterna delvis redan vid lågpastöriseringstemperatur. Många pastöriseringsöverlevande bakterier är strikt aeroba (Bacillus, coryneforma och mikrokocker). Klostridier är strikt anaeroba medan enterokocker och laktobaciller är fakultativt anaeroba, d.v.s. de kan tillväxa vid syrefria förhållanden som råder inuti ost. Bland klostridierna begränsas tillväxten av ostens låga ph, vilket leder till att Clostridium tyrobutyricum är den art som dominerar och kan förstöra osten. Enterokocker, Streptococcus thermophilus och laktobaciller kan dock tillväxa. Däremot kan inte Bacillus, coryneforma bakterier och mikrokocker tillväxa i större utsträckning inuti ost. Pastöriseringsöverlevande bakterier tillväxer i stort sett inte i leverantörmjölk som kylförvaras. Den flora som tillförts på gården i huvudsak via mjölkningsanläggningen och kons hudflora finns alltså kvar oförändrad vid ankomsten till mejeriet. Förekomst av pastöriseringsöverlevande bakterier i mjölk Enligt en nyligen genomförd undersökning inom projektet Pastöriseringsöverlevande bakterier i leverantörsmjölk så varierade halten pastöriseringsöverlevande bakterier på 47 svenska gårdar mellan mindre än 10/ml och upp till 38.000/ml. Medelvärdet var 1500 och medianen 120/ml. I en undersökning av konsumtionsmjölk från 10 olika europeiska länder 1990 var medelvärdet för 2000 prover 2000/ml. De skandinaviska länderna och Nederländerna hade lägst halter (8-900/ml) medan högst halter påträffades i tysk mjölk (medelvärde 6700/ml) (5). Spridningen i värdena var dock stor. Vid en spansk undersökning av leverantörmjölkens sammansättning vid 8 gårdar varierade halten pastöriseringsöverlevande bakterier mellan 270 och 7100/ml med medelvärde 3800/ml (6). I en japansk undersökning påvisades halter mellan 100-1000/ml i pastöriserad mjölk, med Microbacterium och Micrococcaceae som dominerande grupper. Låga halter av Streptococus, Lactobacillus och Actinomyces påträffades också (7). Sammanfattningsvis tycks halten pastöriseringsöverlevande bakterier på samlingsmjölks- 3
nivå vara relativt låg i Sverige och även internationellt och överstiger sällan 10000/ml. Det är i relation till dessa halter som eventuella risker för osttillverkning som mjölkråvaran ska bedömas. Mikrobiologiska kvalitetsrisker med pastöriseringsöverlevande bakterier i ost Uppförökning i processen Exemplet med Streptococcus thermophilus och ystmjölkspastörer har beskrivits tidigare (se (2) och referenser däri). I samband med långa driftstider, särskilt för ystmjölkspastörer med hög värmeåtervinningsgrad, hade man bl.a. i Holland i slutet av 1970-talet observerat en stigande halt Streptococcus thermophilus i den utgående mjölken. Efter 8-12 timmars drift kan bakteriehalterna stiga mycket snabbt i mjölken och kan nå cirka 1 miljon/ml, trots låg halt i inkommande mjölk. Driftstidens längd är starkt beroende av leverantörmjölksflorans innehåll av S. thermophilus. Vid låga halter kan betydligt längre driftstider uppnås. Fenomenet har undersökts noggrant i pilotpastörskala. Vid tillsats av 20.000 S. thermophilus/ml till mjölkråvaran började halten i den pastöriserade mjölken att stiga redan efter 4 timmar. På grund av sin värmeresistens överlever S. thermophilus en lågpastörisering och kan etablera sig efter hållarcellen. Högst halter fann man i regenerativet (1-10 miljoner/cm2) på de plattor där temperaturen var 40-50 C d.v.s. vid de temperaturer där S. thermophilus har högst tillväxthastighet (cirka 15 minuters generationstid). Vidhäftning och tillväxt på ytor är nödvändig för att uppnå dessa halter i mjölken, eftersom fritt växande bakterier skulle spolas ut ur pastören. S. thermophilus kunde fästa direkt på det rena stålet. I Gouda-ost som tillverkas av ystmjölk med 1 miljon S. thermophilus/ml kan det ske en ytterligare ökning av bakterierna i osten upp till en halt av 100 miljoner - 1miljard/g. Ostarna får oren bismak och onormal gasbildning, vilket påverkar texturen negativt. Enligt de holländska erfarenheterna får det förekomma högst 100.000 S. thermophilus/ml i mjölken för att inte ostkvaliteten ska påverkas negativt. För att minska tillväxten rekommenderas en mellandisk när dessa halter nås. Försköljning med vatten i 2-3 minuter, 10 minuters cirkulationsdisk med 1% lut och eftersköljning gav goda resultat. Tillväxt av S. thermophilus kan även ske i termiseringsutrustning och i separatorer. Liknande problem har aktualiserats i Australien på senare tid både i anslutning till långa körtider för pastörer (8) och i samband med kontinuerlig osttillverkning på UF-koncentrerad mjölk (9). I det senare fallet hölls mjölken vid 50 C under UF-behandlingen. Vid denna temperatur tillväxer termofila sporbildare av släktet Bacillus mycket snabbt. Efter 12-20 timmars körtid stiger Bacillus-halten kraftigt i mjölken och detta är starkt korrelerat till sämre ostkvalitet (bitter smak och bismak) vid bedömning av Cheddar efter 6 månader. En förutsättning för att uppförökning ska kunna ske är att en bakterie överlever lågpastörisering och sedan har möjlighet att fästa vid ytor med lämplig temperatur i regenerativ eller UFutrustning och kan tillväxa där. Detta gäller både för S. thermophilus och sporbildarna. Bacillus licheniformis har också påvisats kunna föröka sig i värmeväxlare (10). Denna bakterie tillväxer snabbt vid 50-55 C. Teoretiskt sett skulle även andra Bacillus-arter kunna tillväxa. Den begränsande faktorn är sannolikt om de kan tillväxa rimligt snabbt. Clostridium tyrobutyricum kan inte uppförökas under de aeroba betingelser som råder. Bacillus-arter kan vanligen inte tillväxa i ost eftersom det råder anaeroba betingelser, även om vissa arter kan växa anaerobt. B. cereus kan visserligen föröka sig svagt under ytstnings- 4
processen men dör senare under ystningen (11). Bacillus polymyxa har rapporterats ge ostjäsning i enstaka fall (12). I samband med undersökning av Grevé-ost med texturfel påträffades cirka 500.000 Bacillus licheniformis/g i en ost. Vid Mejeriernas Ostutvecklingsstation i Falkenberg gjordes miniystningar med tillsats av låg och hög halt av denna bakterie (ej publicerat). Vid låg tillsats hände ingenting, bakterien förökade sig inte. Vid hög tillsats (som i originalosten) jäste ostarna upp kraftigt på grund av smörsyrajäsning. Ostarnas ph-värde steg till över 6,0. B. licheniformis roll i denna jäsning var sannolikt indirekt. Bakterien är relativt syratolerant och kan troligen överleva länge i osten. Den kan förbruka nitrat, vilket sannolikt ledde till att smörsyrasporer kunde gro ut och osten jäste. Vid höga halter, av vilken bakterie som helst som kan förökas upp under värmningsprocessen (mer än 1 miljon/ml), finns det risk för at det bildas extracellulära enzymer, t.ex. proteaser och lipaser. Dessa enzymer kan då påverka ostmognadsprocessen, vilket sannolikt var fallet med UF-Cheddartillverkningen i Australien. Bakterien behöver således inte växa till i osten för att kunna orsaka kvalitetsdefekter. Uppförökning i osten Bland de pastöriseringsöverlevande mjölksyrabakterierna kan det teoretiskt sett finnas möjlighet både till uppförökning i pastör och under ostens tillverkning och lagring. Det finns dock inga rapporter om tillväxt till höga halter i värmeväxlare för dessa organismer. Enterokocker och laktobaciller är mera värmekänsliga än de tidigare beskrivna mikroorganismerna, varför inte lika stor risk föreligger. För en stam av Lactobacillus plantarum rapporteras ett D-värde på 4,4 sekunder vid 72 C (4). Detta betyder att innehållet av denna bakterie skulle reduceras med 3,4 logenheter vid pastörisering i 15 sekunder. Martley undersökte såväl förändringen i totalantal bakterier som pastöriseringsöverlevande bakterier över en kommersiell ystmjölkspastör under en 10-dagarsperiod (13). Inga skillnader kunde påvisas mellan halten pastöriseringsöverlevande bakterier i ingående mjölk och ut från pastör vid produktionsdagens början och slut. Däremot var totalantalet bakterier vid två dagar en faktor 10-100 högre ut från pastör än ingående mjölk. Mjölken var fosfatasnegativ och således korrekt pastöriserad. Detta inträffade två dagar när totalantalet var högre än normalt i ingående mjölk. Martley menar att detta orsakats av värmetoleranta mjölksyrabakterier, som delvis avdödats, och därför inte kunde detekteras med den vanliga laboratorietesten för pastöriseringsöverlevande bakterier, värmning vid 63 C under 30 minuter, men som vid högre halter i ingående mjölk dock till viss del överlevde och kunde föröka sig i regenerativet. I Cheddar-ost gjord på opastöriserad mjölk påträffades höga halter enterokocker. Undersökningar med bl.a. molekylärbiologiska typningsmetoder indikerade att källan sannolikt var mjölkningsanläggningen (14) och orsaken otillräcklig disk. Enterokocker är vanliga i ostar gjorda på opastöriserad mjölk eftersom de växer bra i osten och ingen reducering sker genom pastörisering. Laktobaciller påträffas alltid i ost som fått mogna (13). De anses till största delen vara en återkontaminationsflora som finns i mejeriutrustningen och kontaminerar mjölken i samband med ystningen. Normalt påträffas <10 till några 10-tal eller något hundratal laktobaciller i ystmjölken i ystningstanken. De påverkar inte ostens syrningsförlopp i samband med syrningen, men förökar sig under lagringen för att efter några månader nå halter mellan 100.000 till 10 miljoner/g ost. Vid dessa halter kan de ha en viktig roll i ostmognadsförloppet och påverkar på så sätt ostkvaliteten i både positiv och negativ riktning. Det anses inte möjligt att fullständigt kunna undvika laktobaciller i ost. Det är inte osannolikt att dessa ursprungligen hamnar i mejerimiljön via förekomst och överlevnad vid ystmjölkens pastörisering. Lakto- 5
baciller, såsom t.ex. Lactobacillus brevis, och olika subspecies av Lb. casei har visat sig kunna orsaka kvalitetsfel i ost, se t.ex. (15), där man även kunde spåra ursprunget till leverantörmjölken. Det är idag osäkert i hur stor utsträckning en eventuell uppförökning i pastör kan ha på laktobacillutvecklingen i svensk ost. En ökning i halt med t.ex. en faktor 100 eller 1000 i ystmjölken skulle dock kunna innebära en tidigare påverkan på ostmognaden än vad som är normalfallet. En kontinuerlig uppföljning av totalantalet bakterier före och efter pastör i förhållande till laktobacillhalt och ostkvalitet skulle eventuellt kunna ge svar på den frågan. Mögelostar och kittostar Mögelostar skiljer sig från hårdost genom en högre vattenhalt, tillsats av grön- eller vitmögel, samt frånvaro av vaxning eller paraffinering. Detta gör att i synnerhet ytskiktet på osten kommer att utgöra en aerob miljö, som medger tillväxt av aeroba mikroorganismer. På liknande sätt är ostytan på kittostar en aerob miljö under kittbehandlingen. Bland de mikroorganismer som utvecklar sig på ytorna av dessa ostar finns mikrokocker, stafylokocker, Brevibacterium och corynebakterier (16, 17). Enzymer från Micrococcus sp. verkar också ha en positiv roll för smakutvecklingen av vissa färskostar (18). Det är tydligt att den pastöriseringsöverlevande floran utgör en viktig komponent i ytfloran på mögelostar och kittostar. Kombinationen av pastöriseringsöverlevnad, aerob tillväxt och ofta salttolerans har troligtvis lett till att denna typ av flora har ett selektivt övertag bland de bakterier som uppträder spontant i denna miljö. Liknande pigmenterade bakterier påträffas också som t.ex. gula fläckar på ytan av ost i plastfilm, särskilt i skarvar med syreläckage. Slutsatser Den enda idag säkert kända och tydligt pastöriseringsöverlevande mikroorganismen som kan påverka ostkvaliteten är Streptococcus thermophilus och eventuellt även Bacillus licheniformis. Dessa kan förökas i pastören vi långa körtider (mer än 8-12 timmar) och kan hamna i höga halter i ystmjölken, med smak och texturfel i ost som resultat. Vid UF-koncentrering av ystmjölk och lång driftstid kan olika Bacillus-arter förökas med smakfel som följd i lagrad Cheddar-ost. Vissa laktobaciller kan delvis överleva pastörisering, men deras halter i leverantörmjölk är sannolikt oftast för låg för att ha betydelse. Vissa undersökningar tyder dock på att laktobaciller i viss mån skulle kunna uppförökas i pastör, med förhöjda halter i ystmjölk som följd. Samtliga av dessa bakterier finns i mjölkråvaran och dennas innehåll påverkar risken för uppförökning i mejeriprocesserna. Eventuell uppförökning kan enkelt undersökas genom att mäta deras halt i mjölk före och efter pastör vid början och slutet av driften. Det är sannolikt svårt, och inte motiverat, att riktat försöka reducera dessa bakteriers förekomst i leverantörmjölk. Coryneforma bakterier (mest Microbacterium) och mikrokocker, som dominerar den pastöriseringsöverlevande floran, har ingen betydelse för hårdostars kvalitet. Rådgivning och åtgärder som leder till att gruppen pastöriseringsöverlevande bakterier i sin helhet reduceras genom förbättrade diskrutiner på gårdarna minskar med stor sannolikhet även förekomsten av de potentiellt produktskadliga pastöriseringsöverlevande bakterierna. 6
Referenser 1. Svensson, B. 2001. Pastöriseringsöverlevande bakterier. En litteraturstudie. Svensk Mjölk rapport 4995. 2. Christiansson, A. & Nilsson, J. 1994. Bakteriologiska problem i samband med drift av värmeväxlare och annan utrustning. Svensk Mjölk rapport 4930. 3. Stadhouders, J., Hup, G. & Hassing, F. 1982. The conceptions of index and indicator organisms discussed on the basis of the bacteriology of spray-dried milk powder. Netherlands Milk and Dairy Journal 36: 231-260. 4. Jordan, K.N. & Cogan, T.M. 1999. Heat resistance of Lactobacillus spp. isolated from Cheddar cheese. Letters in Applied Microbiology 29: 136-140. 5. Suhren, G. 1990. Zur bakteriologischen Beschaffenheit von värmebehandelter Konsummilch. Eine Untersuchung von Handelsproben aus 10 europäischen Ländern. DMZ Lebensmittelindustrie und Milchwirtschaft (15): 468-471. 6. Villar, A., Garcia, J.A., Iglesias, L., Garcia, M.L. & Otero, A. 1996. Application of principal component analysis to the study of microbial populations in refrigerated raw milk from farms. International Dairy Journal 6: 937-945. 7. Kikuchi, M., Matsumoto, Y., Sun, X. & Takao, S. 1996. Incidence and significance of thermoduric bacteria in farm milk supplies and commercial pasteurized milk. Animal Science and Technology 67(3): 265-272. 8. Lehmann, F.L., Russell, L.S., Solomon, L.S. & Murphy, K.D. 1992. Bacterial growth during continous milk pasteurization. The Australian Journal of Dairy Technology 47: 28-32. 9. Lehmann, F. 1992. Thermoduric-thermophilic bacteria in continous cheesemaking. The Australian Journal of Dairy Technology 47: 94-96. 10. Langeveld, L.P.M., Van Monfort-Quasig, R.M.G.E., Weerkamp, A.H., Waalewijn, R. & Wever, J.S. 1995. Adherence, growth and release of bacteria in a tube heat exchanger for milk. Netherlands Milk and Dairy Journal 49: 207-220. 11. Rukure, G. & Beter, B.H. 2001. Survival and growth of Bacillus cereus during Gouda cheese manufacturing. Food Control 12(1): 31-36. 12. Tjepkema, R., Price, W.V. & Foster, E.M. 1953. An early-gas defect in Swiss cheese caused by Bacillus polymyxa. Journal of Dairy Science 36: 1272-1278. 13. Martley, F.G. & Crow, V.L. 1993. Interactions between non-starter microorganisms during cheese manufacture and ripening. International Dairy Journal 3: 461-483. 14. Gelsomino, R., Vancanneyt, M., Cogan, T.M., Condon, S. & Swings, J. 2002. Source of enterococci in a farm-house raw-milk cheese. Applied and Environmental Microbiology 68(7): 3560-3565. 15. Hull, R., Toyne, S., Haynes, I. & Lehmann, F. 1992. Thermoduric bacteria: a reemerging problem in cheesemaking. The Australian Journal of Dairy Technology 47: 91-94. 16. Corsetti, A., Rossi, J. & Gobbetti, M. 2001. Interactions between yeasts and bacteria in the smear-ripended cheeses. International Journal of Food Microbiology 69: 1-10. 17. Bockelman, W. & HoppeSeyler, T. 2001. The surface flora of bacterial smearripened cheese from cow's and goat's milk. International Dairy Journal 11: 307-314. 18. Mohedano, A.F., Fernandez, J., Gaya, P., Medina, M. & Nunez, M. 1998. Effect of the cysteine proteinase from Micrococcus sp. INIA 528 on the ripening process of Hisponico cheese. Journal of Dairy Research 65(4): 621-630. 7