Prognostiska faktorer vid akut myeloisk leukemi Bakgrund Akut leukemi (AL) har en incidens av cirka 4/100 000 invånare varav cirka 4/5 är akut myeloisk leukemi (AML) och resterande akut lymfatisk leukemi (ALL). Medianålder vid insjuknande är 70 år och alla patienter ingår i regionala eller nationella behandlingsprogram (Svenska akutleukemiregistret 2004). Praktiskt taget samtliga patienter under 70 år, en betydande del av de i åldersgruppen 70-80 år samt enstaka över 80 år, får intensiv cytostatikaterapi i syfte att uppnå bestående komplett remission, dvs. bot. Prognosen vid AL är generellt mycket dålig och långtidsöverlevnaden är endast cirka 20% (Smith 2004). Det stora problemet med sjukdomen är framför allt den höga återfallsrisken (Ferrara 2004). En avsevärd andel yngre patienter genomgår även allo-sct (allogen stamcellstransplantation) för att minimera risken för recidiv Nya behandlingsstrategier inriktar sig på att finna bättre diagnostiska instrument för att kunna dela in patienterna i adekvata behandlingsgrupper baserad på förväntad prognos och att identifiera möjliga s.k. "minimal residual disease". (van Der Velden 2003, Tomas 2004, Campana 2004, Lowenberg 2003). I ett långsiktigt projekt följer vi behandlingsresultaten vid AL prospektivt i en jämförande studie med svenska akutleukemiregistret sedan 1997. Resultaten i vg-regionen har retrospektivt jämförts med Estland mellan 1981-1996 och en prospektiv studie pågår (Svenska akutleukemiregistret 2002, Luik 2004, Wennström 2004). Etablerade prognostiska faktorer Ålder Vid sidan av cytogenetik är ålder den prognostiskt starkaste riskfaktorn. (Grimwade, Walker et al. 2001). Cytogenetik Litteraturen om cytogenetik, AML och prognos är omfattande (Mrozek, Heerema et al. 2004). Nyligen publicerade resultat från stora kliniska studiegrupper som MRC (Grimwade, Walker et al. 1998), CALGB (Byrd, Mrozek et al. 2002) och SWOG/ECOG (Slovak, Kopecky et al. 2000). 1(11)
Övriga leukemirelaterade prognosfaktorer tidigare känd kronisk hematologisk stamcellssjukdom, främst MDS (myelodysplastiskt syndom) och MPD (myeloproliferativ sjukdom), är en negativ prognostisk faktor (Leone, Mele et al. 1999). sekundär AML i bemärkelsen sjukhistoria innefattande mutagen exposition, t ex cytostatikabehandling för annan sjukdom än AML, är i sig ingen stark oberoende prognostisk riskfaktor. trilinjär dysplasi. Flera studier har visat en negativ prognostisk betydelse av detta fynd (Arber, Stein et al. 2003). hyperleukocytos. Högt antal blaster i blodet har traditionellt ansetts som en negativ prognosfaktor vid AML (Dutcher, Schiffer et al. 1987). Tidig morbiditet och mortalitet av leukostas är en realitet och kräver rask handläggning (Porcu, Cripe et al. 2000). vissa antigenuttryck immunfenotypiskt. Som oberoende prognosfaktor har uttryck av vissa antigen en oklar roll, eftersom det finns en uttalad samvariation med cytogenetisk riskgruppering (Wheatley, Burnett et al. 1999). Terapirelaterade prognosfaktorer >15 % blaster vid konventionell utvärdering efter första cytostatikakuren > 2 kurer krävts för att uppnå CR (Wheatley, Burnett et al. 1999). Nya molekylärgenetiska prognosmarkörer FLT3: FLT3 är en tyrosinkinasreceptor som har stor betydelse för hematopoietisk cellproliferation. Vid 18-30 % av all vuxen-aml ses en intern tandemduplikation (ITD) av FLT3, som anses ge ett konstitutivt påslag av tyrosinfosforylering ledande till leukemitillväxt (Drexler and Quentmeier 2004). FLT3-mutationerna är vanligast förekommande vid AML med normal karyotyp, högt blastantal i blodet samt vid APL. Det finns relativt samstämmiga uppgifter om att FLT3-ITD är associerat till hög recidivrisk hos yngre patienter med AML (non-apl) (Kottaridis, Gale et al. 2001). En annan typ av molekylär avvikelse i FLT3, aktiverande punktmutationer i en av tyrosinkinasdomänerna (ATKD), är mindre vanligt förekommande vid AML och har inte lika tydlig prognostisk innebörd (Yanada, Matsuo et al. 2(11)
2005). Även högt uttryck av FLT3 genen i frånvaro av någon mutation har i åtminstone en studie associerats till sämre prognos vid AML (Kuchenbauer, Kern et al. 2005). Nucleophosmin (NPM1) mutationer: Mutationer i NPM1 har nyligen blivit beskrivet hos patienter med AML och förekommer i en relativt hög frekvens (cirka 1/3). NMP1 är normalt ett kärnprotein men muterat NPM1 hamnar istället i cellens cytoplasma med förlorad funktion som följd. Mutation i NPM1 förefaller vara associerat med bättre prognos om patienten i övrigt har en normal karyotyp och ingen mutation i FLT3 genen (Falini, Mecucci et al. 2005, Schnittger, Schoch et al. 2005). CEBPA mutationer: Mutationer i CEBPA genen förekommer hos 10-15 % av AML (<60 år) och förefaller vara en positiv prognostisk faktor (Frohling, Schlenk et al. 2004). BAALC expression: Ökat uttryck av genen BAALC (Brain and acute leukemia cytoplasmic gene) vid diagnos har i flera studier visats vara en oberoende prognostisk faktor både vad gäller tidigt recidiv och förkortad långtidsöverlevnad (Baldus, Thiede et al. 2006). MLL och HOX gener: HOX gener kodar för en familj av transkriptionsfaktorer som har visat sig inta en nyckelroll vid hematopoesreglering. Flera olika HOX gener har visat sig kunna vara inblandade i utveckling av leukemi (van Oostveen, Bijl et al. 1999) och högt uttryck och translokationer innehållande HOX-gener har hittats hos patienter med akuta leukemier (Grier, Thompson et al. 2005). Högt uttryck av HOX gener (exv. HOXA9) och kofaktorer till dessa (exv. MEIS1) ses dessutom bland annat vid kromosomtranslokationer som involverar genen MLL (mixed lineage leukemia gene) som är associerat med dålig prognos (Döhner, Tobis et al. 2002). Vidare förekommer en kryptisk mutation i MLL (MLL-PTD) som också förefaller vara associerad med högt uttryck av HOX gener och dålig prognos (Basecke, Whelan et al. 2006). Riskgrupper Ungefär hälften av alla AML-fall går att inordna i riskgrupper. Indelningen syftar i första hand till att identifiera grupper som skiljer sig åt beträffande risk för recidiv eller chans till bot efter standardbehandling. Riskstratifiering används alltid vid ställningstagande till allo-sct (allogen stamcellstransplantation). 3(11)
Med utgångspunkt från data från tidsperioden 1997-2003, bedömer vi att i åldersgruppen 60 år omfattas <15 % av patienterna av lågrisk- (inkl APL), 50 % av intermediärrisk- resp. 35 % av högrisk/extrem högriskkriterierna (Wahlin, Billstrom et al. 2005). Låg risk APL. Akut promyelocytleukemi med t(15;17) eller påvisat rearrangemang av PML/RARA med passande klinik och morfologi (Mistry, Pedersen et al. 2003). Utgör <3 % av vuxen- AML i Sverige. AML med inv(16)(p13q22) eller t(16;16)(p13;q22) eller molekylärt påvisat CBFB/MYH11. rearrangemang. Utgör 2-4% av all vuxen-aml. (Marlton, Keating et al. 1995). AML med t(8;21)(q22;q22) eller påvisat rearrangemang av RUNX1/CBFA2T1 (tidigare AML1/ETO). Utgör <3% av vuxen-aml i Sverige. (Baer, Stewart et al. 1997). Intermediär risk Detta är den största gruppen och utgör drygt hälften av alla fall. Hög risk Till denna grupp räknas patienter med: tidigare hematopoietisk stamcellssjukdom (främst MDS, MPD), LPK>100x109/L vid diagnos, FLT3-ITD+, högriskcytogenetik Extrem högrisk AML med inv/t(3)(q21q26). Någon procent av all vuxen-aml. Utomordentligt dålig prognos (Fonatsch et al 1994). AML med komplex karyotyp (fem eller fler avvikelser) innefattande en eller flera av följande avvikelser: -5, del(5q), -7, del(7q). Utgör 5-8% av all vuxen-aml. (Schoch, Kern et al. 2005). Syfte Att sammanställa kliniskt utfall i regionen för alla AML som insjuknat under 2000-2005. Att etablera en biobank med vidhängande klinisk information på benmärgsprover från diagnostillfället. Att i detta material utvärdera både kända och nya föreslagna markörer för prognosbedömning, bland annat förekomst av FLT3-ITD, FLT3-TKD, MLL, CEBPA och NPM1 mutationer och ökat uttryck av flera olika gener så som BAALC, FLT3, HOXA9 och MEIS1. 4(11)
Material och metoder Patienter och provmaterial Insamling av benmärgsmaterial från patienter med akut leukemi vid diagnos har pågått sedan år 2000. I nuläget har vi tillgång till cirka 150 diagnosprover från patienter med akut myeloisk leukemi (AML). Dessa patienters journaler kommer att gås igenom avseende insatt behandling, FAB-typ, kromosomer samt prognosfaktorer enligt ovan. Dessutom kommer all information om behandlingen och dess resultat att sammanställas. Normal benmärg från 6 stycken friska givare finns även insamlat som referensmaterial. Uppskattningsvis behövs minst 10 patienter inom varje diagnosgrupp för att vi säkert ska kunna se signifikanta (p<0.05) skillnader på genexpressionnivå (RNA). Emellertid är antalet patientprover som behövs beroende av vilken skillnad i expressionsnivå som kan tänkas vara av biologisk signifikans (minimum sannolikt >2-faldig ökning) och metodens (kvantitativ RT- PCR) variation (CV vanligen kring 10%). Båda dessa parametrar behöver värderas för varje enskild gen som ska testas. Samma resonemang gäller för att kunna verifiera betydelsen av funna genmutationer. De måste finnas i en tillräckligt hög frekvens i en tillräckligt stor prognosgrupp av patienterna för att säkert kunna utvärderas. Sammantaget innebär detta att minst ett hundra tal patienter måste ingå i studien. Datainsamling och bearbetning Cytogenetisk och molekylärcytogenetisk (FISH) analys har och kommer att utföras vid sektionen för cytogenetik och mutationsanalys och bestämning av genuttryck kommer att utföras på sektionen för genanalys, båda vid klinisk kemiska laboratoriet, SU. Mutationsanalysen sker genom sekvensering på DNA med sekvensspecifika primers och uttrycket av gener kommer att undersökas med kvantitativ RT-PCR (TaqMan) med s.k. Low Density Array (LDA) teknik på RNA preparerat från benmärgsproverna. Denna teknik möjliggör samtidig analys av 384 prover, vilket översatt i antal gener och patienter innebär att cirka 30 gener kan testas på 3 patienter och ett normalprov per körning och att både analyskostnaden per patient och analysvariationen kan minimeras. Som definition för signifikant förändring har vi initialt valt en 2-faldig förändring av genuttrycket med p<0.05 i ett Anova t-test. Resultaten från genexpressionen och mutationsanalysen kommer att korreleras med tidigare kända prognosmarkörer (klinisk riskgrupp, morfologisk undergrupp, 5(11)
kromosomavvikelser och mutationer) samt verkligt utfall för att avgöra användbarheten för diagnostiska eller prognostiska ändamål. Betydelse Identifiering av genmutationer och gener vars uttryck korrelerar med sjukdomsbild och prognos kommer att ge förbättrade diagnostiska möjligheter och en mer raffinerad prognostisk stratifiering av patienter med leukemi och andra proliferativa sjukdomar i benmärgen. Dessutom finns möjligheten att dessa gener kan användas för att följa insatt behandling och att tidigt upptäcka recidiv (s.k. minimal residual disease detektion). Sammanställningen av AML materialet utgör på sikt också en regional resurs för att snabbt kunna testa nya diagnostiska och prognostiska markörer och verifiera deras användbarhet i klinisk rutin. Referenser Arber, D. A., A. S. Stein, et al. (2003). "Prognostic impact of acute myeloid leukemia classification. Importance of detection of recurring cytogenetic abnormalities and multilineage dysplasia on survival." Am J Clin Pathol 119(5): 672-80. Baer, M. R., C. C. Stewart, et al. (1997). "Expression of the neural cell adhesion molecule CD56 is associated with short remission duration and survival in acute myeloid leukemia with t(8;21)(q22;q22). Blood 90(4): 1643-8. Baldus CD, Thiede C, Soucek S, Bloomfield CD, Thiel E, Ehninger G. BAALC expression and FLT3 internal tandem duplication mutations in acute myeloid leukemia patients with normal cytogenetics: prognostic implications. J Clin Oncol 2006;24(5):790-7. Basecke J, Whelan JT, Griesinger F, Bertrand FE. The MLL partial tandem duplication in acute myeloid leukaemia. Br J Haematol 2006. Byrd, J. C., K. Mrozek, et al. (2002). "Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of induction success, cumulative incidence of relapse, and overall survival in adult patients 6(11)
with de novo acute myeloid leukemia: results from Cancer and Leukemia Group B (CALGB 8461)." Blood 100(13): 4325-36. Campana D, Coustan-Smith E. Minimal residual disease studies by flow cytometry in acute leukemia. Acta Haematol. 2004;112(1-2):8-15. Dohner K, Tobis K, Ulrich R, Frohling S, Benner A, Schlenk RF, et al. Prognostic significance of partial tandem duplications of the MLL gene in adult patients 16 to 60 years old with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics: a study of the Acute Myeloid Leukemia Study Group Ulm. J Clin Oncol 2002;20(15):3254-61. Drexler, H. G. and H. Quentmeier (2004). "FLT3: receptor and ligand." Growth Factors 22(2): 71-3. Dutcher, J. P., C. A. Schiffer, et al. (1987). "Hyperleukocytosis in adult acute nonlymphocytic leukemia: impact on remission rate and duration, and survival." J Clin Oncol 5(9): 1364-72. Falini B, Mecucci C, Tiacci E, Alcalay M, Rosati R, Pasqualucci L, et al. Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype. N Engl J Med 2005;352(3):254-66. Ferrara, F., S. Palmieri, et al. (2004). "Prognostic factors and therapeutic options for relapsed or refractory acute myeloid leukemia." Haematologica 89(8): 998-1008. Fonatsch C, Gudat H, Lengfelder E, Wandt H, Silling-Engelhardt G, Ludwig WD, Thiel E, Freund M, Bodenstein H Schweider G, et al. Correlation of cytogenetic findings with clinical features in 18 patients with inv(3)(q21q26) or t(3;3)(q21;q26). Leukemia. 1994 Aug;8(8):1318-26. Frohling, S., R. F. Schlenk, et al. (2004). "CEBPA mutations in younger adults with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics: prognostic relevance and analysis of cooperating mutations." J Clin Oncol 22(4): 624-33. 7(11)
Grier D. G., A. Thompson, et al. (2005). "The pathophysiology of HOX genes and their role in cancer." J Pathol 205(2): 154-71 Grimwade, D., H. Walker, et al. (1998). "The importance of diagnostic cytogenetics on outcome in AML:analysis of 1,612 patients entered into the MRC AML 10 trial. The Medical Research Council Adult and Children's Leukaemia Working Parties." Blood 92(7): 2322-33. Hardling M, Wei Y, Palmqvist L, Swolin B, Stockelberg D, Gustavsson B, Ekeland-Sjöberg K, Wadenvik H, Ricksten A. Serial monitoring of BCR-ABL transcripts in Chronic Myelougenous leukaemia (CML) treated with Imatinibe Mesylate. Medical oncology. 2004 (21)4:349-358 Kottaridis, P. D., R. E. Gale, et al. (2001). "The presence of a FLT3 internal tandem duplication in patients with acute myeloid leukemia (AML) adds important prognostic information to cytogenetic risk group and response to the first cycle of chemotherapy: analysis of 854 patients from the United Kingdom Medical Research Council AML 10 and 12 trials." Blood 98(6): 1752-9. Leone, G., L. Mele, et al. (1999). "The incidence of secondary leukemias." Haematologica 84(10): 937-45. Lowenberg B, Griffin JD, Tallman MS. Acute myeloid leukemia and acute promyelocytic leukemia. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2003;:82-101. Luik E, Palk K, Everaus H, Varik M, Aareleid T, Wennstrom L, Juntikka EL, Safai-Kutti S, Stockelberg D, Holmberg E, Kutti J. The incidence and survival of acute de novo leukaemias in Estonia and in a well-defined region of western Sweden during 1982-1996: a survey of patients aged > or =65 years. J Intern Med. 2004 Jul;256(1):79-85. Marlton, P., M. Keating, et al. (1995). "Cytogenetic and clinical correlates in AML patients with abnormalities of chromosome 16." Leukemia 9(6): 965-71. 8(11)
Mistry, A. R., E. W. Pedersen, et al. (2003). "The molecular pathogenesis of acute promyelocytic leukaemia: implications for the clinical management of the disease." Blood Rev 17(2): 71-97. Mrozek, K., N. A. Heerema, et al. (2004). "Cytogenetics in acute leukemia." Blood Rev 18(2): 115-36. Nationell registrering av akut leukemi hos vuxna, Sv Akut Leukemiregistret, rapport nr 3, 2004. Palmqvist, L., N. Pineault, et al. (2004). "Redundant leukemogenicity of NUP98-HOX fusion genes in primary murine bone marrow cells correlates with gene expression changes consistent with common key target genes." Exp Hematol Suppl 1 32(7): 33 Palmqvist, L., B. Argiropoulos, et al. (2006). "The Flt3 receptor tyrosine kinase collaborates with NUP98-HOX fusions in Acute Myeloid Leukemia." Blood 108(3): 1030-6. Porcu, P., L. D. Cripe, et al. (2000). "Hyperleukocytic leukemias and leukostasis: a review of pathophysiology, clinical presentation and management." Leuk Lymphoma 39(1-2): 1-18. Sauvageau, G., P. M. Lansdorp, et al. (1994). "Differential expression of homeobox genes in functionally distinct CD34+ subpopulations of human bone marrow cells." Proc Natl Acad Sci U S A 91(25): 12223-7. Schnittger S, Schoch C, Kern W, Mecucci C, Tschulik C, Martelli MF, et al. Nucleophosmin gene mutations are predictors of favorable prognosis in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype. Blood 2005;106(12):3733-9. Schoch, C., W. Kern, et al. (2005). "Acute myeloid leukemia with a complex aberrant karyotype is a distinct biological entity characterized by genomic imbalances and a specific gene expression profile." Genes Chromosomes Cancer 43(3): 227-38. Smith M, Barnett M, Bassan R, Gatta G, Tondini C, Kern W. Adult acute myeloid leukaemia. Crit Rev Oncol Hematol. 2004 Jun;50(3):197-222 9(11)
Slovak, M. L., K. J. Kopecky, et al. (2000). "Karyotypic analysis predicts outcome of preremission and postremission therapy in adult acute myeloid leukemia: a Southwest Oncology Group/Eastern Cooperative Oncology Group Study." Blood 96(13): 4075-83. Thomas X, Boiron JM, Huguet F, Dombret H, Bradstock K, Vey N, Kovacsovics T, Delannoy A, Fegueux N, Fenaux P, Stamatoullas A, Vernant JP, Tournilhac O, Buzyn A, Reman O, Charrin C, Boucheix C, Gabert J, Lheritier V, Fiere D. Outcome of Treatment in Adults With Acute Lymphoblastic Leukemia: Analysis of the LALA-94 Trial. J Clin Oncol. 2004 Sep 7 Van der Velden VH, Hochhaus A, Cazzaniga G, Szczepanski T, Gabert J, van Dongen JJ. Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects. Leukemia. 2003 Jun;17(6):1013-34. van Oostveen, J., J. Bijl, et al. (1999). "The role of homeobox genes in normal hematopoiesis and hematological malignancies." Leukemia 13(11): 1675-90 Wennstrom L, Juntikka EL, Safai-Kutti S, Stockelberg D, Holmberg E, Luik E, Everaus H, Palk K, Varik M, Aareleid T, Kutti J. The incidence and survival of acute de novo leukaemias in Estonia and in a well defined region of Western Sweden during 1982-1996: a survey of patients aged 16-64 years. Leuk Lymphoma. 2004 May;45(5):915-21. Wheatley, K., A. K. Burnett, et al. (1999). "A simple, robust, validated and highly predictive index for the determination of risk-directed therapy in acute myeloid leukaemia derived from the MRC AML 10 trial. United Kingdom Medical Research Council's Adult and Childhood Leukaemia Working Parties." Br J Haematol 107(1): 69-79. Wei Y, Hardling M, Olsson B, Ricksten A, Stockelberg D, Wadenvik H. Not all imatinib resistance in CML are BCR-ABL kinase domain mutations. Ann Hematol, in press Wei Y, Stockelberg D, Hullberg S, Ricksten A, Wadenvik H. Changes in expression of apoptosis-related genes are linked to the molecular response to imatinib treatment in chronicphase chronic myeloid leukaemia patients Acta Haem, in press 10(11)
Yanada, M., K. Matsuo, et al. (2005). "Prognostic significance of FLT3 internal tandem duplication and tyrosine kinase domain mutations for acute myeloid leukemia: a meta-analysis." Leukemia 19(8): 1345-9. 11(11)