F -2' -P 0 Ltitkål..-.Z- WEI WIE 0 2 In (12) Patentskrift ( ":./._ gal,.,7 (21) Patentansökningsnummer: 0602550-6 M E s>>.--).5 (45) Patent meddelat: 2009-11-24 k, -Cl\ v d. 5..") (41) Ansökan allmänt tillgänglig: 2008-05-29 (22) Patentansökan inkom: 2006-11-28 (24) Löpdag: 2006-11-28 Sverige (83) Deposition av mikroorganism: (30) Prioritetsuppgifter: --- 10 ) SE 532 251 C2 (51) Internationell klass: A61K 39/385 (2006.01) A61K 38/19 (2006.01) CO7K 14/52 (2006.01) (73) Patenthavare: Theravac Pharmaceuticals AB, Vårdkasvägen 1, 756 55 Uppsala SE (72) Uppfinnare: Lars Hellman, Uppsala SE (74) Ombud: (54) Benämning: Nya formuleringar av TSLP för behandling av TH2-medierade inflammatoriska sjukdomar genom vaccinering (56) Anförda publikationer: US 20050249712 Al WO 2005007186 Al US 20020193305 Al Zagury D. et al. Anti-cytokine Ab immune therapy: present status and perspectives. Drug Discovery Today 2004, 9 (2): 72-81 Barnes P.J. New therapies for asthma. TRENDS in molecular medicine 2006, 12 (11): 515-520 (47) Sammandrag: Uppfinningen relaterar till en formulering för behandlingen av TH2-medierade inflammatoriska sjukdomar. Formuleringen består av ett vaccin innehållande TSLP från en icke-human primat eller ett fragment därav för användande som ett vaccin för behandling av människor med alltför kraftiga TH2-medierade inflammatoriska tillstånd. För behandling av kraftiga TH2-medierade inflammatoriska tillstånd i andra icke-humana däggdjur så används TSLP från den art som skall vaccineras som anti gen.
532 25'l Sammanfattning Uppfinningen relaterar till en formulering för behandlingen av TH2-medierade inflammatoriska sjukdomar. Formuleringen består av ett vaccin innehållande TSLP från en icke-human primat eller ett fragment därav för användande som ett vaccin för behandling av människor med alltför kraftiga TH2-medierade inflammatoriska tillstånd. För behandling av kraftiga TH2-medierade inflammatoriska tillstånd i andra icke-humana däggdjur så används TSLP från den art som skall vaccineras som antigen.
1 Denna uppfinning relaterar till en metod utvecklad för att mildra symptomen eller förhindra uppkomsten av olika TH2-medierade inflammatoriska sjukdomar genom att sänka nivåerna av cytokinen TSLP (Thymic stromal lymphopoetin). Även om uppfinningen generellt relaterar till ett vaccin för användning i människa, hund, katt eller häst så kommer en mer generell beskrivning att ges men med referens till antikroppar eller vaccin för användning i människa, katt, häst eller hund. Bakgrund till uppfinningen Under de senaste årtiondena har flera sjukdomar orsakade av överreaktioner av vårt immunsystem kommit att bli de största utmaningarna för vår tids medicin. Ett sådant områden är allergier. Allergier har i människa har under de senaste 20-30 åren nått nära epidemiska nivåer och atopiska eller IgE-medierade allergier är här den dominerande formen. Allergier är också ett stort problem för många av våra husdjur som hundar, katter och hästar. Här är dock IgEs roll mindre väl dokumenterad. Vanliga former av IgE-medierade allergier i människa är päls-, dammkvalster- och insektsgifts-allergier samt hösnuva, astma och många födoämnesallergier. Många av våra husdjur lider av allergier mot många av dessa eller liknande allergener. Allergier har beräknats omfatta nästan 30% av befolkningen. Allergier är orsakade av överreaktion av vårt immunsystem. Flera av de cytokiner som reglerar en normal immunrespons mot olika patogener tycks också delta i allergiska sjukdomstillstånd. Cytokiner eller tillväxt och differentieringsfaktorer som är centrala för vårt immunsystems funktion kan därför vara viktiga målmolekyler för terapeutisk intervention. Svår atopisk dermatit i hund är ett av de större veterinärmedicinska problemen av idag. Uppemot 50% av alla besök hos veterinär är orsakade av hudproblem hos hunden och atopisk dermatit är här den absolut dominerande orsaken till dessa problem. Vi har en liknande situation inom humanmedicinen. Här är det dock svår atopisk astma som är problemet. För många av patienterna med svår astma finns idag ingen behandling som uppvisar tillfredställande effekt. För vissa av de svårare fallen av atopisk dermatit finns idag heller ingen tillfredställande behandling och som sista utväg återstår då endast avlivning. Vi har här alltså ett stort behov inom medicin och veterinärmedicin som ej kan mötas med existerande behandlingsformer. Vi har under ett antal år arbetat med en potentiell behandlingsform för behandling av IgE-medierade allergier i människa och husdjur, vaccination mot IgE (1-5). Denna behandlingsstrategi har dock några viktiga begränsningar som t.ex i fallet med atopisk dermatit i hund där IgE nivåerna är mycket höga (6). Denna begränsning beror främst på en stark toleriserande effekt av de höga IgE-nivåerna i hund. Dessutom så är det svårt att uppnå goda behandlingseffekter när det är så stora mängder av målmolekylen som måste avlägsnas. Vi har därför insett att det kommer att vara mycket svårt att nå vårt mål i hund genom att vaccinera mot IgE (6). Nya innovativa strategier måste därför utvecklas. Vi presenterar här en möjlig lösning på detta problem, vaccination mot en viktig tillväxtfaktor som reglerar humoral immunitet thymic stromal lymphopoietin (TSLP). TSLP (thymic stromal lymphopoietin) har besrivits som varande en **master switch" i allergisk inflammation [7]. TSLP är en IL-7 liknande tillväxtfaktor som i
människa främst produceras av epiteliala celler och mastceller. Denna tillväxtfaktor stimulerar myeloida dendritiska celler (mdc) att inducera differentiering av naiva CD4 positiva T celler till effektorceller av TH2 typ [7]. Dessa TH2 celler producerar sedan de allergi drivande tillväxtfaktorerna IL-4, IL-5, IL-13 och TNF-a, men inte IL- 10 och IFN-y [8]. Nya fynd indikerar också att TSLP aktiverade DCs spelar en viktig roll inte enbart i induktionen av TH2 immunitet utan också i upprätthållande och ytterligare polarisering av centrala minnesceller av TH2 typ under allergiska sjukdomar [9]. Keratinocyter i den skadade vävnaden i atopisk dermatit har visats uttrycka höga nivåer av TSLP, som kan vara en av de tillväxtfaktorer som spelar en nyckelroll i utvecklandet av atopisk dermatit [8]. Möss genförändrade för att överuttrycka TSLP i hud utvecklar in också atopisk dermatit och man ser en dramatisk ökning i antalet cirkulerande TH2 celler och en ökning i serum IgE [10]. TSLP är dock inte enbart uttryckt i perifer vävnad utan även i den humana thymusen i "Hassall' s corpuscles ". I Denna vävnad är TSLP inblandad i att instruera dendritiska celler till att konvertera hög affinitets själv-reaktiva T-celler till CD4+CD25+ FoxP3+ regulatoriska T celler. Den heterodimera TSLP receptorn tycks vara uttryckt uteslutande på myeloda dendritiska celler (mdcs). TSLP verkar vara en av de viktigaste reglerarea av TH2-medierad inflammation och är därför en mycket intressant målmolekyl för terapeutisk intervention [11]. Jag kommer här att beskriva en vaccinationsmetod som är ämnad att nedreglera alltför kraftig TH2-medierad inflammation genom att rikta vaccinets effekt mot TSLP. Detta vaccin kan komma att bli ett nytt viktigt steg i behandlingen av svår astma i människa och atopisk dermatit i hund. Vad som tidigare var känt inom fältet Trior Art". Patentansökningar som beskriver användningen av monoklonala antikroppar eller lösliga receptorer för att reducera aktiviteten av humant TSLP är inlämnade. Dessa strategier för att målsöka TSLP är baserade på injektionen av högrenade rekombinanta proteiner var annan till var fjärde vecka under resten av patientens liv. Ett vaccin som beskrivs i denna patentansökan kan här komma att bli en avsevärd förbättring över tidigare känd teknik (prior art) p.g.a. att den bygger på injektion av rekombinanta proteiner i mycket mindre mängd, kanske så lite som en 10 000 del av vad som behövs vid behandling med monoklonala antikroppar eller lösliga receptorer. Ett vaccin kommer troligtvis även att behöva administreras 2-4 gånger om året i jämförelse med de mycket mer frekventa administreringarna av monoklonaler och lösliga receptorer som beskrivits här ovan. Användandet av sekvensen från en ickehuman primat kan också leda till att immunogeniciteten ökar för vaccinet i människa. För andra applikationer än vaccin måste det icke modifierad TSLP användas (det humana proteinet) för att inte ge upphov till en immunreaktion mot proteinet vilket skulle avsevärt minska effekten av det injicerade rekombinanta proteinet. Uppfinningens mål Målet med uppfinningen är att kunna erbjuda en lätt och kostnadseffektiv metod för behandling av olika inflammatoriska sjukdomar orsakade av överdriven TH2- medierad. Vaccination med ett fusionsprotein bestående av TSLP (eller delar av denna cytokin) och ett främmande bärarprotein för att minska nivåerna av fritt TSLP
och därmed mildra symptomen som orsakats av förhöjd frisättning av denna tillväxtfaktor. Sammanfattning av uppfinningen Målet som beskrivits ovan uppnås enligt uppfinningen med hjälp av ett vaccin som karaktäriseras av att det innehåller hela aminosyrasekvensen eller segment större än 5 aminosyror av TSLP från en icke-human primat (om den skall användas för människa) i dess ursprungliga eller multimeriserade form. Vid behandling av domesticerade djur används istället TSLP sekvensen från det djur som skall behandlas Proteinet kan kopplas till ett eller flera bärarprotein och kan även innehålla ett adjuvans. Den TSLP molekyl som används som vaccinantigen kan alternativt vara muterad med en eller flera punktmutationer som förhindrar dess bindning till sin receptor. Proteinet kommer då inte att ha TSLP aktivitet men fortfarande behålla sin förmåga att inducera antikroppar som också reagerar med nativt aktivt TSLP. Kortfattad beskrivning av figurerna Figur 1 visar nukleotid och den motsvarande aminosyra sekvensen för schimpansens TSLP. Beskrivning av uppfinningen Anti-TSLP antikroppar produceras i patienten genom aktiv immunisering, vilket även kallas vaccination. Genom att injicera en modifierad TSLP molekyl så börjar patientens immunsystem att producera ett polyklonalt antikroppssvar riktad mot dess eget TSLP och reducerar därmed effekterna av en för kraftig TSLP produktion. Det är av största vikt att modifiera antigenet så att patientens immunsystem uppfattar vaccinantigenet som ett främmande protein. Detta kan åstadkommas genom kovalent koppling av ett främmande (icke själv) protein eller del av protein till hela eller delar av TSLP från den art som skall behandlas. Peptidregioner inom det främmande, icke kroppsegna proteinet drar då till sig och aktiverar icke toleriserade T celler som kan ge hjälp till potentiellt autoreaktiva B-celler. Det finns minst fyra olika sätt att göra denna modifiering av självproteinet. En metod är att producera vaccinantigenet som ett fusionsprotein mellan ett främmande protein och hela eller en utvald del på mer än 5 aminosyror i längd av själv-tslp i ett prokaryot eller eukaryot expressions system. Den öppna läsramen för TSLP, t.ex. hund eller schimpans TSLP som kan ses i figur 1 klonas först in i bakteriell, svamp eller eukaryot fusionsproteinvektor. Denna vektorkonstruktion transfekteras sedan in i en eukaryot eller prokaryot värdcell (beroende på vald vektor) för produktion av det önskade fusionsproteinet. Denna fusionspartner kan här vara vilket för kroppen främmande protein som helst av en storlek från 10 aminosyror till flera hundra kd. Det är dock vanligen bäst att använda en fusionspartner av liknande storlek som självproteinet. Alternativt kan en immunodominant peptid sättas in i den valda TSLP sekvensen vilket resulterar i ett fusionsprotein med själv TSLP sekvenser på båda sidor om den främmande peptiden. Som ett tredje alternativ kan det icke modifierade TSLP produceras i en eukaryots eller prokaryot värd eller värdcell och sedan kovalent kopplas till ett bärarprotein genom kemisk koppling.
/11 Det fjärde alternativet som i vår mening är mindre fördelaktigt är att producera en utvald del av TSLPs aminosyrasekvens som en syntetisk peptid och sedan koppla denna peptid till ett främmande bärarprotein genom kemisk koppling. Detta alternativ resulterar normalt, efter injektion i patienten, i antikroppssvar som uppvisar låg bindningsaktivitet mot nativt rätt veckat protein vilket därmed ger sämre klinisk effekt. Efter produktion av vaccinantigenet skall det sedan testas för pyrogeninnehåll och möjligt innehåll av andra kontaminerande ämnen. För att erhålla ett tillräckligt starkt immunsvar mot självproteinet kan det blandas med en immunstimulerande substans, ett adjuvans före injektion i patienten. Efter injektion i patienten induceras vaccinet ett immunsvar mot vaccinantigenet. På grund av närvaron av självepitoper i vaccinantigenet så inducerar detta protein ett antikroppssvar mot denna målmolekyl, i detta fall TSLP, vilket leder till en sänkning av nivåerna av detta protein i patienten. Referenser [1] Hellman L. Profound reduction in allergen sensitivity following treatment with a novel allergy vaccine. Eur J Immunol 1994;24(2):415-20. [2] Hellman L. Is vaccination against IgE possible? Adv Exp Med Biol 1996;409:337-42. [3] Hellman L, Carlsson M. Allergy vaccines: A review of developments. Clin Immunotherapeutics 1996;6(2):130-42. [4] Hellman L. Vaccines against allergies. In: Perlmann P, Wigzell H, editors. Handbook of Experimental Pharmacology, Vo1133, Vaccines. Berlin, Springer- Verlag, 1999: 499-526. [5] Vernersson M, Ledin A, Johansson J, Hellman L. Generation of therapeutic antibody responses against IgE through vaccination. Faseb J 2002;16(8):875-7. [6] Ledin A, Bergvall K, Salmon-Hillbertz N, Hansson H, Andersson G, Hedhammar Å, et al. Generation of therapeutic antibody responses against IgE in dogs, an animal species with exceptionally high plasma IgE levels. Vaccine 2006;24, 66-74. [7] Liu YJ. Thymic stromal lymphopoietin: master switch for allergic inflammation. J Exp Med 2006;203(2):269-73. [8] Soumelis V, Reche PA, Kanzler H, Yuan W, Edward G, Homey B, et al. Human epithelial cells trigger dendritic cell mediated allergic inflammation by producing TSLP. Nat Immunol 2002;3(7):673-80. [9] Wang YH, Ito T, Wang YH, Homey B, Watanabe N, Martin R, et al. Maintenance and polarization of human TH2 central memory T cells by thymic stromal lymphopoietin-activated dendritic cells. Immunity 2006;24(6):827-38. [10] Yoo J, Omori M, Gyarmati D, Zhou B, Aye T, Brewer A, et al. Spontaneous atopic dermatitis in mice expressing an inducible thymic stromal lymphopoietin transgene specifically in the skin. J Exp Med 2005;202(4):541-9. [11] Huston DP, Liu YJ. Thymic stromal lymphopoietin:a potential therapeutic target for allergy and asthma. Curr Allergy Asthma Rep 2006;6(5):372-6.
Patentkrav 1. Vaccin innehållande TSLP eller ett fragment därav i dess ursprungliga eller multimeriserade form kopplad till en icke kroppsegen bärarmolekyl som företrädesvis administreras tillsammans med ett farmakologiskt accepterbart adjuvant. 2. Vaccin enligt patentkrav 1 där TSLP är från en icke human primat, hund, katt eller häst. 3. Vaccin mot TSLP enligt patentkrav 1 och 2 för behandling av allergi, astma och andra inflammatoriska tillstånd. 4. Användning av ett fusionsprotein innehållande hela eller delar av TSLP från den art som skall behandlas (eller en nära besläktad art) kopplat till ett främmande bärarprotein för framställning av ett vaccin för behandling av allergi, astma eller andra inflammatoriska tillstånd.
Figur 1. Schimpans TSLP cdna ATGTTCCCTTTTGCCTTACTATATGTTCTGTCAGTTTCTTTCAGGAAAATCTT CATCTTACAACTTGTAGGGCTGGTGTTAACTTACGACTTCACTAACTGTGACT TTGAGAAGATTAAAGCAGCCTATCTCAGTACTATTTCTAAAGACCTGATTACA TATATGAGTGGGACCAAAAGTACCGAGTTCAACAACACCGTCTCTTGTAGCAA TCGGCCACATTGCCTTACTGAAATCCAGAGCCTAACCTTCAATCCCACCGCCG GCTGCGCGTCGCTCGCCAAAGAAATGTTCGCCATGAAAACTAAGGCTGCCT TA ACTATCTGGTGCCCAGGCTATTCGGAAACTCAGATAAATGCTACTCAGGCAAT GAAGAAGAGGAGAAAAAGGAAAGTCACAACCAATAAATGTCTGGAACAAGTGT CACAATTACAAGGATTGTGGCGTCGCTTCAATCGACCTTTACTGAAACAACAG TAAACCATCTTTATTATGGTCATATTTCACAGCACCAAAATAAATCATCTTTA TTAAGTAGATGAAACATTAACTCTAACTGTGACAAAGAAGACCACAGATAGTT ATCTTTTAATTACAGAAGAGTTTCTTAACTTATTTTTGTAAGTTTTTATTGTG TAAGTTTATAATGCAGGGGAAGTACTACTCCTCAAATGTTGAGGGAAGCTTCC ATAACATCGATGACTGACTTCATGGCAGTAATTCTCAGCTGTAGTTGCATAAG CATTGCTCAAGAGGAAAATCCAAAAGTGCAGCAGG (kodande regionen av accession no XM_001141816) Aminosyrasekvensen MFPFALLYVLSVSERKIFILQLVGLVLTYDETNCDFEKIKAAYLSTISKDLITYmSG TKSTEFNNTVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKTKAALTIWCPGYS ETQINATQAMKKRRKRKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQ